新鮮 vs 経年変化した酸化亜鉛ナノ粒子の細胞毒性を駆動するアポトーシス経路

概要

酸化亜鉛ナノ粒子（ZnO NP）は産業、商業製品、医療分野など幅広い用途で使用されている。ZnO NPの毒性に関する多くの機序的研究は、プリスティン（新鮮な）NPで行われてきた。しかし、変性（経年変化）したZnO NPによる細胞毒性とその基盤メカニズムは不明確なままである。ここでは、ZnO NPが時間経過とともに経験する物理化学的変化を観察し、続いて新鮮および経年変化NPの細胞毒性を評価した。新鮮なZnO NPが経年変化したものより高いアポトーシスレベルを誘導することを見出した。それに応じて、経年変化ZnO NP処理ヒト-ハムスターハイブリッド（A_L）細胞のRNAシーケンシングデータでは、p53、PI3K-Akt、FoxO、グルタチオン、ErbB、HIF-1、オキシトシン、Jak-STATシグナル伝達経路がエンリッチされたが、アポトーシス経路はエンリッチされなかった。定量PCR結果では、IL1BとCD69のmRNAレベルが新鮮NP処理群で経年変化ZnO NP処理群および塩化亜鉛処理群より有意に高かった。以上の結果は、経年変化ZnO NPの低細胞毒性が、アポトーシス誘導能の低下に部分的に起因することを示唆する。経年変化NPにより活性化される複数シグナル経路の転写制御は、細胞ホメオスタシスの確立に寄与する可能性がある。総括すると、本知見はZnO NPの経年変化（環境変性）プロセスがその毒性と生物学的帰結に及ぼす影響を強調する。

はじめに

過去数十年のナノテクノロジーの急速な発展により、ナノ粒子（NP）は産業、人間の日常生活、ナノメディシンなど様々な分野で応用されてきた[1,2]。ナノテクノロジー消費者製品インベントリ（CPI）は、2005年から2015年にかけてナノ製品数が30倍増加し、健康（フィットネス）製品762、食品（飲料）72、ベビー製品23を含むことを示す[2]。消費者製品と様々な分野でのNP応用増加は、NPが環境に放出される可能性を高め、潜在的有害影響に関する安全性懸念を提起している。酸化亜鉛（ZnO）NPは最も一般的に使用されるNPの一つであり、世界年間生産量は約3400トンに達している[3,4]。以前は生物学的に不活性と考えられていた物質が、ナノ粒子状態では毒性を持つ可能性がある。増加する研究が、ZnO NPが哺乳類細胞と動物に著しい毒性を誘導することで重大なリスクをもたらす可能性を明らかにしている[5-7]。

コーティング、表面機能化、酸化状態修飾など、物理化学的特性（溶解、凝集、細胞膜攪乱など）を修飾することでNPの潜在毒性を減衰させる様々な戦略が用いられてきた[8-11]。これらのNP修飾は一定程度毒性を弱めるが、特定の曝露条件と環境下ではNP使用が常に安全とは限らない[12-14]。実際、多くの種類のNPは不安定で、意図的または非意図的に自然環境に放出された後、「経年変化」または「環境変性」を起こしやすい[14-17]。近年、NPの環境変性プロセスを探求する多くの研究が行われたが、「変性（経年変化）した」NPの毒性効果に関する研究は依然として非常に限られており、その毒性メカニズムについてはなおさらである。

非持続性NPの典型的代表として、ZnO NPは非常に高い反応性を持ち、環境に放出されたり動物に摂取されたりした後、物理化学的特性と存在状態で変性しやすく、これが毒性学的効果に著しく影響する可能性がある[17,18]。例えば、ZnO NPの硫化プロセスが電荷、疎水性、凝集状態を変化させ、硫化状態NPがヒト唾液、汗、気管支肺胞洗浄液に吸着されることが示されている。さらに、ZnO NPに吸着したタンパク質が特殊なタンパク質コロナを形成し、通常その生物学的効果に影響する[19]。生理食塩水中のリン酸塩が、ZnO NPを約5-10時間でメタステーブルなZnHPO₄とZn₃(PO₄)₂に変換する[20]。インビトロ曝露システムにおけるヒトTリンパ球（37℃、10% FBS含有RPMI1640培地、24時間）へのZnO NP（≤3μg/mL）の完全変性プロセスが、シンクロトロン放射X線吸収近端構造分光法（XANES）で調査された[21]。以上の研究は、プリスティン（新鮮な）ZnO NPの生物学的効果のみを評価することで、ZnO NPの環境・健康リスクが過小評価されていることを示唆している。この問題を踏まえ、NPの経年変化と環境変性プロセスを包括的に理解する緊急の必要性がある[22]。

以前の研究で、ZnO NPが超純水中で40-120日間経年変化すると物理化学的変化を経て、Zn₅(CO₃)₂(OH)₆、Zn(OH)₂、Zn²⁺に変化することが明らかにされた[23]。興味深いことに、経年変化ZnO NPは新鮮なものより低い細胞毒性を示した[23]が、そのような変化の毒性メカニズムは不明であった。本研究では、新鮮と経年変化ZnO NPの異なる細胞毒性の根本理由を探求することを目的とした。2つの異なる粒子径（20nmと90-200nm）のZnO NPを体系的に適用。細胞毒性アッセイで、経年変化ZnO NPが新鮮なものより顕著でない形態異常と相対的に高い細胞生存率を誘導することを実証。RNAシーケンシングデータで、アポトーシス遺伝子が新鮮ZnO NP処理細胞でエンリッチされる一方、経年変化ZnO NP処理ではこれらの遺伝子ははるかに影響を受けないことを明らかにした。さらに、経年変化ZnO NP曝露細胞では切断カスパーゼ-3タンパク質レベルが低下し、新鮮ZnO NPの培養細胞におけるアポトーシス誘導能がより高いことをさらに示唆。以前の知見と合わせ、本研究は経年変化ZnO NPの細胞毒性低下が、細胞アポトーシス誘発能力の減衰に起因することを示唆する。

材料と方法

ナノ粒子と試薬

市販のZnOナノ粉末（ZnO NP）、メーカー報告平均サイズ20nm（純度99.5%、ほぼ球状）と90-200nm（純度99.9%、不規則形態）をNanostructured & Amorphous Materials（ヒューストン、テキサス）から購入。特に断りがない限り、本研究で使用したすべての試薬と化学薬品はSigma-Aldrich（上海、中国）から購入。

ナノ粒子分散、経年変化、特性評価

ZnO NPストック懸濁液（1mg/mL）を、乾燥ナノ粉末をMilli-Q水（Millipore、18MΩ·cm）に分散させ、オートクレーブ滅菌（120℃、30分）後、25℃で0-60日の自然経年変化期間保存して調製。0日と60日自然変性したZnO NPをそれぞれ新鮮および経年変化NPと指定。適切な分散を確保するため、新鮮および経年変化懸濁液を超音波洗浄機（100W）で30分超音波処理し、特性評価または細胞とのインキュベーション前に使用。新鮮および経年変化ZnO NPの形態、粒子径、凝集を透過型電子顕微鏡（TEM、JEOL JEM-2010、東京、日本）で特性評価。新鮮および経年変化ZnO NPの結晶構造を粉末X線回折（XRD、PANalytical B.V.、上海、中国）で正規標準と比較して決定。ZnO NPの自然経年変化プロセスと特性評価の詳細は以前記述されている[23]。

細胞培養とZnO NP処理

ヒト-ハムスターハイブリッド細胞であるA_L細胞株を使用。これは中国ハムスターオバリー（CHO）のgly2A変異株とヒト線維芽細胞の融合により形成され、標準的なCHO-K1染色体セットとヒト第11染色体の単一コピーを含み、グリシン（2×10⁻⁴M）添加のHam's F12培地（Hyclone、グランドアイランド、NY）に胎児牛血清（8%、Hyclone）、ゲンタマイシン（25μg/mL）を補加し、37℃、5% CO₂湿潤インキュベーターで培養[24]。新鮮および経年変化ZnO NPストック懸濁液を30分超音波処理（100W）で分散させ凝集防止後、細胞培養培地で適切濃度に希釈し細胞曝露に使用。NPなし培地で維持した細胞を各実験の対照とした。

細胞毒性検出アッセイ

対数増殖期のA_L細胞を35mmペトリ皿のガラススライド上（6×10⁴個/皿）で24時間培養後、1、5、10、12、15、20μg/mLの新鮮または経年変化ZnO NPを含む2mL培養培地で72時間処理。処理完了後、Leica DM4B顕微鏡（ライカ、ドイツ）で細胞形態画像を取得。ZnCl₂を亜鉛イオン参照としてZnO NPとの細胞毒性比較に含めた。

細胞生存率検出にセルカウンティングキット（CCK-8）（APExBIO、上海、中国）を使用。詳細には、A_L細胞を96ウェルプレート（4×10³個/ウェル）に培養培地で播種し24時間後、ZnCl₂、新鮮および経年変化ZnO NPの様々な濃度を含む培地で24、48、72時間それぞれ処理。作業液では、各ウェルのストック懸濁液添加量は総培養培地体積の5%未満。処理完了後、培地を除去し、メーカー指示に従い100μL CCK-8作業液で37℃、2時間インキュベート。その後、Spectra Max M2蛍光リーダー（Molecular Devices、ウォキングハム、バークス、英国）で450nm吸光度を記録。細胞生存率を、各NP濃度の吸光度を対照細胞吸光度（100%）で正規化した百分率として計算。

RNA抽出、逆転写、定量PCR

対数増殖期のA_L細胞を35mm径ペトリ皿（6×10⁴個/皿）に培養培地で播種し24時間後、培地を12μg/mL ZnCl₂、新鮮および経年変化ZnO NPを含む2mL培養培地に置換し72時間処理。処理完了後、培地を除去し、PBSで3回洗浄。その後、各皿に1mL Trizol試薬（Invitrogen、カールスバッド、CA、米国）を添加し、メーカー指示に従い総RNA抽出。抽出後総RNAの濃度と純度をQ5000 UV-Vis分光光度計（Quawell、米国）で定量。定量後、TransGene RT-PCRキット（TransGene Biotech、北京、中国）でメーカー プロトコルに従いRNA鋳型からcDNAを得るため逆転写実施。得られたcDNAサンプルをQ5000 UV-Vis分光光度計で定量し、SYBR-Green蛍光色素（TransGene Biotech、北京、中国）を用いてRoche RT-PCRシステム（Applied Biosystems）で解析[25]。

グリセラールデヒド-3-リン酸脱水素酵素をコードするハウスキーピング遺伝子（Gapdh）を内部対照として、Il-1α、Il-1β、Caspase 3、CD69、Jun、MT1 mRNA発現を評価。結果を標的遺伝子とGapdhの相対発現比として表示。本研究で使用したプライマー配列を表1に示す。

RNAシーケンシングデータ解析

対照群、経年変化ZnO NP処理群、ZnCl₂処理群のA_L細胞総RNAサンプルをBangFei Bioscience（北京、中国）でシーケンシング。簡単には、TRIZOLプロトコルに従いA_L細胞総RNAをイソプロパノール沈殿まで抽出。その後、RNAサンプルを抽出バッファーに再懸濁しシーケンシング。生カウントRNAシーケンシングデータをRパッケージDeseq2[Eric1]で解析。ベン図をRパッケージVennDiagram[Eric1.2]で生成。有意変化遺伝子を更なる経路エンリッチメント解析に使用。実験は3独立反復実施。rRNA遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、40bp未満で検出された遺伝子を解析から除外。

RNAシーケンシングデータ、参照シリーズGSE97852、GSE60159、GSE39444をGene Expression Omnibus[Eric 2,3,4]から取得。Gene Set Enrichment AnalysisプロットをR（バージョン3.6.2）のfgseaパッケージ[Eric 5]で生成。1.5倍有意変化かつp値<0.05のアポトーシス遺伝子を更なる解析に使用。遺伝子ツリー付きヒートマップをRパッケージComplexHeatmap[Eric 6]で生成。クラスタリング手法に平均連結法、距離測定にユークリッド距離を使用。経路エンリッチメント解析をSTRING 2.0[Eric 7]で実施。

ウェスタンブロッティング

対数増殖期のA_L細胞を60mm径ペトリ皿（1.5×10⁵個/皿）に培養培地で播種し24時間後、培地を12μg/mL新鮮または経年変化ZnO NPを含む4mL培養培地に置換し24時間処理。曝露期間終了後、培地を除去し、PBSで3回洗浄後、RIPA溶解バッファー（Beyotime、中国）で氷上溶解し細胞タンパク質を回収。同量の細胞タンパク質を12% SDS-PAGEゲルで分離し、ポリビニリデンフルオライド（PVDF）膜（Roche、スイス）に転写。簡単には、5% 脱脂乳TBSTで2時間ブロッキング（25℃）後、メーカー プロトコルに従い適切希釈で一次抗体を4℃一晩インキュベート、その後HRP標識二次抗体（1:5000、Promega、マディソン、米国）で25℃、2時間インキュベート。最後に、增強化学発光（ECL）（BOSTER、中国）溶液で免疫標識検出。抗プロ/切断カスパーゼ-3および抗アクチン一次抗体をCell Signaling TechnologyとImmunoWayからそれぞれ購入。

統計

統計解析は、少なくとも3独立実験から得られた結果の平均値で実施。すべてのデータを平均±標準偏差（SD）で表示し、一元配置分散分析（ANOVA）で統計比較。すべてのプロットでp値<0.05を*で表示し、統計的有意と見なす。

結果

ZnO NPの特性評価

新鮮と経年変化ZnO NPの詳細な物理化学的特性差を決定するため、まずTEMでNP形態を観察（図1A）。結果は、20nm新鮮ZnO NPがほぼ球状結晶、90-200nm新鮮ZnO NPが不規則なロッド状/立方体状結晶であることを示した。単一粒子サイズはメーカー提供サイズと一致。明らかに、形状とサイズに関わらず、両方の20nmと90-200nm ZnO NPは超純水で凝集傾向を示した。さらに、元のNPの形状とサイズに関わらず、両方の20nmと90-200nm ZnO NPの微細構造は、60日経年変化後、明確な結晶構造からアモルファスまたはシート/針状状態に劇的に変化。さらに、新鮮および経年変化NPの結晶性と相純度を、25℃でCu Kα放射（λ=0.15418nm）を用いたX線回折（XRD）で決定（図1B）。新鮮ZnO NPのXRDパターンは、試料が結晶ウルツ鉱構造で構成され、特徴的不純物ピークが同定されず、新鮮NPの高品質を示唆。経年変化NPでは、XRDパターンにZn₅(CO₃)₂(OH)₆（カード番号00-011-0287）とZn(OH)₂（カード番号00-003-0888）固相の新生が示され、経年変化プロセス中のZnO NP（20および90-200nm）の化学変化を示唆。

新鮮および経年変化ZnO NP曝露A_L細胞の形態観察

NP処理はin vitroで細胞形状、形態の顕著な変化をもたらす[26]。したがって、新鮮または経年変化ZnO NP（10および15μg/mL）に72時間曝露したA_L細胞を実体顕微鏡で観察。図2に示すように、対照群の細胞形態は正常維持。細胞はよく付着し、ほとんどが2時間以内に付着。ほとんどの細胞は紡錘形または多角形で、新たに分裂中の少数細胞がより透明な細胞質と付着過程でのより良い分散を示す。12μg/mL新鮮ZnO NP（20nmおよび90-200nm）で72時間処理すると細胞形態が有意に変化。ほとんどの細胞が3-5時間以内に付着するが、うまく伸展できず、一部は丸くなり多角形形状を失う。ZnO NP濃度を15μg/mLに増やすと、処理細胞が萎縮し付着不能となり、10μg/mL処理細胞より有意に低い細胞生存率を示唆。これらの結果は、72時間処理での新鮮ZnO NPのLC₁₀₀がおそらく15μg/mL未満であることを示す。対照的に、20nmおよび90-200nm経年変化NP処理群（15μg/mL）では細胞形態が有意に影響されず、生存細胞の大半が付着・伸展可能で、死細胞は半分未満観察され、経年変化ZnO NPが新鮮ZnO NPよりはるかに低細胞毒性であることが明らかになった。

経年変化ZnO NPは新鮮NPより低細胞毒性を誘導

新鮮と経年変化ZnO NPの細胞毒性差をさらに調査するため、CCK-8キットで細胞生存率を検討。図3に示すように、A_L細胞を新鮮および経年変化ZnO NPの勾配濃度（0-20μg/mL、20nmおよび90-200nm）で24、48、72時間インキュベートすると、用量依存的な細胞生存率低下が見られた。ZnO NP≤10μg/mL処理では明らかな細胞毒性は観察されなかった。新鮮および経年変化ZnO NP用量が12と15μg/mLに上昇すると、細胞生存率は時間依存的減少傾向を示した。明らかに、経年変化NP処理群の細胞生存率は新鮮NP処理群より有意に高かった。さらに、ZnCl₂処理も用量・時間依存的に細胞生存率を損なうが、ZnCl₂の細胞毒性は新鮮および経年変化ZnO NP両方よりはるかに低かった。

新鮮ZnO NP処理がアポトーシス経路を活性化しアポトーシス遺伝子発現を上方制御

経年変化NPの低細胞毒性の基盤メカニズムを明らかにするため、新鮮および経年変化ZnO NPのRNAシーケンシングデータを解析。図4A,Bに示すように、新鮮ZnO NP処理後、Jurkat細胞（p=0.017）とHMDM細胞（p=0.041）でアポトーシス経路が活性化された。新鮮ZnO NP処理Jurkat細胞ではアポトーシス遺伝子：ANXA1、CYLD、TNFSF10、IER3、CDKN1A、JUN、SAT1、PMAIP1、CD38、ISG20が有意にエンリッチされた。新鮮ZnO NP処理HMDM細胞ではアポトーシス遺伝子：CD38、TNFRSF12A、CCNA1、BMP2、PPP2R5B、EREG、IFNGR1、CD44、CD14、GNA15、GCH1、TIMP1、BTG2、IL1B、IL1A、BTG3、BCL2L11、SC5D、SPTAN1が有意にエンリッチされた（図4C,D）。Jurkat細胞（末梢血Tリンパ球）とHMDM細胞（ヒト単球由来マクロファージ）は異なる細胞種であるため、アポトーシス誘発メカニズムが異なる可能性がある。総括すると、これらの結果は新鮮ZnO NP曝露が様々な細胞種で異なるアポトーシス経路を活性化できることを示す。

経年変化ZnO NPは新鮮ZnO NPのようにアポトーシス遺伝子発現を上方制御しない

経年変化ZnO NP処理A_L細胞のRNAシーケンシングデータでは、p53、PI3K-Akt、FoxO、グルタチオン、ErbB、HIF-1、オキシトシン、Jak-STATシグナル伝達経路がエンリッチされた（図5A）。JurkatとHMDM細胞でエンリッチされたアポトーシス遺伝子は、経年変化ZnO NP処理細胞では有意に影響されなかった（図5B）。知見をさらに確認するため、関連遺伝子発現をリアルタイムPCRで検証。経年変化ZnO NP処理A_L細胞では、アポトーシス遺伝子の一部：BMP2、PMAIP1、IL1α、CD69、CCNA1、CD38、IL1βが検出不能（データ未示）だった。おそらくこれらの遺伝子の多くが免疫系細胞で発現するため。新鮮ZnO NP処理群で観察された他の上方制御アポトーシス遺伝子（IL1α、IL1β、CD59）は、経年変化ZnO NP処理で発現レベルが有意に変化しなかった。一方、陽性対照としてのMT1は発現レベルが有意に増加したが、Caspase 3発現は有意に変化しなかった（図5C）。これらのデータは、経年変化ZnO NPが新鮮な対応物とは異なり、A_L細胞でアポトーシス経路遺伝子を活性化する力が弱いことを示唆する。

新鮮だが経年変化ではないZnO NPが活性化カスパーゼ3タンパク質発現レベルを増加

Caspase 3遺伝子発現検出だけではアポトーシス経路活性化を直接示せない。ZnO NP処理がアポトーシスタンパク質レベルを変化させるかさらに分析するため、細胞アポトーシス活性化を示す一般的バイオマーカーである切断カスパーゼ3タンパク質発現をウェスタンブロッティング解析で検証[27]。図6に示すように、対照群と比較して、新鮮ZnO NP（20nm）処理で細胞内切断カスパーゼ3タンパク質レベルが1.31±0.023倍に増加し、経年変化20nm ZnO NP処理群（1.12±0.039倍）より有意に高かった。新鮮ZnO NP粒子径を90-200nmに増やすと、新鮮NP誘導切断カスパーゼ3タンパク質発現が1.46±0.078倍に増加し、経年変化NP（1.07±0.075倍）より有意に大きかった。これらのデータはさらに、経年変化対応物と比較して新鮮ZnO NPの細胞アポトーシス誘導能が高いことを実証する。

考察

ZnO NPは自然経年変化プロセスでZn₅(CO₃)₂(OH)₆に物理化学的変化し、Zn²⁺を放出することが報告されている[23,28]。しかし、変性（経年変化）ZnO NPによる細胞毒性と基盤メカニズムは不明確なままである。ここでは、新鮮と経年変化ZnO NPの多様な細胞毒性メカニズムを明らかにするため、RNAシーケンシング解析とRT-PCR検定を実施。また、細胞アポトーシスのキーエグゼキューターであるカスパーゼ3タンパク質レベルをウェスタンブロッティングで検証。

データは経年変化ZnO NPがA_L細胞で新鮮ZnO NPよりはるかに低い細胞毒性を誘導することを示した。本研究での両新鮮ZnO NP（90-200nmと20nm）のLC₁₀₀は15μg/mL未満（図3）で、ZnO NP（19-36nm）のNIH-3T3またはMSTO細胞へのLC₁₀₀が約15μg/mLとの先行知見と一致[29]。NPの物理化学的特性における環境変性が毒性を劇的に変化させることを確認。ZnO NPの硫化プロセスが電荷、疎水性、凝集状態を変化させ、硫化状態NPがヒト唾液、汗、気管支肺胞洗浄液に吸着されることが報告されている。ZnO NPに吸着したタンパク質が特殊なタンパク質コロナを形成し、生物学的効果に影響する[19]。生理食塩水中に広く存在するリン酸塩が、ZnO NPを約5-10時間でメタステーブルなZnHPO₄とZn₃(PO₄)₂に変換し、消化管上皮細胞に細胞毒性を示す[20]。Ivaskらは、インビトロ曝露システムにおけるヒトTリンパ球（37℃、10% FBS含有RPMI1640培地、24時間）へのZnO NP（≤3μg/mL）の完全変性が、シンクロトロン放射XANESで実証されたことを報告。スペクトルと変性生成物の細胞毒性はZnSO₄と一致[21]。本結果はA_L細胞へのZnCl₂の用量・時間依存的毒性を明らかにし、その細胞毒性は新鮮および経年変化ZnO NP両方よりはるかに低い（図3）。この観察は、新鮮ZnO NPの細胞毒性が放出Zn²⁺のみに完全には起因しないことをさらに説明[30]。

以前の研究でも、経年変化ZnO NPが新鮮ZnO NPより高いROS（活性酸素種）誘導能を示す一方、細胞殺傷能は減衰していることを示した[23]。経年変化ZnO NPによる低細胞毒性は哺乳類細胞でより許容され得ると推論。本RNAシーケンシングデータ研究は、アポトーシス遺伝子が新鮮ZnO NP処理細胞で上方制御される一方、経年変化NP処理群でははるかに影響を受けないことを示唆。IL1αとIL1βはインターロイキン1サイトカインファミリーのメンバー。IL1αとIL1β放出はカスパーゼ8部分依存性アポトーシスを活性化[31]。CD69はカルシウム依存性レクチンスーパーファミリーのタイプIIトランスメンブレン受容体メンバーをコード。CD69発現増加はアポトーシスマーカーであるアネキシンVとCD95（Fas）発現増加と関連[32]。JUNはAP-1転写因子サブユニット。JUN活性増加はα-フォドリン（インターロイキン1β変換酵素（ICE）基質）とCED-3ファミリーシステインプロテアーゼをプロテオリティックに切断し、プログラム細胞死をさらに引き起こす[33]。これらのアポトーシス遺伝子発現上昇は、新鮮NPが複数の異なる方法でアポトーシスを引き起こすことを明らかにする。これらのアポトーシス遺伝子発現上昇後、アポトーシスプロセスは最終的にアポトーシスタンパク質により実行される（図7）。カスパーゼ3は様々なアポトーシスシナリオのコアプロテアーゼで、このタンパク質切断は外因性・内因性両アポトーシス経路活性化に必要[34,35]。したがって、切断カスパーゼ3検出は幅広いアポトーシス信号によるアポトーシス同定の一般的手法[36]。本ウェスタンブロッティングデータは、20nmと90-200nm両ZnO NPで、亜致死曝露がすべての処理群でプロカスパーゼ3レベルを変化させないことを明らかにした。対照的に、切断カスパーゼ3は新鮮NP処理で有意に上昇し、経年変化NPでは切断カスパーゼ3レベルにほとんど（もしあれば）影響を与えなかった（図6）。RNA発現解析と合わせ、結果は新鮮ZnO NPの細胞アポトーシス誘導能が経年変化対応物より高いことを明確に阐明する。

結論

本研究では、超純水中でのZnO NP自然物理化学的変化を確認し、新鮮および経年変化NPによる細胞毒性変化を調査。経年変化ZnO NP処理A_L細胞のRNAシーケンシングデータとデータベースの新鮮NPデータに焦点を当てた。経年変化NP処理群で特異的にエンリッチされたシグナル伝達経路を、新鮮NPまたはZnCl₂処理群のものと比較。データは、経年変化ZnO NPの低細胞毒性がアポトーシス誘導能の減衰と密接に関連し、NPにより活性化される複数経路の転写制御が哺乳類細胞での細胞ホメオスタシス確立を促進することを示した。

データと材料の入手可能性

該当なし。

略語

NPs

ナノ粉末

ZnO

酸化亜鉛

Zn₅(CO₃)₂(OH)₆

水酸化亜鉛炭酸塩（ヒドロ亜鉛鉱）

Zn(OH)₂

水酸化亜鉛

ZnCl₂

塩化亜鉛

ZnSO₄

硫酸亜鉛

ZnHPO₄

リン酸水素亜鉛

Zn₃(PO₄)₂

リン酸亜鉛

A_L cells

ヒト-ハムスターハイブリッド細胞

CHO cells

中国ハムスターオバリー細胞

Jurkat cells

末梢血Tリンパ球

HMDM cells

ヒト単球由来マクロファージ

NIH-3T3 cells

マウス胚細胞

MSTO cells

ヒト肺癌細胞

RPMI1640

ロズウェルパーク記念研究所1640

ICE

インターロイキン1β変換酵素

CED-3

秀麗線虫死遺伝子

IL1α

インターロイキン1α

IL1β

インターロイキン1β

mRNA

メッセンジャーRNA

cDNA

相補的DNA

FBS

胎児牛血清

TEM

透過型電子顕微鏡

XRD

X線回折

RT-PCR

リアルタイムPCR

CPI

ナノテクノロジー消費者製品インベントリ

XANES

シンクロトロン放射X線吸収近端構造分光法

RIPA

放射免疫沈降アッセイ

SDS-PAGE

ポリアクリルアミドゲル電気泳動

PVDF

ポリビニリデンフルオライド

ECL

増強化学発光

CCK-8

セルカウンティングキット-8