金および銀ナノ粒子のグリーン合成のためのPlatycodiRadix（Platycodon grandiflorum）からのPlatycodonサポニン

背景

持続可能性の問題が増えるにつれ、グリーンケミストリーは多くの研究分野で焦点を当ててきました。金属ナノ粒子（MNP）の合成における天然物の使用は、これらの方法の持続可能性のためにかなりの関心を集めています。 MNPは、材料化学、生物学、および医学において多様な用途を示しています[1,2,3,4]。 MNPは通常、金属イオン還元反応による化学的方法で合成されます。化学還元反応では、通常、MNPを合成するために、水素化ホウ素ナトリウムなどの有毒で有毒な化学物質が必要です。現在、天然物は有害な化学物質の使用に取って代わり、次の利点を発揮することができます。（i）合成プロセスは有害な化学物質の廃棄物を減らします。 （ii）グリーン合成戦略は、私たちの健康と地球環境を保護します。 （iii）戦略は全体的な持続可能なイニシアチブを満たします。 （iv）両方の材料（天然物とMNP）を組み合わせることによる相乗作用は、生体適合性の向上とともに期待できます。これは、invitroおよびinvivoシステムに非常に有益です。 （v）戦略は費用効果が高く、スケールアップに適しています。そして最後に、（vi）グリーン合成プロセスはワンポット反応で実行できます。

AuNPは、触媒作用、薬物送達、化学的および生物学的センシング、イメージング、光熱療法、および光線力学療法の分野で広く適用されています[1、5、6、7、8]。さまざまな用途の中で、化学反応の触媒としての用途は徐々に成長している分野です。 AuNPの新しい触媒用途を探求するために、過剰な水素化ホウ素ナトリウムの存在下で4-ニトロフェノール（4-NP）を4-アミノフェノール（4-AP）に還元するモデル反応が一般的に使用されます。モデル反応として4-NPから4-APへの還元反応を使用する理由の1つは、反応の進行をUV-可視分光光度法で直接追跡できることです。最終生成物（すなわち、4-AP）の精製と同定がなければ、反応混合物の吸光度変化の観察は、反応の進行を十分に示します。 AgNPは強力な抗菌活性を持っていると報告されています。特に、AgNPの高い表面積対体積比は、それらのバルク対応物と比較した場合、抗菌活性を発揮するのに有益です。軟膏、クリーム、およびゲルの形のAgNPは、火傷の治療に適用されています[9]。

アミノ酸、ペプチド、真菌、バクテリア、植物抽出物、藻類、多糖類、酵母などの多様な天然物は、グリーン合成に役立つように適合されています[10、11]。植物抽出物は、AuNPおよびAgNPの合成のための緑の還元剤として効果的に適用されています[11、12]。多様な植物抽出物の中で、生物学的および薬理学的活性を持つ伝統的な漢方薬（TCM）は、MNPのグリーン合成において非常に魅力的です。

現在のレポートでは、Platycodi Radix（ Platycodon grandiflorum ）からのplatycodonサポニン 、キキョウ科）はAuNPsとAgNPsの合成に利用されました。 TCMとしてのPlatycodiRadixの薬理学的活性には、鎮咳および鎮咳、免疫賦活、抗炎症、抗酸化、抗腫瘍、抗糖尿病、抗肥満、肝保護、鎮痛、認知増強、抗コリン作用、および抗ヒスタミン作用が含まれます[13]。 Platycodi Radixの化学成分には、炭水化物、タンパク質、脂質、およびトリテルペノイドサポニンが含まれていることが知られています[14]。トリテルペノイドサポニンは、いくつかのヒドロキシル基とグリコシル基を持つ30個の炭素の4環または5環構成に配置された化合物の大きなグループに属し、分子の一端が親水性で、他端が疎水性になります[15]。キキョウサポニンのアグリコンは、2つの側鎖を持つオレアナン型トリテルペンです。グルコース単位はエーテル結合を介してトリテルペンのC-3位置に結合し、多様なグリコシル基はC-28位置のエステル結合を介して結合します。共役グリコシル基は、D-グルコース、D-ラムノース、D-アラビノース、D-キシロース、およびD-アピオースで構成されています[16]。キキョウサポニンの中で、キキョウD（PD、図1）はキキョウ基数のマーカー化合物の1つです。 PDはトリテルペノイドサポニンの主成分の1つですが、Platycodi Radixの総サポニン含有量は約2％です。したがって、プラチコシドEおよびプラチコジンD3からプラチコジンDへの酵素的変換を開発し、Platycodi Radixの水性抽出物からPDに富む画分を得ることに成功しました[16、17]。

プラチコジンDの構造

本報告では、PDに富む画分をAuNPおよびAgNP（以下、PD-AuNPおよびPD-AgNPと呼ぶ）を合成するためのグリーン還元剤として使用しました。合成の反応の進行と各ナノ粒子サンプルの表面プラズモン共鳴（SPR）の後に、UV-可視分光光度法を行いました。サイズと形態は、高分解能透過型電子顕微鏡（HR-TEM）や原子間力顕微鏡（AFM）などの顕微鏡法で観察されました。高分解能X線回折（HR-XRD）パターンが得られ、結晶構造が明らかになりました。フーリエ変換赤外（FT-IR）スペクトルを取得して、両方のナノ粒子の合成に関与する官能基を解明しました。 PD-AuNPの触媒活性は、過剰な水素化ホウ素ナトリウムの存在下での4-NPから4-APへの還元反応で評価されました。さらに、AFM高さ画像からナノスケールの形状を正確に特定するために、表面の形状を強化できる曲率依存の進化スキームを開発しました[18]。主曲率フローを使用した表面進化方程式は、対応する主方向のAFM画像を滑らかにして強調します。主曲率は、離散AFM高さデータの1次および2次導関数から直接計算されます。 Lu etal。曲率流が形態学的特徴に及ぼす影響を研究し、平均曲率流が不要な新しい形態学的特徴を作成する可能性がある一方で、主曲率流の下では特徴点が作成されないことを示しました[19]。

メソッド/実験

材料と器具

Platycodi Radixの水性抽出物からのPD濃縮画分は、以前のレポート[16、17]に従って酵素変換によって調製されました。ヒドロクロロ金酸三水和物（HAuCl ₄ ・3H ₂ O）、硝酸銀、水素化ホウ素ナトリウム、および4-ニトロフェノールは、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手しました。ナノ粒子のSPRと4-NP還元反応の進行に続いて、島津UV-2600（島津製作所、京都、日本）が続きました。 300 kVで動作するJEM-3010機器を使用して、HR-TEM画像を取得し、製品のサイズと形態を調査しました（JEOL、東京、日本）。 HR-TEM画像を取得するために、カーボンコーティングされた銅グリッド（カーボンタイプB、300メッシュ）をTed Pella（Redding、CA、USA）から購入しました。タッピングモードで動作するDimension®Icon®機器を使用して、AFM画像を取得しました（Bruker Nano、米国カリフォルニア州サンタバーバラ）。サンプルローディング用に、マイカ（グレードV-1、長さ25mm×25mm、厚さ0.15 mm）は、構造プローブのSPIサプライ部門（米国ペンシルベニア州ウエストチェスター）から入手しました。プレミアム高解像度タッピングモードシリコンプローブ（RTESP AFMプローブ、MPP-11100-10）は、Bruker Nano（Santa Barbara、CA、USA）から購入しました。結晶構造を解明するために、CuKα放射線源（λ=0.154056 nm）を備えたBruker D8 Discover高解像度X線回折計を使用しました（Bruker、カールスルーエ、ドイツ）。 HR-XRDパターンは20°から90°（2θスケール）の範囲で取得されました。 KBrペレットは、波数範囲400〜4000 cm ^-1 のNicolet6700分光計でFT-IRスペクトルを取得するために準備されました。 （Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）。 HR-XRDおよびFT-IR分析では、FD5505凍結乾燥機を操作して粉末サンプルを調製しました（Il Shin Bio、ソウル、韓国）。

PD-AuNPおよびPD-AgNPのグリーン合成

PD-AuNPの1mLサンプルは、PD濃縮画分（0.05％）とHAuCl ₄ の最終濃度で合成されました。 ・3H ₂ O（0.2 mM）。反応混合物を周囲温度で5分間インキュベートしました。 PD-AgNPの1mLサンプルは、PD濃縮画分（0.01％）とAgNO ₃ の最終濃度で合成されました。 （0.8 mM）。反応混合物を80℃のオーブンで3時間インキュベートし、さらに周囲温度で21時間インキュベートしました。紫外可視スペクトルは、300〜700nmの範囲で取得されました。

サイズを正確に測定するための拡張AFM画像の曲率依存の進化

次の平均曲率流方程式を実験的なAFM高さデータと一緒に使用して、サイズを正確に測定し、ナノ粒子の数を効果的にカウントしました。

\（{\ Phi} _ {、t} \ left（x、y、t \ right）=\ beta \ sqrt {1 + {\ Phi} _ {、x} ^ 2 + {\ Phi} _ {、y } ^ 2 =\ beta \ left | \ nabla \ Phi \ right |} \）、ここでサーフェス S ={（ x 、 y 、 z ）： z =Φ（ x 、 y 、 z ）}。

βの場合 主曲率に依存するように選択された場合、この進化プロセスは「曲率流」と呼ばれます。 。」 βの場合 主曲率の1つとしてが選択されている場合、対応するフローはκと呼ばれます。 _i フロー（ i =1,2）。主曲率の流れにより、画像は対応する主方向に滑らかになります。

PD-AuNPの触媒活性

触媒活性については、PD-AuNPを次のように合成しました。PD濃縮画分（0.1％、500μL）を脱イオン水（480μL）と混合した後、HAuCl ₄ を添加しました。 ・3H ₂ O（10 mM、20μL）。反応混合物を10秒間ボルテックスし、暗所で周囲温度で24時間インキュベートしました。 PD-AuNPの触媒活性は、水系で過剰な水素化ホウ素ナトリウムの存在下で4-NPから4-APへの還元反応を使用して評価されました。 4-NP溶液（900 µL、0.5 mM）を脱イオン水（650 µL）と混合しました。この溶液に、新たに調製した水素化ホウ素ナトリウム（1.65 mL、10 mM）を加えました。次に、新たに合成されたPD-AuNP（800μL）が追加されました。反応混合物の最終濃度は、触媒活性について次のとおりでした：4-NP（0.113 mM、1当量）、水素化ホウ素ナトリウム（4.13 mM、36.5当量）、およびPD-AuNP（0.04 mM、0.354当量）。 。反応の進行は、周囲温度で200〜700nmの範囲のUV-可視分光光度法で720秒間監視されました。

結果と考察

PD-AuNPおよびPD-AgNPのグリーン合成

まず、AuNPとAgNPの合成では、反応の完了は、溶液の目に見える色の変化によって簡単に決定されました。 PD-AuNPの色は、536 nmのSPRを備えたワインパープルでした（図2a）。黄色を示したPD-AgNPのSPRは、427 nmで観察されました（図2b）。図2のデジタル写真は、前のセクションで説明した手順に従って合成されたPD-AuNP（左、a）とPD-AgNP（右、b）のソリューションを示しています。これらの色の変化は、ナノ粒子内の伝導電子の振動周波数を入射放射線の周波数に一致させます。したがって、UV-可視スペクトルは、AuNPおよびAgNPとそれらの特徴的なSPRバンドの反応完了を決定するのに十分な情報を提供します。図2に示すUV-可視スペクトルから、PDに富む画分は、両方のナノ粒子を生成する還元剤としての役割を果たしました。

UV-可視スペクトル。 a PD-AuNPsと b PD-AgNPs

HR-TEM画像

ナノ粒子の可視化は、サイズ、形態、分散状態などの重要な情報を特定するための重要なステップです。図3に示すように、PD-AuNPは、平均直径14.94±2.14nmの球形でした。 PD-AuNPは、球形のものと同様に、小さな三角形やその他の多角形も観察されました。球形の平均直径は、HR-TEM画像からの103個の個別のナノ粒子から測定されました。サイズ分布のガウスヒストグラムは、図3dのように観察されました。最も頻繁に観察されたPD-AuNPのサイズは、14〜15nmの範囲でした。図3aに示すように、PD-AuNPは凝集することなく十分に分散しており、PDに富む画分がキャッピング剤（または安定剤）としても機能したことを示唆しています。球形のPD-AgNPも図4で観察されました。PD-AuNPの分散状態と同様に、PD-AgNPの分散状態は優れており、平均直径は18.40±3.20 nmでした（図4d）。平均直径を得るために、HR-TEM画像から100個の個別のナノ粒子をランダムに選択しました。最も頻繁に観察されたPD-AgNPのサイズは、17〜18nmの範囲でした。

a – c HR-TEM画像と d PD-AuNPのサイズヒストグラム。スケールバーは a を表します 100 nm、 b 10 nm、および c 5 nm

a–c HR-TEM画像と d PD-AgNPのサイズヒストグラム。スケールバーは a を表します 100 nm、 b 20 nm、および c 5 nm

AFM画像

AFM画像は、前のセクションで説明したHR-TEM画像とよく一致しました。 PD-AuNPの球状の形態が図5で観察されました。2Dの高さ（図5a）と3Dの高さ（図5d）の両方の画像で、明るいナノ粒子はより高い高さを持っていました。地形情報に加えて、位相画像は通常、表面構造を検出し、柔らかさ/硬さの領域を区別し、材料のさまざまなコンポーネントをマッピングします。 2D位相画像（図5b）に示されているように、球形のPD-AuNPは十分に視覚化されています。さらに、3D振幅エラー画像（図5c）は球形の形態を示しました。セクション分析が実行され、結果が図5eに表示されます。図5aの線A–Bを分析し、2つのPD-AuNPの高さを10.44および10.47nmと測定しました。

AFM画像とPD-AuNPの断面分析。 a 2Dの高さ（1μm×1μm）。 b 2Dフェーズ（2.5μm×2.5μm）。 c 3D振幅エラー（1μm×1μm）。 d 3Dの高さ（1μm×1μm）。 e a のラインA–Bの断面分析

球形のPD-AgNPは、2D高さ画像で明確に視覚化されました（図6a）。 2Dフェーズ（図6b）と3Dフェーズ（図6c）の画像から、2つの異なるコンポーネント（PD-AgNPと還元剤）に関する詳細な情報を観察しました。鮮やかな色の球形の材料（つまり、PD-AgNP）は、暗い色のコンポーネントよりも比較的高い硬度を保持していました。濃い色の成分は還元剤（つまり、PDが豊富な画分）からのものでした。 PD-AgNPの球状の形態は、3D振幅エラー画像からも確認されました（図6d）。断面分析も実行され、図6eに示されています。図6aの線A–Bを分析し、2つのPD-AgNPの高さを7.46nmと10.35nmと測定しました。

AFM画像とPD-AgNPの断面分析。 a 2Dの高さ（1μm×1μm）。 b 2Dフェーズ（1μm×1μm）。 c 3Dフェーズ（1μm×1μm）。 d 3D振幅エラー（1μm×1μm）。 e a のラインA-Bの断面分析

サイズを正確に測定するための拡張AFM画像の曲率依存の進化

図5と図6は、それぞれPD-AuNPとPD-AgNPの2Dと3DAFMの生データを示しています。図1と図2の現在の高さの画像から。図5aおよび6aでは、図5bおよび図6bの位相情報がないと、ナノ粒子の境界を正確に特定することは困難です。 3D画像は、ナノ粒子の形態を特定するのに役立ちますが、ナノ粒子の正確なサイズを提供するものではありません。したがって、κによる曲率依存の進化 ₂ ナノ粒子と基板の間の谷線を特定するために、フローが採用されました。図7に示すように、Δ t のステップサイズを使用します。 =10 ⁻⁷ 、PD-AuNP（図5a）およびPD-AgNP（図6a）の2D高さデータに対して500の進化ステップが実行されました。 κ ₂ フローは、PD-AuNP（図7a）とPD-AgNP（図7b）の境界を表す主要な谷線を正確に識別しました。青と赤の線は、それぞれ得られた谷と尾根の線を表しています。これらの強化された画像から、サイズ測定のために各画像から30個の個別のナノ粒子が選択されました。サイズは、強化されたAFM2D画像からPD-AuNPの場合は19.14nm、PD-AgNPの場合は29.93nmと測定されました。 AFM画像のサイズは、HR-TEM画像で測定されたサイズよりも大きかった（PD-AuNPの場合は14.94 nm、PD-AgNPの場合は18.40 nm）。 AFMマイカ基板上のAuNPの冷間圧接現象は、HR-TEMとAFMサイズ測定の間のサイズの不一致を説明することができます[20]。

曲率に依存する進化による強化されたAFM2D高さ画像。 a PD-AuNP。 b PD-AgNPs

HR-XRD分析

ナノ粒子の結晶構造を特定するには、HR-XRD分析が必要です。図8に示すように、HR-XRD分析では、PD-AuNPとPD-AgNPのブラッグ反射が示され、両方のタイプのナノ粒子が面心立方構造を持っていることが示されました。 （111）面と（200）面は、PD-AuNPでそれぞれ38.2°と44.4°に現れました（図8a）。 PD-AgNPの場合、38.2°、44.4°、65.2°、および78.0°の強い回折ピークは、結晶構造の（111）、（200）、（220）、および（311）面に対応していました（図。 8b）。不純物にはアスタリスクが付いています。 （111）面は、両方のナノ粒子のHR-XRDパターンで最も強く、結晶の主な配向が（111）面に沿っていることを示しています。次に、シェラーの式を使用して、両方のナノ粒子の大まかなサイズ推定を実行しました。 （111）ピークが最も強かったため、このピークに基づいてサイズを推定しました。 Scherrer式の各項の定義。 （ D =0.89×λ/ W ×cosθ）は次のとおりです： D は粒子サイズ、θは（111）ピークのブラッグ回折角、λはX線波長、βはラジアン単位の（111）ピークの半値全幅（FWHM）です。方程式からの大まかなサイズの見積もりでは、PD-AuNPの場合は11.05 nm、PD-AgNPの場合は12.54nmになりました。

HR-XRD分析。 a PD-AuNP。 b PD-AgNPs

FT-IRスペクトル

FT-IRスペクトルは、還元剤のどの官能基がAuNPおよびAgNPの合成に関与していたかについての重要な情報を提供します。 PDは、トリテルペンアグリコンと糖で構成され、配糖体を形成します（図1）。 3つのFT-IRスペクトルを図9に示します。PD濃縮画分（図9a）、PD-AuNP（図9b）、およびPD-AgNP（図9c）です。 PD濃縮画分の-OH基に対応する広帯域が3421cm ^-1 に現れました。 （図9a）。 –OH基の水素結合により、広帯域が観察されました。このバンドは3426cm ^-1 にシフトしました PD-AuNP（図9b）および3407 cm ^-1 の場合 PD-AgNPの場合（図9c）、ヒドロキシル基が合成に関与していることを示唆しています。 1654 cm ^-1 のバンド および1457cm ^-1 PDに富む画分の芳香族C =C結合の振動が原因で現れました（図9a）。合成後、1654 cm ^-1 のバンド より低い波数にシフトしました。例：1633 cm ^-1 PD-AuNP（図9b）および1621 cm ^-1 の場合 PD-AgNPの場合（図9c）。 C–OおよびC–Hの振動は1035 cm ^-1 で発生しました （図9a）、このバンドはより高い波数にシフトしました（例：1043 cm ^-1 ）。 PD-AuNP（図9b）および1058 cm ^-1 の場合 PD-AgNPの場合（図9c）。 FT-IRの結果から、PDに富む画分の–OH、芳香族C =C、C–O、およびC–H官能基が合成に寄与しました。

FT-IRスペクトル。 a PDが豊富な画分。 b PD-AuNP。 c PD-AgNPs

PD-AuNPの触媒活性

緑で合成されたAuNPは、4-NP還元反応の触媒としてうまく適用されています[21、22、23、24、25]。 PD-AuNPの触媒活性は、水素化ホウ素ナトリウムの存在下での4-NPから4-APへの還元反応を使用して評価されました。 4-NPの還元反応を使用してAuNPの触媒活性を評価する主な理由の1つは、定性的および定量的の両方で、UV-可視分光光度法によって反応を監視することが非常に適していることです。反応混合物の最終濃度は、触媒活性について次のとおりでした：4-NP（0.113 mM、1当量）、水素化ホウ素ナトリウム（4.13 mM、36.5当量）、およびPD-AuNP（0.04 mM、0.354当量）。 。過剰な水素化ホウ素ナトリウム（基質4-NPと36.5当量）の存在下では、4-ニトロフェノラートアニオンの形成により、4-NPは400 nmで最大吸光度を示しました（データは示していません）。 4-ニトロフェノラートアニオン溶液の色は黄色であり、触媒を添加しないと還元反応は進行しなかった。 PD-AuNPを触媒として添加するまで、400nmでの吸光度は変化しませんでした。 PD-AuNPを追加するとすぐに、400nmでの吸光度が減少し始めました。興味深いことに、300 nmに新しいピークが同時に現れました。これは、最終製品である4-APを示しています（図10a）。反応は、過剰な水素化ホウ素ナトリウムの存在下で720秒以内に完了しました。反応中に過剰な水素化ホウ素ナトリウムを使用して、疑似一次反応速度を確保しました。時間（秒）とln（ C のプロットから _t / C ₀ ）（ C _t ：時間 t での400nmでの4-NPの濃度 、 C ₀ ：時間 0 での400nmでの4-NPの濃度 ）、3.4×10 ^-3 の速度定数で線形関係が観察されました。 / s（図10b）。 C に置き換えることができます _t および C ₀ A で _t および A ₀ 、それぞれ、ここで A _t は、時間 t での400nmでの吸光度です。 、および A ₀ は、時間 0 での400nmでの吸光度です。 。結果に基づいて、PD-AuNPは4-NP還元反応を効果的に触媒し、過剰な水素化ホウ素ナトリウムの存在下で4-APを生成しました。

PD-AuNP触媒の存在下での水素化ホウ素ナトリウムによる4-NP還元反応。 a 紫外可視スペクトルと b ln（ C のプロット _t / C ₀ ）時間（分）の関数として

私たちの研究室では、AuNPの合成にさまざまな濃度のコーヒー酸を使用し、4-ニトロフェノール還元反応を使用してそれらの触媒活性を評価しました[26]。コーヒー酸は、植物に含まれる二次代謝産物およびフェノール化合物の1つです。結果は、最低濃度のカフェー酸が最高の触媒活性を示したことを示した。さらに、遠心分離によって元のコロイド溶液からコーヒー酸を除去すると、触媒活性が最大6.41倍向上しました。現在のシステムでは、PD-AuNPの速度定数は3.4×10 ^-3 であることが観察されました。 / s。おそらく、遠心分離によるPD-AuNPの合成後のPDの除去は、触媒活性を高めることができます。これは私たちの将来の仕事の1つになります。コーヒー酸とPDはどちらも植物からの二次代謝産物であり、得られたAuNPは優れた触媒活性を示しました。したがって、植物の多様な二次代謝産物は、AuNPナノ触媒を生成するためのグリーン還元剤の効率的な候補となる可能性があります。

結論

PDはPlatycodiRadixの主要なキキョウサポニンであり、有益な生物学的活性を持っていることが知られています。現在の報告では、PDに富む画分はPD-AuNPsとPD-AgNPsの合成のためのグリーン還元剤として採用されました。 HR-TEMおよびAFM画像は、サイズと形態に関する情報を提供しました。両方のナノ粒子はほとんど球形で、面心立方構造でした。曲率に依存する進化を採用して、AFM画像を滑らかにし、強調して、サイズの正確な測定を可能にしました。 –OH、芳香族C =C、C–O、およびC–H官能基は、ナノ粒子を生成するための還元剤として機能しました。また、PD-AuNPは4-NP還元反応に対して触媒活性を示しており、将来的にはPD-AuNPを触媒として利用できる可能性があります。植物代謝物には、NMPの固有の活性とともに、しばしば相乗的な特性を示す独自の貴重な生物学的活性があります。したがって、私たちの将来の仕事の1つには、invitroおよびinvivo研究による両方のナノ粒子の生物活性の評価が含まれます。結論として、新しいナノ材料の生産におけるサポニンなどの植物代謝物の使用と拡大は増加し続けるでしょう。