腫瘍を標的としたイメージングおよび治療のための多機能金ナノ粒子のワンステップ、迅速かつグリーンな合成

はじめに

ドキソルビシン（DOX）は一般的に使用されている抗がん剤であり、血液悪性腫瘍[1]、さまざまな腺がん[2,3,4,5]、軟部肉腫[6]などのさまざまながん化学療法で広く使用されています。 ]、 等々。しかし、DOXの長期的かつ高用量は、薬剤耐性[7]、悪心[8]、脱毛[9]、および急性および慢性毒性[10]を引き起こし、うっ血性心不全[11]を引き起こす可能性があります。したがって、優れた生体適合性と高い薬物負荷能力を備えた薬物担体を開発することが非常に必要である。近年、量子ドット[12、13]、キトサン[14、15]シリコンナノ材料[16、17]、高分子ナノ材料[18、19、20]、蛍光ナノ粒子[21、22、 23,24]、および金属ナノ材料[25,26,27,28,29,30]は、腫瘍の診断と治療のためのDOX輸送ベクターとして開発されました。金ナノ材料は、その独特の化学的および光学的特性、低毒性、優れた生体適合性、およびこれらのナノ材料間の制御能力の表面修飾[31、32]により、広く使用されています。これまでのところ、GNPへのDOXの結合には3種類のアプローチがあります。 1つ目は、ヒドラジン[25]、1-エチル-3- [3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）[26]、pH感受性剤[27]、DCC /を使用して、DOXをGNPの表面に結合させることです。 NHSシステム[28]。 2つ目は、GNPをDOXと少なくとも24時間インキュベートすることです[29]。 3つ目は、金ナノ粒子（GNP）の表面に結合したクエン酸塩をDOXに置き換えることです[30]。これらのDOX結合GNPは腫瘍治療に使用されてきましたが、十分な特異性がないため、アプリケーションはまだ制限されています。最近、El-sayedの[27]グループは、DOX、RGDペプチド、および核局在化シグナル（NLS）ペプチドを使用してGNPを機能化しました。彼らの研究のハイライトは、GNPが受容体を介したRGDペプチドのエンドサイトーシスを介して腫瘍細胞に入り、次にNLSペプチドの助けを借りて核に入るということです。これによりDOXはDNA合成を効果的に妨害します。残念ながら、GNP上でペプチドまたは薬物を層ごとに結合することによって少なくとも120時間必要であり、各プロセスには少なくとも24時間必要でした。同様に、上記のすべての方法は、複数のステップ、高コスト、複雑な準備、後処理などのいくつかの一般的な問題に直面していました。したがって、多機能の金ナノ材料を合成するための簡単で迅速な方法を開発する必要があります。

この論文では、DOXの化学構成に基づいてDOX共役GNPを初めて調製するためのワンステップ戦略を提示しました。さらに、腫瘍の診断と治療に使用できるDOXの機能を向上させるために、多機能DOXトランスポートベクターを準備するための便利な合成方法を紹介しました。他の研究との主な違いは、還元剤および安定化試薬としてDOX、RGDペプチド、およびNLSペプチドを使用して、GNPを製造し、これら3つの物質すべてをGNPの表面に結合させてDRN-GNPを形成することです。その間。私たちの以前の研究[33,34,35]は、RGDおよび他のペプチドを使用して金イオンを還元し、金ナノ材料を製造できることを証明しました。 NLSのN末端は、システインシステインチロシン（CCY）配列を使用してCCYNLSを構築することで変更できます。これにより、NLSのターゲティング効果を維持しながら金イオンを還元できます[36]。また、DOXは塩基性条件下で強い還元性を持つ2つのフェノール性ヒドロキシル基を持っているため[37、38]、金イオンを還元してGNPを形成する可能性があることもわかりました。さらに、DOXの抗腫瘍効果は、炭素7のアミノ基と炭素9のヒドロキシル基によってDNAに埋め込まれるため、影響を受けない可能性があります[39]。その間、ペプチドとDOXの硫黄、酸素、窒素をGNPと組み合わせて、コロイドを安定に保つことができます[33]。結果は、DRN-GNPが正常に製造され、腫瘍のイメージング、診断、および治療でうまく機能したことを示しています（スキーム1）。私たちの知る限り、これは、多機能GNPをワンステップ法で結合したDOX、RGD、およびNLSペプチドの合成、および腫瘍の診断と治療におけるそれらの応用に関する最初の報告です。

DRN-GNPの合成、Hela細胞による取り込み、およびDRN-GNPの腫瘍診断の概略図

材料と方法

資料

HAuCl ₄ 4H ₂ OはSinopharmChemical Reagent Co.、Ltdから購入し、環状RGDペプチド（アミノ酸の配列はアルギニン-グリシン-アスパラギン酸-チロシン-グルタミン酸（c（RGDyE）））および水酸化ナトリウムは参考文献と同じでした。 [35]。ドキソルビシンはSangonBiotech（Shanghai）Co.、Ltdから購入しました。CCYNLSペプチド（アミノ酸の配列はシステイン-システイン-チロシン-プロリン-プロリン-リジン-リジン-リジン-アルギニン-リジン-バリン、CCYPPKKKRKV）はChina Peptides Co.、Ltd（上海、中国）。 Hela細胞株とMCF-7細胞株は、Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltdから提供されました。胎児ウシ血清（FBS）とダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）は、GibcoBRL LifeTechnologiesから購入しました。増殖および細胞毒性アッセイキット（MTT）は、北京鼎国長生生物科技株式会社から購入しました。

DOX-GNP、NLS-GNP、DR-GNP、DN-GNP、DRN-GNPの合成

ＤＯＸ－ＧＮＰの調製のために、ＤＯＸ溶液（０．２ｍｇ ／ ｍＬ、１．０ｍＬ）を磁気攪拌下でクロロ金酸溶液（０．８６ｍＭ、１．０ｍＬ）に加え、次にＮａＯＨ（２Ｍ、５μＬ）を加えた。 pHを調整します。 NLS-GNPの調製では、CCYNLSペプチド溶液（0.5 mM、1.0 mL）を磁気攪拌下でクロロ金酸溶液（3.44 mM、1.0 mL）に添加し、次にNaOH（2 M、20μL）を添加してpHを調整しました。 。 DR-GNPを調製するために、DOX溶液（0.2 mg / mL、1.0 mL）およびRGDペプチド溶液（1.0 mM、1.0 mL）を、磁気攪拌下でクロロ金酸溶液（1.72 mM、2.0 mL）に添加し、次にNaOHを添加しました。 （2 M、15μL）を加えてpHを調整した。 DN-GNPの調製のために、DOX溶液（0.2 mg / mL、1.0 mL）およびCCYNLSペプチド溶液（0.5 mM、1.0 mL）を、磁気攪拌下でクロロ金酸溶液（1.72 mM、2.0 mL）に添加し、次にNaOHを添加しました。 （2 M、20μL）を加えてpHを調整した。 DRN-GNPの調製では、DOX（0.2 mg / mL、1.0 mL）、CCYNLSペプチド（0.5 mM、1.0 mL）、およびRGDペプチド（1.0 mM、1.0 mL）の溶液をクロロ金酸溶液（1.72磁気撹拌下でmM、3.0 mL）、次にNaOH（2 M、35μL）を加えてpHを調整した。すべての反応は、還流システムで100°Cで30分間継続し、pH値は10〜12でした。すべてのGNPは、55,000 rpmで30分間の遠心分離（Optima MAX-TL、Beckman Coulter）によって精製されました。上澄みを取り除いた後、GNPは超純水に再分散されました。

特性評価

GNPのスペクトルの特性評価は、UV 3150分光光度計（島津製作所）、Nicolet Avatar FTIRモデル330分光計（Thermo、アメリカ）、および同じ分析条件のESCALab250 X線光電子分光法（XPS）を使用して実装されました。参照として。 [35]。 GNPの透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、加速電圧200 kVで動作するTEM（JEM-2100F、JEOL、日本）から取得しました。

動的光散乱とゼータ電位測定

ゼータPALSゼータ電位アナライザー（Brookhaven Instrument Corporation）を使用して、90°で動作するDOX-GNP、NLS-GNP、DR-GNP、DN-GNP、およびDRN-GNPの動的光散乱（DLS）を測定しました。室温での固体レーザー（λ=670 nm）との角度。 AQ-827電極が装備されている場合、アナライザーを使用してGNPのゼータ電位を測定しました。

ICP分析

GNP中のAuの定量分析は、参考文献と同じでした。 [35]。

PBS、HCl、NaOH、NaCl溶液に分散したDR-GNP、DN-GNP、およびDRN-GNPの安定性

沈殿したGNP100μLと高濃度の0.2M PBS、0.5 M HCl、0.5 M NaOH、および1.0 MNaCl溶液500μLをそれぞれ混合しました。 12時間後、私たちは彼らの写真を撮り、彼らのUV吸収スペクトルをテストしました。

細胞培養

Hela細胞とMCF-7細胞をインキュベーター（5％CO ₂ で加湿）で培養しました。 バランスの取れた空気）37°Cで24時間。培地は10％FBSを含むDMEMでした。生細胞の数は、細胞カウントボードによってカウントされます。

遊離DOXおよびDRN-GNPの細胞毒性アッセイ

指数期のHela細胞とMCF-7細胞を、96ウェルプレートのウェルに添加しました（約5×10 ³ 細胞/ウェル）およびそれぞれ24時間インキュベートした。次に、濃度0、20、40、60、80、および100μg/ mLのDRN-GNP（対応するDOXの濃度は0.0、7.8、15.6、23.4、31.2、および39.0μg/ mL）を各ウェルとインキュベートし、それぞれ37°Cで24時間インキュベートしました。対照群はPBS緩衝液のみを添加して設定し、その生存率は100％に設定しました。 MTT（20μL、5 mg / mL）を各ウェルに添加し、37°C​​で約4時間インキュベートしました。次に、培地を注意深く吸引し、結晶が完全に溶解するまで、150μLの2つのジメチルスルホキシドをウェルごとに10分間加えた。マイクロプレートリーダー（Thermo Multiskan Mk3）を使用して、490nmでの各ウェルのOD値を測定しました。各グループに3つのウェルを用意し、計算値を平均値±標準偏差として表した。

フローサイトメトリー実験

指数期のHela細胞とMCF-7細胞を、2枚の12ウェルプレートの各ウェルに添加しました（約5×10 ⁴ 細胞/ウェル）およびそれぞれ24時間インキュベートした。次に、DRN-GNPs溶液を各ウェルに添加し（最終濃度は0、20、40、60、80、および100μg/ mL）、それぞれ37°Cで24時間インキュベートしました。培地を除去し、トリプシン（EDTAを含む）溶液をウェルに加えて細胞を消化します。次に、ウェルからトリプシン溶液を除去し、ウェルに培地を加え、細胞を遠心分離管に移します。 1000gで5分間遠心分離した後、上清を除去し、各チューブの細胞を収集し、PBS溶液でカウントしました。約5–10×10 ⁴ 細胞のうちの1つを別の遠心分離管に取り、1000gで5分間再び遠心分離した。上澄みを取り除き、100μLのAnnexinV緩衝液をチューブに加えます。 5μLのAnnexinV-FITCと5μLのヨウ化プロピジウムをチューブに加え、細胞と穏やかに混合します。チューブを室温（20〜25°C）で15分間暗所でインキュベートし、フローサイトメーター（BD Accuri C6）でテストしました。

細胞培養に関する光学暗視野散乱イメージングおよび透過型電子顕微鏡研究

Hela細胞とMCF-7細胞を、約7×10 ³ の8穴細胞培養スライドに移植しました。 それぞれのウェルの細胞。 DRN-GNPを35μg/ mLの最終濃度で各ウェルに添加しました。 24時間インキュベートした後、これらの細胞をPBS溶液で3回すすぐことにより、物理的および遊離吸収したGNPを除去しました。次に、4％パラホルムアルデヒドで20分間固定し、数滴のグリセロールでコーティングし、これらの8穴細胞培養スライドを別のカバーガラスで密封しました。暗視野顕微鏡（Zeiss Imager Z1）を使用して、倍率200倍および反射モードで細胞を評価しました。 5Vの電圧での明視野画像と暗視野画像の露光時間はそれぞれ1msと400msでした。

TEM研究では、Hela細胞とMCF-7細胞をDRN-GNP（35μg/ mL）とともに細胞培養フラスコ内でそれぞれ24時間インキュベートしました。培地とDRN-GNPの混合溶液をインキュベートして吸引した後、細胞をPBS溶液で3回リンスし、トリプシンで消化しました。細胞を少量のDMEM培地を含む遠心チューブに移した。細胞を10分間遠心分離（1500 rpm）し、DMEM培地を注意深く吸引し、3％グルタルアルデヒド溶液（通常は材料の40倍量）をチューブに注意深く加えて、細胞を底部に固定しました。 1時間以上チューブ。 1％四酸化オスミウムを1時間添加して細胞をさらに固定し、エタノールで脱水した後、Spurr（Sigma-Aldrich Co.、USA）に包埋しました。細胞をチューブから取り出し、切片に切り、酢酸ウラニル水溶液とクエン酸鉛で染色し、銅グリッド（300メッシュ）にマウントしました。標本は、FEI TECNAI-12透過型電子顕微鏡（動作電圧120 kV）を使用して測定されました。

動物実験

動物の主題

無胸腺雌ヌードマウスは、南部医科大学（広州、中国）の動物実験センターからinvivoで購入しました。 腫瘍治療テスト。すべての動物実験は、中華人民共和国保健省の動物管理規則（文書番号55、2001）および中国薬科大学の実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施されました。

担癌マウスにおける遊離DOXとその抱合体の治療効果

簡単に説明すると、36匹のヌードマウス（5〜6週齢、体重16〜18 g）をランダムに6つのグループに分けました。 Hela細胞を皮下注射しました（5×10 ⁶ PBS中の細胞）を右腋窩窩に入れます。 5日後、対照群のマウスに生理食塩水（0.154 mol / L、0.2 mL）を尾静脈から注射しました。遊離DOX、DR-GNP、DN-GNP、およびDRN-GNPグループのマウスも尾静脈から注射されました。静脈内注射と腫瘍注射のDRN-GNPの抗腫瘍効果を比較するために、腫瘍部位に同量のDRN-GNPを注射するグループを設定しました。これらの5つのグループは、各マウスで0.3 mg / kg相当の遊離または結合DOXの用量を維持しました。各マウスは、1日1回尾静脈または腫瘍注射を受けた。各マウスの体重と腫瘍体積を14日間にわたって毎日モニターした。 DOX、DR-GNP、DN-GNP、およびDRN-GNPの治療効果をさらに調査するために、6つのグループの腫瘍を14日間の治療後に病理学的分析のために切除しました。マウスの腫瘍および心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓の内臓をマウスから単離し、10％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。スライスした腫瘍組織をヘマトキシリン・エオシン（H＆E）で染色し、オリンパスの光学顕微鏡で検査しました。

結果と考察

DOX-GNP、NLS-GNP、DN-GNP、DR-GNP、DRN-GNPの合成と特性評価

DOX-GNPの合成では、NaOH溶液をDOXとクロロ金酸溶液の混合溶液に加えると、溶液の色がすぐにオレンジ色から浅い紫色に変化し、100°Cでワインレッドになりました。 DOX-GNPの形成を示す1分間の磁気攪拌下の還流システム。結果は、DOXが塩基性条件下で強い還元性を有する2つのフェノール性ヒドロキシル基（No.6およびNo.11炭素）を有するため、DOXの還元能力が非常に強いことを示した。色が変わらなくなるまで反応を30分間続けた。

DOXのオレンジレッドカラーとGNPのワインレッドカラーの混同を避けるために、UV吸収スペクトルを特徴づけることでより多くの証拠を提示します（図1aを参照）。 DOXには、485nm付近に特徴的な吸収ピークと530nmにピークがあります。ただし、製品の溶液のスペクトルでは480 nmのピークが消失し、GNPの520 nmの特徴的な表面プラズモン共鳴（SPR）吸収ピークに特徴的なピークが生じました。それでも、GNPの形成は、GNPの520nmとDOXのピークの530nmの間で完全には決定されていません。 GNPは高速遠心分離で沈殿し、DOX分子は沈殿しないことを考慮すると、遠心分離管の底の生成物に紫色の沈殿物が見られます（図1a（3-4）の挿入図）。どちらも持っていません（図1a（1-2）の挿入図）。

a （ a の挿入図であるDOXおよび調製されたままのDOX–GNPのUV-Visible吸収スペクトル ）は、遠心分離前（1、3）および遠心分離後（2、4）のDOX（1、2）およびDOX-GNP（3、4）の画像です。 b DOX–GNPのTEM画像。 c DOXおよび調製されたままのDOX-GNPのFTIRスペクトル。 d DOX–GNPのXPSスペクトル

DOXは、365nmの紫外線を照射すると赤色の蛍光を発します。ただし、DOXの蛍光はGNPの合成後に消えました。考えられる理由は2つあります。 1つ目は、GNPの吸光係数が非常に強く、分子がGNPの表面に近接している場合（<5 nm）、分子の蛍光を消光する傾向があることです[40]。距離が20nm以上に増加すると、ナノ粒子のプラズモン場が遠すぎて蛍光シグナルを消光できなくなります[41]。もう一つの理由は、DOXの蛍光基が還元剤の役割を果たした後に破壊されたということです。図1cに示すように、DOX-GNPの赤外線吸収ピークの数はDOXの数よりも大幅に少ないですが、2910 cmでの特徴的なIR吸収ピークなど、DOXの特徴の多くは依然として保持されています。 ^-1 （C-H、伸縮振動）[42]、1631 cm ^-1 （カルボニル伸縮振動）[43]、1114 cm ^-1 （C-O、C-N伸縮振動）[44]、および867 cm ^-1 （N-H、C-H、面外曲げ振動）[45]、それぞれ。 DOXのこれらの代表的なピークは、DOX-GNPのスペクトルにも表示され、DOXがDOX-GNPに正常に結合したことを示しています。興味深いことに、1214 cm ^-1 のピーク フェノール性ヒドロキシル基のC-O伸縮振動の特徴的なピーク[46]は、DOX-GNPのスペクトルで消失しました。フェノール基はAuイオンをGNPに還元することができ、それからそれはカルボニル基に輸送されました。 DOXは炭素7のアミノ基と炭素9のヒドロキシル基によってDNAに埋め込まれているため、DOXの効果は影響を受けないと推測されます[39]。

TEMの結果から、DOX-GNPの粒子サイズは約6 nmであることがわかります（図1b）。計算されたAu（I）の比率はDOX-GNPのXPSスペクトルから31.93％であり（図1d）、コロイドの安定性を維持するのに十分な高さです。しかし、上清を除去した後、高速遠心分離で0.2 M PBS緩衝液にDOX-GNPの沈着物を分散させると、この溶液の色は紫黒色になり、目に見える不溶性のフロックが見られました。これは、高塩濃度の環境ではDOX-GNPの安定性があまり良くないことを示しています。 DOXはアミノ基を1つしか持っていないが、スルフヒドリル基を持っていないため、DOXがAu-SおよびAu-N結合を介してGNPの表面を接続するには不十分であると説明できます。したがって、DOX-GNPを造影剤および腫瘍の画像化と治療のための抗腫瘍材料として使用する場合は、より多くの努力が必要です。

還元剤および安定剤として、DOX、RGDペプチド、およびNLSペプチドを使用してDRN-GNPを合成しました。 RGDペプチドは、α _v を過剰発現している一部の腫瘍細胞を特異的に標的にすることができます。 β ₃ 内粒、およびNLSペプチドは特に核を標的にすることができます。図2aは、製造されたDOX-GNP、NLS-GNP、DRN-GNPのUV-Visスペクトルを示しています。それらの表面プラズモン吸収ピークの特性は520〜530nmでした[33]。挿入図から、GNPが真っ赤なワインの色を示していることもわかります。 TEM画像（追加ファイル1：図S1）は、NLS-GNPとDRN-GNPの粒子サイズが約10nmと5nmであり、GNPが均一に分布しており、明らかな凝固が見られなかったことを示しています。

a UV-可視吸収スペクトルとDOX-GNPの写真画像（ a ）、NLS-GNP（ b ）、およびDRN-GNP（ c ）。 b 基本的なDOX、RGDペプチド、NLSペプチド、およびDRN-GNPの上清のUV-Visible吸収スペクトル。 c NLSペプチド、NLS-GNP、およびDRN-GNPのFTIRスペクトル。 GNPのスペクトルとNLSペプチドのスペクトルの間の距離は、コントラストのためにはっきりと拡大されています

NLS-GNPとDRN-GNPの合成を検証するために、図2cのNLSペプチドとGNPのFTIRスペクトルの特性を調べました。 NLSペプチドのいくつかのFTIRピークは、C-H伸縮振動吸収ピーク（2840–2972 cm ^-1 など）のNLS-GNPおよびDRN-GNPのスペクトルで見つかりました。 ）[47]、C =O伸縮振動吸収ピーク（1630–1700 cm ^-1 ）[48]、および=C-H面内曲げ振動ピーク（1300–1475 cm ^-1 ）[49];それは、CCYNLSペプチドがGNPの表面にうまく結合したことを示した。また、NLSペプチドの1529 cm ^-1 にあるチロシン末端のベンゼン骨格振動ピークを発見しました。 フェノール性ヒドロキシルC-O伸縮振動のピークは1193cm ^-1 [49] NLS-GNPおよびDRN-GNPの赤外スペクトルでは消失しました。これは、チロシン末端のベンゼン骨格が還元剤の役割を果たした後、キノン構造に輸送されたことを意味します。

DRN-GNPを高速で遠心分離し、ほぼ無色である上澄み液を収集し、図2bのUV-Visスペクトルを介して反応物が残っているかどうかをテストしました。 RGDおよびNLSペプチドのUV吸収ピークはチロシン残基に由来し、吸収ピークは275nmに位置していました。しかし、フェノール性ヒドロキシル基はアルカリ性条件下で負の酸素イオンになり、ベンゼン環の電子密度が増加し、ピークは292nmに赤方偏移しました。 DRN-GNPの上清のUV-Visスペクトルに特徴的なピークは見られませんでした。これは、両方のペプチドが反応に関与したことを意味します。 DOXには450〜600 nmの範囲に3つの吸収ピークがありますが、DRN-GNPの上清にはそれらのピークがありません。その上、DRN-GNPの上清には、その色が薄茶色であったためDOXは見つかりませんでしたが、基本的な条件下でのDOXの色は透明な薄紫でした。 3つの材料はほぼ完全に反応すると結論付けることができます。同様に、DR-GNPとDN-GNPもこのように説明されています。追加ファイル1：図S2を参照してください。

XPS分光法を使用して、NLS-GNPおよびDRN-GNPのAuの原子価を調べました。図3a、bに示すように、結合エネルギーが約83.6eVと87.0eVの2つのピークは、Au 4f7 / 2と4f5 / 2の光電子の放出と一致しています[33]。両方のGNPのAu4f7 / 2結合エネルギー位置はほぼ84.0eVです。 NLS-GNPの場合、Au（0）（83.5 eV）とAu（I）（84.1 eV）にデコンボリューションでき、ピーク面積比はそれぞれ57％と43％です。同様に、DRN-GNPの場合、Au（0）（83.6 eV）とAu（I）（84.4 eV）にデコンボリューションでき、ピーク面積比はそれぞれ62％と38％であるため、比率が高くなります。 Au（I）の。電荷はAu（I）-S複合体を形成し、GNPのコロイド安定性を維持するのに役立ちます。興味深いことに、追加ファイル1のNLS-GNP、DN-GNP、およびDRN-GNPのXPSスペクトルで3種類のSを特定しました。図S3。青と黒の曲線は硫黄の酸化状態を表し、紫の曲線はS-H結合を表し、緑の曲線はAu-S結合を表します。 Au-S結合の形成は、NLSペプチドがこれら3つのGNPの表面にうまく結合していることを示しています。

（ a のAu4fのXPSスペクトル ）NLS-GNP、（ b ）DRN-GNP。元のスペクトル（黒）とフィッティングされた結果（赤）のAu 4f7 / 2結合エネルギーは、Au（0）-青の曲線とAu（I）-紫の曲線の2つの成分にデコンボリューションできます。それぞれPBS、NaCl、NaOH、およびHClに分散したDRN-GNPのUV-Visible吸収スペクトルと画像（ c 。

さらに、XPSスペクトルのN 1s、C 1s、およびO 1sのピークは、ペプチドとDOXがGNPに結合していることを示しています（追加ファイル1：図S4）。

XRDスペクトル（追加ファイル1：図S5）は、これらのGNPの結晶構造が面心立方結晶構造であることを示しています。これは、すべてのXRDスペクトルに38.2°、44.5°、64.7°、および77.8°の4つのピークが含まれているためです。 （111）、（200）、（220）、および（311）平面に対応します[33]。

DRN-GNPの安定性

これら5つのGNPの動的光散乱（DLS）およびゼータ電位データを表1に示しました。それらの流体力学的サイズは、TEMによって特徴付けられるサイズよりも大きく、これは、水溶性GNPのコアの周りの一定量の水和分子に起因する可能性があります。それらのゼータ電位は、GNPの表面に結合したカルボキシル基のために負でした。 GNPsソリューションは、ゼータ電位の絶対値が30 mVを超える場合に、良好なコロイド安定性を示します。絶対値が大きいほど、安定性が高くなります。表1から、すべてが良好なコロイド安定性を持っていることがわかります。比較すると、ゼータ電位のNLS-GNPの値が最も高かったのは、それらの表面がNLSペプチドでいっぱいであり、チオール基。 DOX-GNPのゼータ電位の絶対値は30mVに近かった。 DOX-GNPをPBS緩衝液に分散させた場合、DOX-GNPはあまり安定していなかったという前述のことと一致していました。スペクトルデータは、追加ファイル1：図S6に表示されました。

GNPの特徴的な表面プラズモン共鳴（SPR）バンドの変化は、UV-Vis分光法を利用してGNPの凝集を決定するために使用できます[49]。それらのUV-Visスペクトルを測定し、DRN-GNP（図3c）を高塩（1 MNaClおよび0.2M PBS）、強酸（0.5 M HCl）、および強塩基（0.5 M HCl）に分散させたときの写真を撮りました。 0.5 M NaOH）溶液。さまざまな過酷な条件下では、溶液の色の変化もUV-visスペクトルのシフトも観察されませんでした。ただし、HCl溶液では、色がわずかに紫色に変化し、紫外線吸収ピークの赤色が約20 nmシフトしました。これは、強酸条件下でGNPがわずかに凝固したことを意味します。 。その理由は、負に帯電したGNPのコロイド安定性が強酸性条件下で影響を受けたが、中性PBSバッファーおよびアルカリ環境では影響を受けなかったためである可能性があります。 DRN-GNPは高塩分および高アルカリ条件下で非常に安定していると結論付けることができます。これは、合成されたDRN-GNPがinvitro細胞イメージングおよびinvivo抗腫瘍治療に使用されることが期待されたことを示しています。

腫瘍細胞のプラズモン暗視野散乱イメージングと細胞TEM顕微鏡法

DRN-GNPを使用した腫瘍細胞の特定のターゲットイメージングでは、テストグループとしてHela細胞を選択し、コントロールグループとしてMCF-7細胞を選択しました。その理由は、Hela細胞がインテグリンα _v を過剰発現しているためです。 β ₃ [50]しかし、MCF-7細胞はそうではないので、RGDの特異的結合はありません。それは良い対照群です[51]。 35μg/ mLの最終濃度で24時間インキュベートした後のこれら2つの細胞株によるDRN-GNPの取り込みは、暗視野モデルでの直立蛍光顕微鏡法によって評価されました。 GNPなしで処理されている細胞は、プラズモン光散乱を示しません（図4 A-Hela細胞、5C-MCF-7細胞）。 DRN-GNPで処理されているHela細胞の画像は、GNPからの散乱信号が核に強く局在していることを示しています（図4bおよび5e）。ただし、MCF-7細胞をDRN-GNPとインキュベートした後は、腫瘍細胞の受動的強化透過性および保持効果（EPR）によって少量のGNPが腫瘍細胞に侵入した可能性があるにもかかわらず、MCF-7細胞からの散乱光をほとんど見ることができませんでした。効果）（図4dおよび5f）、強化された透過性および保持（EPR）効果は、正常組織との解剖学的および病理生理学的差異に関連する固形腫瘍の独特の現象です。たとえば、血管新生は固形腫瘍の血管密度を高め、腫瘍血管の内皮細胞間に大きなギャップが存在し、腫瘍組織は高分子薬物の選択的な血管外漏出と保持を示します[52]。そのため、同じ実験条件下では明確に検出されない可能性があります。結果は、受容体を介したエンドサイトーシスを介したHela細胞のエンドサイトーシスが、GNPの表面にあるRGDペプチドによって促進されることを示しました。 NLSペプチドは、特異的に標的化された核に対する活性を維持することもできます。したがって、合成されたDRN-GNPは、腫瘍を標的としたイメージングのための非常に潜在的な造影剤になる可能性があります。

行の内容は次のとおりです。 「PBSバッファー」は、PBSバッファーとインキュベートする細胞を表し、「DRN-GNPs」は、DRNとインキュベートする細胞を表します。 -GNP。 「1」の下付き文字は細胞の明視野画像を表し、「2」は細胞の暗視野画像を表し、「3」は細胞の重なり合う画像（明視野と暗視野）を表します。すべてのスケールバーは20μmです。 Eの写真は、B ₃ から選択された小さな領域です。 図4では、Fの画像はD ₃ から選択された小さな領域です。 図4では、スケールバーは10μmです

HelaおよびMCF-7細胞で24時間インキュベートしたDRN-GNPのTEM画像。 A ₁ 、A ₂ 、およびA ₃ B ₁ がHeLa細胞に対応している間、 およびB ₂ MCF-7セルへ

表2は、同じ画像内の細胞のデンシトメトリー平均灰色と背景の比率値を示しています。これは、これら2つの細胞株によるDRN-GNPの取り込み量と正の相関関係があります。 PBSバッファーとインキュベートした細胞とMCF-7細胞の比率はほぼ1.0で、細胞の明るさはバックグラウンドにほぼ近かった。 DRN-GNPとインキュベートしたHela細胞の比率は4.80でした。これは、合成されたDRN-GNPを特異的に標的にして、インテグリンα _v を過剰発現した腫瘍細胞に侵入できることを意味します。 β ₃ 。

DRN-GNPの受容体特異的内在化を確認するために、TEM技術を利用してHelaおよびMCF-7細胞によるDRN-GNPの細胞取り込みを調査しました（図5を参照）。 α _v の核および細胞質領域に局在する大量のDRN-GNPがありました。 β ₃ -陽性のHela細胞（図5（A ₁ -A ₃ ））。一方、α _v の細胞質領域内にはごくわずかな量の粒子しか検出されませんでした。 β ₃ -陰性MCF-7細胞（図5（B ₁ -B ₂ ））、それらはパッシブターゲティングEPR効果によってMCF-7細胞に蓄積される可能性があります。 MCF-7細胞の核には、コントラストの高い黒い連続領域があることがわかりました。それらは核を染色した酢酸ウラニルであり、Hela細胞の核内の顆粒粒子とは異なっていました。 TEM画像は暗視野画像の結果と一致しており、GNPの表面にあるRGDおよびNLSペプチドがHela細胞の核を標的とするDRN-GNPを促進したことを示しています。したがって、合成されたDRN-GNPは、腫瘍を標的としたイメージングおよび診断のための完全な造影剤として使用できます。

細胞治療効果の評価

細胞レベルでのDOXおよびDRN-GNPの治療効果を評価するために、最初にMTTアッセイを実施して、これら2つのサンプルを24時間処理したHelaおよびMCF-7細胞の細胞生存率を調べました。 DRN-GNPは、同じDOX濃度（39.0μg/ mL、図6（A、B））でほぼ70％の細胞を殺すことにより、ほぼ同じ阻害効果を示しました。 MTTの結果と一致して、DRN-GNPの濃度が40μg/ mLの場合、Hela細胞とMCF-7細胞の数と状態は比較的良好であったため、35μg/ mLの濃度がイメージングに適した濃度でした。 。 DRN-GNPの濃度が60μg/ mLと高い場合に観察されました（図6（C ₃ ））、Hela細胞は明らかに壊死になりました。 DRN-GNPの濃度が100μg/ mLに達すると、細胞数の顕著な減少が観察され、壊死の特徴として明確な細胞形態変化が観察されます。同じ濃度のコンジュゲートDOXは、遊離DOXと比較してほぼ同じ抗腫瘍効果を示しました。これらの結果は、合成されたDRN-GNPが造影剤としてだけでなく、優れたドラッグデリバリーシステムとしても使用できることを示しています。

MTTアッセイを使用して、Helaに対するDOXおよびDRN-GNPのin vitro抗腫瘍活性を定性的に表示しました（ a ）およびMCF-7セル（ b ）24時間（100％）。 C ₀ の濃度 -C ₅ DRN-GNPの場合は0、20、40、60、80、100μg / mLです。対応するDOXの濃度は、0、7.8、15.6、23.4、31.2、39.0μg / mLです。データは、3つのサンプルの平均±標準偏差（ n ）として表されます。 =3）。さまざまな濃度のDRN-GNP（ c ）とインキュベートしたHela細胞の画像 ）

図7のフローサイトメトリーで検出された結果は、DRN-GNPの抗腫瘍効果も示しています。異なる濃度のDRN-GNPに曝露されたときのHela細胞の生存率は、フローサイトメトリーベースのアッセイによって測定されました。細胞死の2つのモード、アポトーシスと壊死は、それぞれAnnexinv-FITCとヨウ化プロピジウム（PI）色素を使用して測定されました（図7）。 MTTアッセイの結果と同様に、データは、DRN-GNPによって誘発された細胞壊死が用量依存的であることを示しました。壊死細胞の割合は、DRN-GNPとインキュベートせずに8％でした。濃度が100μg/ mLと高い場合、壊死細胞の割合は23.84％でした。つまり、合成されたDRN-GNPはHela細胞を効率的に殺すことができます。 MTTとフローサイトメトリーの結果の違いは、細胞数と方法の違いで説明できます。

さまざまな濃度（0〜100μg / mL）のDRN-GNPにそれぞれ24時間曝露した場合の、生細胞、アポトーシス細胞、および壊死細胞の割合を決定するための代表的な2次元輪郭密度プロット。細胞の壊死とアポトーシスは、PIおよびAnnexinv-FITC色素を使用して測定しました

担癌マウスにおけるDRN-GNPの治療評価

DRN-GNPがinvivoで腫瘍細胞に対して複合治療効果を誘発したかどうかをさらに判断するために、薬物の長期静脈内注射に対する担癌マウスにおけるDRN-GNPの抗腫瘍効果を評価しました。生理食塩水群と遊離DOX、DR-GNP、DN-GNPの静脈内注射群の薬物を対照群として設定し、共役DOXの濃度は遊離DOXの濃度と同じでした。 DRN-GNP治療群の腫瘍サイズは、生理食塩水、DOX、DN-GNP、およびDR-GNP治療群の腫瘍サイズよりも明らかに小さいことが観察されました（図8a）。マウスの腫瘍体積および体重を2日ごとにモニターした。治療群すべての間での腫瘍体積および腫瘍重量の有意な変動を図8d、fに示す。 DN-GNPおよびDR-GNP治療群の腫瘍体積および腫瘍重量は、遊離DOX治療群よりも小さかったが、標的活性が低いため、DRN-GNP治療群よりも依然として大きかった。これは、DOX分子が小さく、ターゲティングが不足しており、invivoでの半減期が短いためである可能性があります。したがって、それらはすぐにクリアされる可能性があります。ただし、DRN-GNPは、血液系の安定性が高く、半減期が長く、標的能力が高いため、腫瘍部位を標的にして、DOXの抗腫瘍効果を発揮することができます。 DRN-GNPの静脈内注射群と腫瘍注射群の間では、薬剤が焦点への複雑な血液循環システムを必要としないため、後者の群の抗腫瘍効果は前者の群よりも優れています。 DOXの腫瘍抑制率は50％未満であり、すべてのDOX結合GNPの率は50％を超えています。それらはそれぞれ66.7％と57.7％まで高くなる可能性があります。 HE染色の結果は、静脈内注射されたDRN-GNPグループの肝臓器官にある程度の損傷があったことを示しました（図9）。さらに、担癌マウスに対するDOX、DR-GNP、およびDN-GNPの生体毒性も組織学的分析によって評価されました。図8bに示すように、生理食塩水群の腫瘍細胞体積は治療群のそれよりも比較的大きく、腫瘍細胞はより多くの有糸分裂像を示しています。すべての結果は、DRN-GNPの腫瘍抑制効果がGNPの中で最高であることを示しました。したがって、私たちが合成したDRN-GNPは、腫瘍治療のための完璧なDOXデリバリーシステムとして使用できます。

a 生理食塩水、遊離DOX、DN-GNP、DR-GNP、およびDRN-GNP（腫瘍注射および静脈内注射）の治療後に担癌マウスから分離された腫瘍画像。 b 生理食塩水、遊離DOX、DN-GNP、DR-GNP、およびDRN-GNP（腫瘍注射および静脈内注射）で治療した後のマウスの腫瘍の組織学的画像。 c 体重、腫瘍体積（ d ）、腫瘍の生息率（ e ）、および腫瘍の重量（ f ）14日間の治療中の担癌マウスの;データは平均±標準偏差（ n ）として表されます =6）

生理食塩水、遊離DOX、DR-GNP、DN-GNP、およびDRN-GNP（腫瘍注射および静脈内注射）で治療した後のマウスの主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓）の組織学的画像

結論

本研究では、多機能DRN-GNPを約30分で調製するワンステップ手法の開発に成功しました。 GNPは、invitroおよびinvivoの両方で腫瘍標的イメージングおよび腫瘍治療にもうまく適用されています。 この成功は、DOX、RGDペプチド、およびCCYNLSペプチドの還元および安定化能力を十分に活用できることを示しています。これにより、GNPの合成プロセスが単純かつ効率的になります。さらに重要なことに、ワンステップで合成されたDRN-GNPは、生理学的システムにおいて依然として良好なコロイド安定性を有し、表面に結合したペプチドは依然として標的能力を維持し、DOXは依然としてその抗腫瘍能力を有します。私たちの知る限り、これは、多機能GNPをワンステップ法で結合したDOX、RGD、およびCCYNLSペプチドの合成、および腫瘍のイメージング、診断、および治療におけるそれらの応用に関する最初の報告です。この戦略はグリーンケミストリーの開発の方向性に沿ったものであり、近い将来、大規模なアプリケーションの基盤を築くでしょう。私たちのレポートは、腫瘍のイメージングと治療に使用される多機能ナノ材料のワンステップ合成のための新しい方法を提供することを期待しています。

データと資料の可用性

すべてのデータセットは、メインペーパーまたは追加のサポートファイルに記載されています。

略語

CCYNLSペプチド：

アミノ酸の配列はシステイン-システイン-チロシン-プロリン-プロリン-リジン-リジン-リジン-アルギニン-リジン-バリンです

環状RGDペプチド：

アミノ酸の配列は、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-チロシン-グルタミン酸です

DOX：

ドキソルビシン

DR-GNP：

DOX-RGD-GNP、DN-GNP：DOX-NLS-GNP、DRN-GNP：DOX-RGD-NLS GNP

GNP：

金ナノ粒子