多機能金ナノ粒子の効率的ワンステップグリーン合成：標的腫瘍イメージングと治療への応用

概要

金ナノ粒子（GNP）はドキソルビシン（DOX）輸送ベクターとして腫瘍診断・治療に広く用いられてきました。しかし、これらベクター合成プロセスは、まず化学還元法でGNP調製、その後DOXや特定ペプチドと共役化する多段階プロセスであり、工程数多、高コスト、時間消費、調製複雑、後処理煩雑といった共通課題を抱えていました。本研究では、DOXの化学構造に基づくワンステップ戦略でDOX共役GNP調製を初めて提案。さらに、DOX、RGDペプチド、核局在化シグナルペプチド（NLS）が持つ還元性官能基を利用し、わずか30分で多機能GNP（DRN-GNP）をワンステップ合成する便利な合成法を提示しました。散乱イメージングと細胞TEM研究結果は、DRN-GNPがHeLa細胞核を標的とすることを示唆。ヌードマウスへの腫瘍内注射と尾静脈注射での腫瘍抑制率はそれぞれ66.7%と57.7%で、対照群比有意に向上。ワンステップ多機能GNP合成は時間と材料節約のみでなく、グリーンケミストリー発展方向に合致し、近い将来大規模応用基盤を築くものです。結果は本製造戦略が効率的であり、調製DRN-GNPが生理系で良好なコロイド安定性を持ち、子宮頸がん診断・治療用潜在的造影剤と効率的DOX輸送ベクターであることを示唆しています。

はじめに

ドキソルビシン（DOX）は一般的抗がん剤で、血液悪性腫瘍[1]、各種腺がん[2-5]、軟部肉腫[6]など多様ながん化学療法で広く使用されています。しかし、長期高用量DOX投与は薬剤耐性[7]、吐き気[8]、脱毛[9]、急性・慢性毒性[10]を引き起こし、充血性心不全[11]に至る可能性があります。したがって、良好な生体適合性と高薬物載持能力を持つ薬物キャリア開発が極めて必要です。近年、量子ドット[12, 13]、キトサン[14, 15]、シリコンナノ材料[16, 17]、高分子ナノ材料[18-20]、蛍光ナノ粒子[21-24]、金属ナノ材料[25-30]など多くのナノ材料がDOX輸送ベクターとして腫瘍診断・治療用に開発されてきました。これらの中で金ナノ材料は独自の化学的・光学的特性、低毒性、良好な生体適合性、表面修飾制御能により広く用いられています[31, 32]。これまでDOXをGNPに共役化する3つのアプローチがあります。第1にヒドラジン[25]、EDC[26]、pH感受性剤[27]、DCC/NHS系[28]助けでDOXをGNP表面共役化。第2にGNPをDOXと最低24時間インキュベート[29]。第3にGNP表面クエン酸をDOXで置換[30]。これらDOX共役GNPは腫瘍治療に用いられてきましたが、十分な特異性欠如で応用限定的です。最近、El-Sayedグループ[27]がGNPをDOX、RGDペプチド、核局在化シグナル（NLS）ペプチドで機能化。彼らの研究ハイライトは、GNPがRGDペプチド受容体媒介エンドサイトーシスで腫瘍細胞内取り込み、NLSペプチド助けで核内移行、DOXがDNA合成効果的阻害可能にする点です。残念ながら、GNP上にペプチドや薬物を層ごとに共役化するため最低120時間必要、各プロセス最低24時間要しました。上記全手法も多段階、高コスト、複雑調製、後処理等共通課題抱えています。したがって、多機能金ナノ材料合成のためのシンプル迅速手法開発が必要です。

本論文では、DOX化学構造基盤ワンステップ戦略でDOX共役GNP調製を初めて提示。さらに、DOX、RGDペプチド、NLSペプチドを還元剤と安定化剤として用い、GNP製造と同時にこれら3物質をGNP表面に共役化しDRN-GNP形成する便利合成法提示。我々の先行研究[33-35]でRGD等ペプチドが金イオン還元し金ナノ材料製造可能実証済み。NLS N末端をシステイン-システイン-チロシン（CCY）配列修飾しCCYNLS構築可能、金イオン還元しつつNLS標的効果保持[36]。またDOXが塩基性条件下強還元性持つ2フェノール性水酸基（C-6とC-11）有すること発見[37, 38]、金イオン還元しGNP形成可能。同時にDOX抗腫瘍効果は影響受けない可能性、C-7アミノ基とC-9水酸基でDNA挿入するため[39]。一方、ペプチドとDOX上の硫黄、酸素、窒素がGNPと結合しコロイド安定維持[33]。結果、DRN-GNP合成成功、腫瘍イメージング、診断、治療で良好機能（スキーム1）。我々知る限り、DOX、RGD、NLSペプチド共役多機能GNPワンステップ合成法と腫瘍診断・治療応用報告は初。

DRN-GNP合成概略、HeLa細胞取り込み、DRN-GNP腫瘍診断

材料と方法

材料

HAuCl₄·4H₂OをSinopharm Chemical Reagent Co., Ltdから購入。環状RGDペプチド（アミノ酸配列：アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-チロシン-グルタミン酸、c(RGDyE)）と水酸化ナトリウムは参考文献[35]同等。ドキソルビシンをSangon Biotech（上海）から購入。CCYNLSペプチド（アミノ酸配列：システイン-システイン-チロシン-プロリン-プロリン-リシン-リシン-リシン-アルギニン-リシン-バリン、CCYPPKKKRKV）をChina Peptides Co., Ltd（上海）から供給。HeLa細胞株とMCF-7細胞株をGuangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd.から提供。胎児牛血清（FBS）とDulbecco改変Eagle培地（DMEM）をGibcoBRL Life Technologiesから購入。増殖・細胞毒性アッセイキット（MTT）をBeijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd.から購入。

DOX-GNP、NLS-GNP、DR-GNP、DN-GNP、DRN-GNP合成

DOX-GNP調製：DOX溶液（0.2 mg/mL、1.0 mL）をクロロ金酸溶液（0.86 mM、1.0 mL）に磁気攪拌下添加、NaOH（2 M、5 μL）添加しpH調整。NLS-GNP調製：CCYNLSペプチド溶液（0.5 mM、1.0 mL）をクロロ金酸溶液（3.44 mM、1.0 mL）に磁気攪拌下添加、NaOH（2 M、20 μL）添加しpH調整。DR-GNP調製：DOX溶液（0.2 mg/mL、1.0 mL）とRGDペプチド溶液（1.0 mM、1.0 mL）をクロロ金酸溶液（1.72 mM、2.0 mL）に磁気攪拌下添加、NaOH（2 M、15 μL）添加しpH調整。DN-GNP調製：DOX溶液（0.2 mg/mL、1.0 mL）とCCYNLSペプチド溶液（0.5 mM、1.0 mL）をクロロ金酸溶液（1.72 mM、2.0 mL）に磁気攪拌下添加、NaOH（2 M、20 μL）添加しpH調整。DRN-GNP調製：DOX溶液（0.2 mg/mL、1.0 mL）、CCYNLSペプチド（0.5 mM、1.0 mL）、RGDペプチド（1.0 mM、1.0 mL）をクロロ金酸溶液（1.72 mM、3.0 mL）に磁気攪拌下添加、NaOH（2 M、35 μL）添加しpH調整。全反応100℃リフラックス系、磁気攪拌下30分継続、pH 10-12。全GNPを55,000 rpm、30分遠心分離（Optima MAX-TL、Beckman Coulter）精製。上清除去後、超純水で再分散。

キャラクタリゼーション

GNPスペクトルキャラクタリゼーションにUV-3150分光光度計（島津、日本）、Nicolet Avatar FTIRモデル330分光計（Thermo、米国）、ESCALab250 X線光電子分光（XPS、参考文献[35]同条件）使用。GNP透過電子顕微鏡（TEM）像をTEM（JEM-2100F、JEOL、日本）、加速電圧200 kVで取得。

動的光散乱とゼータ電位測定

Zeta PALSゼータ電位アナライザー（Brookhaven Instrument Corporation）でDOX-GNP、NLS-GNP、DR-GNP、DN-GNP、DRN-GNP動的光散乱（DLS）測定、90°角、固体レーザー（λ=670 nm）、室温動作。AQ-827電極装備時、GNPゼータ電位測定に使用。

ICP分析

GNP中Au定量分析は参考文献[35]同等。

DR-GNP、DN-GNP、DRN-GNP分散安定性（PBS、HCl、NaOH、NaCl溶液）

沈殿GNP 100 μLと高濃度0.2 M PBS、0.5 M HCl、0.5 M NaOH、1.0 M NaCl溶液各500 μL混合。12時間後写真撮影とUV吸収スペクトル測定。

細胞培養

HeLaとMCF-7細胞を5% CO₂平衡空気湿潤インキュベーター37℃で24時間培養。培地は10% FBS含有DMEM。生細胞数をセルカウントボードで計数。

遊離DOXとDRN-GNP細胞毒性アッセイ

指数増殖期HeLaとMCF-7細胞を96ウェルプレートウェルに約5×10³ cells/well添加、各24時間インキュベート。DRN-GNP濃度0、20、40、60、80、100 μg/mL（対応DOX濃度0.0、7.8、15.6、23.4、31.2、39.0 μg/mL）各ウェル添加、37℃で24時間インキュベート。コントロール群はPBS緩衝液のみ添加、生存率100%設定。MTT（20 μL、5 mg/mL）添加、37℃で約4時間インキュベート。培地慎重除去、ジメチルスルホキシド150 μL各ウェル添加、10分間結晶完全溶解待機。マイクロプレートリーダー（Thermo Multiskan Mk3）で490 nm OD値測定。各群3ウェル準備、平均±標準偏差で値表現。

フローサイトメトリー実験

指数増殖期HeLaとMCF-7細胞を12ウェルプレート2枚各ウェル約5×10⁴ cells/well添加、各24時間インキュベート。DRN-GNP溶液各ウェル添加（最終濃度0、20、40、60、80、100 μg/mL）、37℃で24時間インキュベート。培地除去、EDTA含トリプシン溶液添加し細胞消化。トリプシン除去、培地添加、遠心チューブへ細胞移動。1000 g、5分遠心後、上清除去、各チューブ細胞PBS溶液回収計数。約5-10×10⁴細胞別遠心チューブ移し、再度1000 g、5分遠心。上清除去、アネキシンVバッファー溶液100 μL添加。アネキシンV-FITC 5 μLとプロピジウムヨウ化物5 μL添加、細胞と微弱混合。チューブ暗所室温（20-25℃）15分インキュベート後、フローサイトメーター（BD Accuri C6）測定。

光学暗視野散乱イメージングと細胞培養透過電子顕微鏡研究

HeLaとMCF-7細胞を8穴細胞培養スライド各ウェル約7×10³細胞植え付け。DRN-GNP各ウェル最終濃度35 μg/mL添加。24時間インキュベート後、PBS溶液3回洗浄で物理的・自由吸着GNP除去。4%パラホルムアルデヒド20分固定、グリセリン数滴コート、カバースリップで8穴スライド密封。暗視野顕微鏡（Zeiss Imager Z1）で200倍、反射モード評価。明視野と暗視野露光時間、5 V電圧でそれぞれ1 msと400 ms。

TEM研究用、HeLaとMCF-7細胞をDRN-GNP（35 μg/mL）で24時間インキュベート。インキュベート後、培地とDRN-GNP混合液吸引除去、PBS 3回洗浄、トリプシン消化。細胞を少量DMEM培地含遠心チューブ移動。1500 rpm、10分遠心、DMEM慎重吸引、3%グルタルアルデヒド溶液（通常材料体積40倍）慎重添加、チューブ底部細胞1時間以上固定。1%四酸化オスミウム1時間追加固定、エタノール脱水、Spurr（Sigma-Aldrich、米国）包埋。チューブから細胞取出、切片化、酢酸ウラニルとクエン酸鉛水溶液染色、銅グリッド（300メッシュ）マウント。FEI TECNAI-12透過電子顕微鏡（作動電圧120 kV）で試料測定。

動物実験

動物被験体

胸腺欠損雌性ヌードマウスを南方医科大学動物実験センター（中国広州）から購入、in vivo腫瘍治療試験用。全動物実験は中華人民共和国衛生部動物管理規則（文書番号55、2001）と中国薬科大学実験動物飼育使用指針準拠実施。

腫瘍保有マウスでの遊離DOXと共役体治療効果

簡潔に、36匹ヌードマウス（5-6週齢、16-18 g）ランダム6群分割。右腋窩へHeLa細胞（5×10⁶ cells、PBS懸濁）皮下注射。5日後、コントロール群マウス尾静脈生理食塩水（0.154 mol/L、0.2 mL）注射。遊離DOX、DR-GNP、DN-GNP、DRN-GNP群マウスも尾静脈注射。DRN-GNP抗腫瘍効果を静脈注射と腫瘍内注射比較ため、等量DRN-GNP腫瘍部位注射群設定。これ5群各マウス遊離或共役DOX換算0.3 mg/kg用量維持。各マウス尾静脈或腫瘍内注射毎日1回。体重と腫瘍体積毎日14日間モニター。DOX、DR-GNP、DN-GNP、DRN-GNP治療効果更調査ため、14日治療後6群腫瘍摘出病理解析。腫瘍と心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓内臓器マウスから分離、10%中性緩衝ホルマリン固定、パラフィン包埋。腫瘍組織薄切片ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色、オリンパス光学顕微鏡観察。

結果と考察

DOX-GNP、NLS-GNP、DN-GNP、DR-GNP、DRN-GNP合成とキャラクタリゼーション

DOX-GNP合成時、DOXとクロロ金酸混合溶液にNaOH溶液添加すると溶液色即座に橙色から浅紫色変化、100℃リフラックス系磁気攪拌下1分でワインレッド変化、DOX-GNP形成示唆。結果はDOX還元能力極めて強いこと示す、DOXが塩基性条件下強還元性持つ2フェノール性水酸基（C-6、C-11）有するため。

DOX橙赤色とGNPワインレッド色混同回避のため、UV吸収スペクトルキャラクタリゼーションで更証拠提示（図1a）。DOXは485 nm付近特性吸収ピークと530 nmピーク有する。しかし、生成物溶液スペクトルで480 nmピーク消失、GNP特性表面プラズモン共鳴（SPR）吸収ピーク520 nm出現。それでもGNP形成は520 nm（GNP）と530 nm（DOXピーク）間で未完全決定。高速遠心分離でGNP沈殿、DOX分子沈殿せず考慮し、遠心チューブ底部生成物に紫色沈殿観察（図1a(3-4)インセット）、DOXにはなし（図1a(1-2)インセット）。

a DOXと調製DOX-GNP UV-Vis吸収スペクトル、インセット（a）はDOX（1,2）とDOX-GNP（3,4）遠心前（1,3）後（2,4）画像。b DOX-GNP TEM像。c DOXと調製DOX-GNP FTIRスペクトル。d DOX-GNP XPSスペクトル

DOXは365 nm紫外線照射下赤色蛍光示す。しかしGNP合成後DOX蛍光消失。2理由想定：第1にGNP消光係数極強、GNP表面近接（<5 nm）分子蛍光クエンチ傾向[40]。距離20 nm以上ならナノ粒子プラズモン場遠く蛍光信号クエンチせず[41]。第2にDOX蛍光基が還元剤役割後破壊可能性。図1c示すように、DOX-GNP赤外吸収ピーク数DOX比有意少ないが、DOX多く特性保持：2910 cm⁻¹（C-H伸縮振動）[42]、1631 cm⁻¹（カルボニル伸縮振動）[43]、1114 cm⁻¹（C-O、C-N伸縮振動）[44]、867 cm⁻¹（N-H、C-H面外曲げ振動）[45]等代表ピークDOX-GNPスペクトルでも表示、DOXがDOX-GNPに成功結合示唆。興味深く、1214 cm⁻¹（フェノール性水酸基C-O伸縮振動特性ピーク）[46]がDOX-GNPスペクトルで消失。フェノール基がAuイオン還元しGNP形成後、カルボニル基へ転移。DOX効果影響なしと推測、C-7アミノ基とC-9水酸基でDNA挿入するため[39]。

TEM結果（図1b）でDOX-GNP粒子径約6 nm観察。DOX-GNP XPSスペクトル（図1d）からAu(I)計算比31.93%、コロイド安定維持十分高値。しかし、DOX-GNP沈殿高速遠心後上清除去、0.2 M PBS緩衝液分散時、溶液色紫黒色変化、不溶性フロック可視。DOX-GNP安定性が高塩濃度環境で不良示唆。DOXはアミノ基1つのみでチオール基持たず、Au-SとAu-N結合でGNP表面接続十分でないため説明可能。DOX-GNPを造影剤と抗腫瘍材料として腫瘍イメージング治療用いるには更努力必要。

DRN-GNPをDOX、RGDペプチド、NLSペプチドを還元剤と安定化剤として合成。RGDペプチドはα_vβ₃インテグリン過剰発現腫瘍細胞特異的標的化、NLSペプチドは核特異的標的化可能。図2aに調製DOX-GNP、NLS-GNP、DRN-GNP UV-Visスペクトル示す、表面プラズモン吸収ピーク特性520-530 nm[33]。インセットでGNP明るいワインレッド色確認。TEM像（追加ファイル1: Figure S1）でNLS-GNPとDRN-GNP粒子径約10 nmと5 nm、GNP均一分布、明顕凝集なし。

a 調製DOX-GNP（a）、NLS-GNP（b）、DRN-GNP（c）UV-Visスペクトルと写真像。b 基本DOX、RGDペプチド、NLSペプチド、DRN-GNP上清UV-Vis吸収スペクトル。c NLSペプチド、NLS-GNP、DRN-GNP FTIRスペクトル。GNPスペクトルとNLSペプチドスペクトル距離拡大しコントラスト明確化

NLS-GNPとDRN-GNP合成検証ため、NLSペプチドとGNP FTIRスペクトルキャラクタリゼーション（図2c）。NLSペプチドFTIRピークがNLS-GNPとDRN-GNPスペクトルで発見：C-H伸縮振動吸収ピーク（2840-2972 cm⁻¹）[47]、C=O伸縮振動吸収ピーク（1630-1700 cm⁻¹）[48]、=C-H面内曲げ振動ピーク（1300-1475 cm⁻¹）[49]；CCYNLSペプチドGNP表面共役成功示唆。また、NLSペプチドチロシン末端ベンゼン骨格振動ピーク1529 cm⁻¹とフェノール性水酸基C-O伸縮振動ピーク1193 cm⁻¹[49]がNLS-GNPとDRN-GNP赤外スペクトルで消失、チロシン末端ベンゼン骨格が還元剤役割後キノン構造転移意味。

DRN-GNP高速遠心分離、上清液回収（ほぼ無色）、UV-Visスペクトルで残留反応物有無検証（図2b）。RGDとNLSペプチドUV吸収ピークはチロシン残基由来、吸収ピーク275 nm位置。しかしアルカリ条件下フェノール性水酸基負酸素イオン化、ベンゼン環電子密度増加、ピーク赤方偏移292 nm。DRN-GNP上清UV-Visスペクトルで特性ピーク見られず、両ペプチド反応参加示唆。DOXは450-600 nm範囲3吸収ピーク有するがDRN-GNP上清にそれらピークなし。またDOX上清で検出されず、色薄茶色だが塩基性条件下DOX色透明薄紫色。3物質ほぼ完全反応結論。同様にDR-GNPとDN-GNPもこの方式で説明可能、追加ファイル1: Figure S2参照。

NLS-GNPとDRN-GNP Au価数XPS分光法検証。図3a, b示すように、約83.6 eVと87.0 eV結合エネルギー2ピーク、Au 4f_7/2と4f_5/2光電子放出整合[33]。両GNP Au 4f_7/2結合エネルギー位置ほぼ84.0 eV。NLS-GNPではAu(0)（83.5 eV）とAu(I)（84.1 eV）に脱畳み込み可能、ピーク面積比それぞれ57%、43%。同様にDRN-GNPではAu(0)（83.6 eV）とAu(I)（84.4 eV）、ピーク面積比62%、38%、Au(I)比率高い。電荷がAu(I)-S錯体形成、GNPコロイド安定維持助け。興味深く、NLS-GNP、DN-GNP、DRN-GNP XPSスペクトルで3タイプS同定（追加ファイル1: Figure S3）。青と黒曲線硫黄酸化状態、紫曲線S-H結合、緑曲線Au-S結合表す。Au-S結合形成でNLSペプチドこれら3GNP表面共役成功示唆。

（a）NLS-GNP、（b）DRN-GNP Au 4f XPSスペクトル。元スペクトル（黒）とフィット結果（赤）Au 4f_7/2結合エネルギー、Au(0)-青曲線とAu(I)-紫曲線2成分脱畳み込み可能。DRN-GNP PBS、NaCl、NaOH、HCl分散UV-Vis吸収スペクトルと像（c）

さらに、N 1s、C 1s、O 1s XPSスペクトルピークでペプチドとDOXがGNP付着示唆（追加ファイル1: Figure S4）。

XRDスペクトル（追加ファイル1: Figure S5）でこれらGNP結晶構造面心立方晶構造示す、全XRDスペクトルが38.2°、44.5°、64.7°、77.8°4ピーク含有、それぞれ(111)、(200)、(220)、(311)面対応[33]。

DRN-GNP安定性

これら5GNP動的光散乱（DLS）とゼータ電位データを表1表示。水溶性GNPコア周囲一定量水和分子存在でTEMキャラクタリゼーションより水力学的サイズ大。ゼータ電位負値、GNP表面共役カルボキシル基起因。GNP溶液ゼータ電位絶対値30 mV超で良好コロイド安定性示す、絶対値大きいほど安定性良好。表1から全て良好コロイド安定性有すること確認。比較でNLS-GNPゼータ電位絶対値最高、表面NLSペプチド満ちチオール基経由強力Au-S結合形成ためと推測。DOX-GNPゼータ電位絶対値30 mV近接、前記DOX-GNP PBS緩衝液分散時不安定と整合。スペクトルデータ追加ファイル1: Figure S6表示。

GNP特性表面プラズモン共鳴（SPR）バンド変化でGNP凝集判定可能、UV-Vis分光法利用[49]。DRN-GNP高塩（1 M NaCl、0.2 M PBS）、強酸（0.5 M HCl）、強塩基（0.5 M NaOH）溶液分散時UV-Visスペクトル測定と写真撮影（図3c）。HCl溶液除き全条件で溶液色変化なし、UV-Visスペクトルシフトなし。HCl溶液で色微紫色変化、紫外吸収ピーク約20 nm赤方偏移、強酸条件下GNP微凝集意味。理由は負帯電GNPコロイド安定性強酸条件下影響受けるが、中性PBS緩衝液とアルカリ環境では影響なし。DRN-GNP高塩とアルカリ条件下高安定性結論、調製DRN-GNPがin vitro細胞イメージングとin vivo抗腫瘍治療用途期待可能示唆。

腫瘍細胞プラズモニック暗視野散乱イメージングと細胞TEM顕微鏡

DRN-GNP特異的標的腫瘍細胞イメージングため、HeLa細胞テスト群、MCF-7細胞コントロール群選択。HeLa細胞がインテグリンα_vβ₃過剰発現[50]、MCF-7細胞発現せず[51]、RGD特異的結合なし、良好コントロール群。これら2細胞株DRN-GNP取り込み、最終濃度35 μg/mL、24時間インキュベート後、直立蛍光顕微鏡暗視野モード評価。GNP非処理細胞プラズモニック光散乱なし（図4 A-HeLa、5C-MCF-7）。DRN-GNP処理HeLa細胞像でGNP散乱信号核局在化強く観察（図4b、5e）。一方、DRN-GNPインキュベートMCF-7細胞で散乱光殆ど観察不可、微量GNPが腫瘍細胞受動的EPR効果（enhanced permeability and retention effect）で侵入可能性あっても同実験条件下明確検出困難（図4d、5f）。EPR効果は正常組織と解剖学的病理生理学的差異関連固形腫瘍独自現象、血管新生で固形腫瘍高血管密度、腫瘍血管内皮細胞間大きギャップ、高分子薬物選択的 extravasationと保持示す[52]。結果はHeLa細胞エンドサイトーシスがGNP表面RGDペプチドで受容体媒介型促進、NLSペプチドも活性維持し核特異的標的化可能示唆。合成DRN-GNPが腫瘍標的イメージング潜在的造影剤になり得ること実証。

行内容：「PBS buffer」はPBS緩衝液インキュベート細胞、「DRN-GNP」はDRN-GNPインキュベート細胞。添字「1」明視野細胞像、「2」暗視野細胞像、「3」重ね合わせ像（明視野+暗視野）。全スケールバー20 μm。E画像図4 B₃小領域、F画像図4 D₃小領域、スケールバー10 μm

DRN-GNP 24時間インキュベートHeLaとMCF-7細胞TEM像。A₁、A₂、A₃ HeLa細胞対応、B₁、B₂ MCF-7細胞対応

表2に同一画像内細胞濃度平均グレー値と背景比示す、DRN-GNP取り込み量正相関。PBSインキュベート細胞とMCF-7細胞比約1.0、細胞輝度背景近接。DRN-GNPインキュベートHeLa細胞比4.80、合成DRN-GNPがインテグリンα_vβ₃過剰発現腫瘍細胞特異的標的化・侵入可能示唆。

DRN-GNP受容体特異的内部化確認ため、TEM技術利用しHeLaとMCF-7細胞DRN-GNP細胞取り込み調査（図5参照）。α_vβ₃陽性HeLa細胞核と細胞質領域に大量DRN-GNP局在化確認（図5(A₁-A₃)）。一方、α_vβ₃陰性MCF-7細胞細胞質領域に微量粒子のみ検出（図5(B₁-B₂)）、EPR効果受動標的蓄積可能性。MCF-7細胞核高コントラスト黒連続領域観察、酢酸ウラニル核染色、HeLa細胞核粒状粒子と異なる。TEM像は暗視野イメージング結果と整合、GNP表面RGDとNLSペプチドがDRN-GNP HeLa細胞核標的化促進示唆。合成DRN-GNPが腫瘍標的イメージングと診断完璧造影剤として使用可能実証。

細胞レベル治療効果評価

DOXとDRN-GNP細胞レベル治療効果評価ため、MTTアッセイでHeLaとMCF-7細胞これら2サンプル24時間処理後生存率調査。DRN-GNP同DOX濃度（39.0 μg/mL、図6(A, B)）で約70%細胞殺傷、ほぼ同等阻害効果示す。MTT結果踏まえ、DRN-GNP濃度40 μg/mLでHeLaとMCF-7細胞数と状態比較的良好、35 μg/mLがイメージング適正濃度。DRN-GNP濃度60 μg/mL高濃度時（図6(C₃)）、HeLa細胞明確壊死観察。100 μg/mL時、細胞数顕著減少、壊死特徴明確な細胞形態変化観察。同濃度共役DOXも遊離DOXほぼ同等抗腫瘍効果示す。結果は合成DRN-GNPが造影剤のみでなく優良薬物送達系としても使用可能示唆。

MTTアッセイでDOXとDRN-GNP HeLa（a）とMCF-7細胞（b）24時間in vitro抗腫瘍活性定性表示（100%）。C₀-C₅濃度DRN-GNP 0、20、40、60、80、100 μg/mL、対応DOX濃度0、7.8、15.6、23.4、31.2、39.0 μg/mL。データ三重測定（n=3）平均±標準偏差表現。異なる濃度DRN-GNPインキュベートHeLa細胞像（c）

フローサイトメトリー検出結果（図7）もDRN-GNP抗腫瘍効果実証。HeLa細胞DRN-GNP異濃度曝露時生存率フローサイトメトリーベースアッセイ測定。アネキシンV-FITCとプロピジウムヨウ化物（PI）染料でアポトーシスと壊死2細胞死モード測定（図7）。MTTアッセイ結果同様、データはDRN-GNP誘導細胞壊死用量依存性示す。DRN-GNP非インキュベート時壊死細胞比8%、濃度100 μg/mL高濃度時壊死細胞比23.84%、合成DRN-GNPがHeLa細胞効率的殺傷可能示唆。MTTとフローサイトメトリー結果差は細胞数と手法差説明可能。

DRN-GNP異濃度（0-100 μg/mL）24時間曝露時生存、アポトーシス、壊死細胞割合決定代表的二次元等高線密度プロット。細胞壊死とアポトーシスPIとアネキシンV-FITC染料測定

腫瘍保有マウスDRN-GNP治療評価

DRN-GNPがin vivo腫瘍細胞複合治療効果誘導か判定ため、長期静脈注射薬物で腫瘍保有マウス抗腫瘍効果評価。生理食塩水群と遊離DOX、DR-GNP、DN-GNP静脈注射群コントロール群設定、共役DOX濃度遊離DOX同等。DRN-GNP処理群腫瘍サイズが生理食塩水、DOX、DN-GNP、DR-GNP処理群比明確小さい観察（図8a）。マウス腫瘍体積と体重2日毎モニター。全処理群間腫瘍体積と腫瘍重量有意変動図8d, f示す；DN-GNPとDR-GNP処理群腫瘍体積と重量遊離DOX処理群より小さいが、標的活性低いためDRN-GNP処理群より大きい。理由はDOX分子小さく標的性欠如、in vivo半減期短く速やかクリアランス可能性。一方DRN-GNP血液系強安定性、長半減期、高標的能有し、腫瘍部位標的到達後DOX抗腫瘍効果発揮。DRN-GNP静脈注射群と腫瘍内注射群比較で後者抗腫瘍効果優位、薬物複雑血液循環系経ず病巣到達ため。DOX腫瘍抑制率50%未満、全DOX共役GNP50%超、最大66.7%と57.7%達成。HE染色結果で静脈注射DRN-GNP群肝臓器一定程度損傷観察（図9）。さらにDOX、DR-GNP、DN-GNP腫瘍保有マウス生体毒性組織学的解析評価。図8b示すように生理食塩水群腫瘍細胞体積比較的大、有糸分裂像多発。全結果でDRN-GNP腫瘍抑制効果GNP中最良示す。合成DRN-GNPが腫瘍治療完璧DOX送達システムとして使用可能実証。

a 治療後腫瘍保有マウス摘出腫瘍像：生理食塩水、遊離DOX、DN-GNP、DR-GNP、DRN-GNP（腫瘍内注射と静脈注射）。b マウス治療後腫瘍組織像：生理食塩水、遊離DOX、DN-GNP、DR-GNP、DRN-GNP（腫瘍内注射と静脈注射）。c 体重、d 腫瘍体積、e 腫瘍抑制率、f 腫瘍重量、14日間治療中；データ平均±標準偏差（n=6）表現

治療後マウス主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）組織像：生理食塩水、遊離DOX、DR-GNP、DN-GNP、DRN-GNP（腫瘍内注射と静脈注射）

結論

本研究で約30分で多機能DRN-GNP調製ワンステップ法開発成功。GNPはin vitroとin vivo両方で腫瘍標的イメージングと腫瘍治療に成功応用。成功はDOX、RGDペプチド、CCYNLSペプチド還元・安定化能力フル活用可能示し、GNP合成プロセスシンプル効率化実証。より重要なのは、ワンステップ合成DRN-GNPが生理系で良好コロイド安定性保持、表面共役ペプチド標的能保持、DOX抗腫瘍能力保持。我々知る限り、DOX、RGD、CCYNLSペプチド共役多機能GNPワンステップ合成法と腫瘍イメージング、診断、治療応用報告初。この戦略はグリーンケミストリー発展方向合致、近い将来大規模応用基盤築く。本報告が腫瘍イメージング治療用多機能ナノ材料ワンステップ合成新たな道提供すること期待。

データと材料の利用可能性

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略語

CCYNLSペプチド:

アミノ酸配列：システイン-システイン-チロシン-プロリン-プロリン-リシン-リシン-リシン-アルギニン-リシン-バリン

環状RGDペプチド:

アミノ酸配列：アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-チロシン-グルタミン酸

DOX:

ドキソルビシン

DR-GNP:

DOX-RGD-GNP、DN-GNP: DOX-NLS-GNP、DRN-GNP: DOX-RGD-NLS GNP

GNP:

金ナノ粒子