PEGコーティングコバルトフェライトナノ粒子とナノスフィアの比較毒性評価

概要

ポリエチレングリコール（PEG）コーティングコバルトフェライトナノ粒子とナノスフィアの毒性比較研究を報告します。ナノ粒子は水熱法、ナノスフィアは溶媒熱法で調製。ナノ材料表面をPEGで修飾しました。調製試料の形態解析にX線回折（XRD）、フーリエ変換赤外分光（FTIR）、ラマン分光、熱重量分析（TGA）、電子顕微鏡手法を用いました。構造解析により、直径20-25 nmの多結晶コバルトフェライトナノ粒子と80-100 nmのナノスフィア形成を確認。クンミンSPFマウス（雌、6-8週齢）を用い、コバルトフェライトナノ粒子とナノスフィアによるマウス各臓器毒性を調査。生物分布、生化学指標、病理組織学的評価、炎症因子、酸化・抗酸化レベル、細胞毒性試験を実施し毒性を評価。コバルトフェライトナノスフィアの方がナノ粒子より毒性が強く、クルクミンがPEGコーティングコバルトフェライトナノ材料によるマウス毒性に対する優れた治癒薬剤であることが証明されました。

序論

近年、磁性ナノ材料は基礎研究と技術応用の両面で大きな関心を集めています。応用には薬物送達ビークル、磁気共鳴画像（MRI）、ハイパーサーミア、バイオセンサー、細胞分離、タンパク質分離、遺伝子マグネトフェクション、環境汚染浄化などが含まれます。硬磁性材料であるコバルトフェライトはMRI造影剤、標的薬物送達、ハイパーサーミア加熱媒質として使用されます。しかし生物医学応用では、溶液中へのコバルト溶出による高毒性、溶液中凝集、界面活性剤使用時の表面アクセス不良といった制約があります。これらは生体適合性、無毒、水中安定・分散性材料による表面修飾で克服されてきました。またコバルトフェライト製造は容易かつコスト効率良く、用途に合わせた組成・形状・サイズ制御が可能です。ナノサイズコバルトフェライト合成法には機械化学、ソノケミカル、共沈殿、マイクロエマルジョンなど多様な手法があります。またクルクミンをテンプレートとした単段階エコフレンドリー法で調整可能な蛍光銅ナノクラスター合成も報告されています。これら手法の主欠点は調製材料の低結晶性で、磁気特性劣化を招きます。この点で水熱法と溶媒熱法は制御された形態と結晶性でコバルトフェライト合成に最も効果的・効率的です。

文献では銀ナノ粒子（Ag NPs）が抗菌治療・感染症や薬物送達ナノビークルとして、フェレートが廃水から多様な化学・生物種除去に用いられることが報告されています。コバルトフェライトナノ材料生物医学応用での主問題は臓器蓄積による体内毒性で、蓄積ナノ材料の緊急除去と損傷治癒が必要です。複数研究者が抗炎症薬でナノ材料誘導毒性軽減を研究。クルクミンは抗酸化、抗変異、抗腫瘍、発癌特性を持ち、コバルトフェライトナノ材料毒性の治癒薬として利用可能。TNFに直接結合し、インビトロ・インビボでTNFブロッカーとして機能します。

本研究目的は、制御された形態でPEGコーティングコバルトフェライトナノ粒子とナノスフィアを実験室で作製し、異なる用量をマウス静脈投与し、血液解析、生物分布、HE染色、細胞生存率検討で毒性評価。ナノ粒子とナノスフィア毒性を比較し、クルクミンをナノスフィア毒性治癒薬として使用。コバルトフェライトナノスフィアは拡大表面積によりナノ粒子より毒性・反応性が高いことを示しました。我々の知識では、この種の詳細研究は初めてです。

材料と方法

ナノ材料調製

PEGコーティングコバルトフェライトナノ粒子には水熱法を採用。塩化コバルト（0.2 M）と硝酸鉄（0.4 M）をそれぞれ脱イオン（DI）水25 mLに溶解、これらをポリエチレングリコール（2.5 mM）水溶液25 mLと水酸化ナトリウム（3 M）水溶液25 mLと混合。20分撹拌後ステンレス鋼（SS）オートクレーブに移し、180℃で6時間加熱。完了後室温冷却、DI水とエタノールで2-3回洗浄し不純物除去。80℃で一晩乾燥後微粉砕して目的のコバルトフェライトナノ粒子を得ました。

PEGコーティングコバルトフェライトナノスフィアには溶媒熱法を使用。塩化コバルト六水和物をエチレングリコール（2.5 mM、40 mL）に溶解、塩化鉄六水和物1.35 gとPEG 1 gを添加。30分撹拌後テフロンライニングSSオートクレーブに密封。200℃で8時間加熱、反応完後室温冷却。DI水とエタノール洗浄、80℃一晩乾燥、微粉砕して直径80-100 nmのPEGコーティングコバルトフェライトナノスフィアを得ました。調製ナノ材料形態をXRD（文献[50]法）、走査・透過電子顕微鏡（SEM/TEM、文献[50,51]）、室温FTIR分光（文献[51]類似）、ラマン分光、熱重量分析（TGA、文献[52]）で調査。

ナノ材料放射性標識

PEGコーティングコバルトフェライトナノ粒子とナノスフィアをスズ化第二錫（SnCl₂）還元剤で^99mTc標識（文献[53-55]）。新鮮^99mTcO₄ジェネレーター溶出液（50 μL、活性~4 mCi）を30 μL SnCl₂懸濁液（1 mg/mL、0.5 N HCl）に添加調製。NaHCO₃溶液（1 M）で懸濁液pHを8-10に調整。ナノ粒子とナノスフィア懸濁液（各40 μL、コバルトフェライト~0.4%wt）をSnCl₂（50 μg）、アスコルビン酸（10 mg/mL）、^99mTcO₄懸濁液と混合。10,000 rpm、80℃で25分撹拌。^99mTc半減期短い（~6時間）ため24時間以内に放射能カウント記録。遠心分離後上清除去、残留物を^99mTc-PEG-コバルトフェライトナノ粒子/ナノスフィアと同定。紙クロマトグラムで標識化合物放射化学収率測定、65%以上でマウスインビボ生物分布を実質反映。

ナノ材料生物分布

図1示す通り、クンミンSPFマウス（雌、6-8週齢、体重18-20 g）を蘭州大学医学実験センターから入手。21-22℃温度管理ケージ、照明08:00-20:00、自由摂食・給水。全米医学研究会実験動物ケアプロトコルとNIHガイドラインに従い取扱い。マウスを無作為に複数群分け（各群5匹）、^99mTc-PEG-コバルトフェライトナノ粒子/ナノスフィア溶液を静脈投与、1, 6, 16, 24時間後に屠殺。心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓組織を即座に摘出、箔包み、秤量、ガンマカウンターで各組織^99mTc放射能測定。マウス各臓器ナノ材料生物分布を投与量%/湿重量g（% ID/g）で表示。

ヘマトキシリン・エオシン染色

パラフィン切片をキシレンで脱蝋（10分×2回）。エタノール濃度勾配（100%、95%、70%、各2分）で水和。流水2分すすぎ。ヘマトキシリン染色液で60℃ 10秒、室温1分染色、流水5分。作業用エオシンY溶液で2分染色、95%と100%エタノールで脱水（各2分）。エオシン染色液15秒浸漬で細胞質染色7秒、除去後流水洗浄、無水エタノール2回脱水（各1分）。キシレン15秒で透明化、中性ガム封入、オリンパスMicrophot-CX41顕微鏡+デジタルカメラで観察撮影。

生化学指標と炎症因子

PEGコーティングコバルトフェライトナノ粒子とナノスフィア250 μgを暴露群マウス静脈投与、対照群は生理食塩水（0.9%）、24時間後屠殺。採血、10分遠心で血清分離。血清総ビリルビン（TB）、ALT、AST、BUN、CREA、Cys-CをELISAとウェスタンブロットで測定。肝臓関連酵素IL-6、IL-8、TNF-αは壊死誘導炎症応答で重要役割、高発現は臓器炎症応答示唆。

MTT細胞生存率アッセイ

PEGコーティングコバルトフェライトナノ粒子とナノスフィアの細胞毒性ポテンシャルをMTT法（細胞代謝活性評価色素定量アッセイ）で測定。ヒト上皮細胞L-132とヒト単球THP-1（上海購入）をナノ粒子30-125 μg/mL、ナノスフィア50-250 μg/mL濃度範囲で暴露、590 nm吸光度測定（UNICO WFZ UV-2000、上海）。L-132選択理由：吸入がナノ材料曝露主要経路。THP-1選択理由：異物除去役割。各アッセイで未処理細胞を陰性対照。酵素活性阻害を観察、未処理（陰性対照）比で値算出、ナノ粒子/ナノスフィア濃度に対する比としてプロット。

統計解析

各データポイントは三重実験平均値（±SEM）で報告。差の有意性を分散分析で評価、OriginとMicrosoft Excelで統計チャート作成。

結果と考察

構造解析

調製ナノ材料構造解析（XRD、FTIR、ラマン、TGA）を図2に示す。図2a XRD結果はコート/アンコートコバルトフェライトナノスケールで、コバルトフェライト合成成功確認。観測ピーク位置と相対強度はコバルトフェライト結晶性確認。追加ピークなしで純度確認。シャーラー式（文献[56]）で平均結晶子サイズ~24 nm算出。FTIR分光（室温、図2b）でコバルトフェライト中陽離子分布（ニッケル、コバルト、鉄）調査。理論的にコバルトフェライトは400-600 cm^-1範囲に2強吸収帯（ν₁、ν₂）とその他少数ピーク。全ピークデータに明確出現。ν₁は四面体サイト金属固有伸縮振動、ν₂は八面体サイト金属イオン伸縮振動に対応（文献[57-59]）。3421 cm^-1ピークはPEGに対応、コバルトフェライト表面へのPEG結合成功示す。室温ラマン分光（図2c）で5ピーク観察。700 cm^-1未満ピークはコバルトフェライト主特性ピーク（A_1gモード）、四面体サイトFe-O結合酸素イオン伸縮対応（文献[60]）、他ピークもコバルトフェライト帰属。PEG-コバルトフェライト合成成功確認。図2d TGA結果（50-380℃）でコバルトフェライトが異温度で重量減少。PEG熱安定性相対的低い一方、PEG-コバルトフェライトは高いことも明確。

電子顕微鏡解析を図3に示す。図3(a)(b)はPEGコーティングコバルトフェライトナノ粒子とナノスフィアSEM像、(c)(d)はナノスフィアとナノ粒子TEM像。平均サイズ：ナノ粒子~25 nm、ナノスフィア80-100 nm。ナノスフィアTEM像から、多数の小ナノ粒子で構成され大表面積持ち、メソポーラス構造であることが明確。医療用薬物担持ビークルとして高望ましい。全構造解析で純粋相PEGコーティングコバルトフェライトナノ粒子とナノスフィア形成成功確認。

生物分布試験

PEGコーティングコバルトフェライトナノ粒子とナノスフィアの血液、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓への生物分布を経時的（1, 6, 16, 24時間）に定量評価（図4）。^99mTc-PEG-コバルトフェライト溶液静脈投与後24時間以内に血液と他臓器への存在評価。ナノスフィア（図4a）では曝露1時間後血液残留6.5±0.33% ID/g、以降経時的に減少。ナノスフィアは主に心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓に分布、最も脾臓に蓄積。各臓器生物分布は1時間後最高、以降漸減、6時間後30%未満。ナノ粒子（図4b）では曝露1時間後血液残留2.8±0.14% ID/g、体内血液プールからの放射性物質クリアランス比較的速く、以降経時減少。ナノ粒子は心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓分布、脾臓と肝臓で最大濃度。1時間後最高、6時間後漸減、24時間後最低値。ナノスフィアとナノ粒子生物分布比較：PEGコーティングコバルトフェライトナノスフィアの血液と他臓器蓄積/存在量がナノ粒子より多い。これはナノスフィアの大きな表面積と高多孔性がナノ粒子比で大きく、ナノ材料生物学的システムとの相互作用反応性決定の重要因子であるためと考えられる。ナノ粒子は非メソポーラスで比表面積低く、同条件下でナノスフィアより低反応性。これら特徴がマウス血液と臓器でのPEGコーティングコバルトフェライトナノ粒子抵抗性低下に関与。さらにナノスフィアは生体分子と複合体形成、ラジカル種レベル増加、酸化ストレス増大、細胞DNA損傷、脂質過酸化による酸化ストレス誘導。

生化学指標

PEG-コバルトフェライトナノ粒子とナノスフィアのマウス毒性効果研究のため生化学指標測定、結果図5。ALT、AST、BUN、CREA、TB、Cys-Cを対照群と暴露群マウスで測定。SPSSソフトでデータ抽出、*P<0.05で有意変化。ナノスフィアとナノ粒子両方で全生化学指標が対照群比有意変化（*P<0.05）。ナノスフィア暴露群ではALT、AST、BUNが対照群比有意差（*P<0.05）、ナノ粒子暴露群ではCys-Cのみ有意差（*P<0.05）。腎機能バイオマーカー主役のTBとCys-Cがナノスフィアで有意低下、腎臓がナノ粒子比でナノスフィア曝露により強く影響受ける示唆。肝機能バイオマーカーASTが両ナノ粒子とナノスフィア曝露で影響大、コバルトフェライト曝露が肝機能悪影響及ぼす示唆。全結果からPEG-コバルトフェライトナノスフィアがナノ粒子比でマウスインビボにより多く損傷惹起明確。

病理組織学的検討

対照、ナノ粒子、ナノスフィア、治療群マウス病理組織解析を図6に提示。ナノスフィアとナノ粒子暴露群を対照群比較：PEG-コバルトフェライトナノスフィアはナノ粒子暴露群比で肝臓、脾臓、腎臓、肺により多く損傷惹起。腎臓ではナノスフィア摂取群で糸球体充血、軽度浮腫、間質炎症細胞観察、ナノ粒子暴露と対照群より顕著。ナノ粒子では炎症軽度。ナノ粒子暴露では肺比較的軽度影響、ナノスフィアでは肺胞壁肥厚、軽度線維化観察。またナノスフィア暴露群で肝細胞腫脹と浮腫、ナノ粒子暴露群では比較的軽度炎症。

炎症因子と酸化/抗酸化レベル

IL-6、IL-8、TNF-α、MDA、T-AOC発現レベル測定、結果図7。図7a：対照、ナノ粒子、ナノスフィア暴露群IL-6、IL-8、β-アクチンウェスタンブロットバンド。図7b：同群IL-6、IL-8相対タンパク質レベル。図7c-e：TNF-α含量、MDAレベル、T-AOC含量統計チャート（*P<0.05、暴露群vs対照群±SEM）。結果：コバルトフェライトナノスフィア暴露群マウスでIL-6、IL-8、TNF-α、MDAレベルがナノ粒子群より高く、両群とも対照群より高い。T-AOCではナノスフィアレベルがナノ粒子暴露群と対照群より低い。全結果からナノ粒子とナノスフィア両方がマウス炎症誘導、特に肝臓。しかしナノスフィアが臓器により強く影響。ナノ材料体内で酸素フリーラジカル（ROS）生成、抗酸化物質質的還元系列引起こし、生物組織酸化損傷、細胞生物悪影響（文献[61,62]）。ナノ粒子暴露マウスとナノスフィア暴露マウスでIL-6、IL-8、TNF-α、MDA、T-AOC比較：コバルトフェライトナノスフィアがナノ粒子暴露群比でより強い炎症誘導。

細胞毒性評価

異濃度PEGコーティングコバルトフェライトナノスフィアとナノ粒子細胞毒性試験、結果図8。図8(a) L-132細胞生存率%、(b) THP-1細胞生存率%。100 μg/mL以上で両細胞とも有意な生存率変化、ナノスフィアでより顕著。コバルトフェライトナノスフィアがナノ粒子より多く損傷惹起確認。両形態とも濃度増加で細胞生存率低下、濃度依存的毒性増大示唆。2異なる細胞標的（L-132、THP-1）で細胞死機構により応答異なる可能性（文献[63]）。同サイズ粒子でも細胞標的特異性理由は、単球（THP-1）特有の食作用機能、肺上皮細胞にはないこと起因可能（文献[64]）。単一ナノスフィアは多数小ナノ粒子で構成、ナノ粒子比大表面積、生物学的システム（組織）との相互作用機会・反応性大。ナノスフィア大サイズで血液・尿循環で分泌排出困難、臓器内長滞在、組織悪影響。ナノスフィアはマクロファージ機能低下、自食作用低下、遊走能低下、細胞骨格機能不全誘導。

クルクミン毒性軽減効果

ナノスフィア暴露群とクルクミン治療群の血清生化学指標を対照群比較検討（図9）。クルクミン投与後、治療群全指標がナノスフィア暴露群と対照群比で有意改善。図示通りALT、AST、BUN、CREA、CYS-C、TB発現レベルがクルクミン投与後正常値近接。これはクルクミン強力抗酸化特性によりコバルトフェライト毒性誘導酸化ストレス軽減による（文献[47]）。またTNF-αとIL-1が肝壊死誘導重要役割、クルクミンがマクロファージTNF-αとIL-1分泌阻害で毒性効果軽減と報告（文献[48]）、先行研究[65]類似。

結論

本研究で水熱法と溶媒熱法によりPEGコーティングコバルトフェライトナノ粒子とナノスフィアをそれぞれ合成成功。構造解析で高純度、結晶性、PEG結合成功由来の生体適合性確認。コバルトフェライトナノスフィアとナノ粒子両方が生物学的システムに毒性示す。さらにナノスフィアが大きな表面積と生物組織との高反応性によりナノ粒子より強毒性示す。クルクミン投与後生化学指標に陽性変化観察、副作用なき天然化学物質としてコバルトフェライトナノスフィア毒性治癒薬として利用可能確認。