MALAT1/miR-143/VEGFA軸が内皮障害を駆動し脳動脈瘤を引き起こす

概要

一部の長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)が脳動脈瘤(IA)で果たす役割は多くの研究で調べられてきました。本研究の目的は、血管内皮障害誘発性IAにおけるlncRNA転移関連肺腺癌転写産物1(MALAT1)/マイクロRNA-143(miR-143)/血管内皮増殖因子A(VEGFA)シグナル軸のメカニズムを解明することです。IA組織と正常動脈組織でのMALAT1、miR-143、VEGFA発現を検出しました。組織中のマトリックスメタロプロテアーゼ9(MMP-9)、血清と組織中のフォン・ヴィレブランド因子(vWF)、血清中のエンドセリン-1(ET-1)を測定しました。モデルIAラットにMALAT1を沈黙化または過剰発現させ、血管内皮障害を検出しました。IA患者から血管内皮細胞を単離し、MALAT1を沈黙化または過剰発現させて細胞生存率とアポトーシスへの影響を検証しました。MALAT1、miR-143、VEGFAの関連性をオンライン予測、ルシフェラーゼ活性、RNAプルダウンアッセイで検証しました。IA組織でMALAT1とVEGFAの過剰発現とmiR-143の低発現が認められました。MALAT1ダウンレギュレーションは、IAモデルラットの血圧、ET-1、vWF、MMP-9発現、血管内皮細胞アポトーシス指数を抑制しました。MALAT1ダウンレギュレーションは、IA血管内皮細胞のアポトーシスを抑制し生存率を促進しました。MALAT1はmiR-143と結合し、miR-143はVEGFAを標的としました。本研究は、MALAT1がmiR-143と競合的に結合することでVEGFA発現を上昇させ、IAにおける血管内皮細胞のアポトーシスを促進し生存率を低下させることを示唆しています。

はじめに

脳動脈瘤(IA)は、大脳動脈腔または動脈壁の局所的異常拡張による頭蓋内圧上昇によって引き起こされます[1]。IAは死亡率と罹患率が高い重篤な疾患で、一般人口での有病率は約1-3%です[2]。IAの主な臨床特徴は、大脳血管攣縮、自然発生的脳出血、動眼神経麻痺です[3]。これまで、IA発症・進展の主なリスク因子として、血流動態障害、遺伝、加齢、感染、先天性因子が知られています[4]。主な臨床治療である外科的クリッピングと/または血管内コイル塞栓術は、動脈瘤破裂を予防することを目的としています[5]。しかし、IAの詳細なメカニズムは未解明であり、IA管理により効果的な方法が緊急に求められています。

長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)は200ヌクレオチド以上の非コーディングRNAの一種です[6]。IAにおけるlncRNA成長停止関連lncRNA 1の発現がダウンレギュレーションされることが報告されています。転移関連肺腺癌転写産物1(MALAT1)は、約8000 ntの長さを持つ高濃度で広く発現するlncRNAです[7]。MALAT1は胸部大動脈瘤における平滑筋機能不全を調節することが記録されています[8]。また、IAにおけるlncRNAとメッセンジャーRNA(mRNA)の異常発現と、lncRNA-mRNA共発現ネットワークがIA発症機序の手がかりを提供することが示されています[9]。MALAT1は、ヒト骨髄間葉系幹細胞でmiRNA-143(miR-143)発現を標的としてオステリックス発現を促進し、骨形成分化を調節することが示唆されています[10]。また、miR-143/145クラスタが平滑筋細胞におけるKrüppel-like factor 5の調節を逆転させ、IAにおける収縮性と増殖に関与することが示されています[11]。Fengらによれば、循環中のmiR-143/145ダウンレギュレーションと高MMP-9レベルがIA形成と破裂に関連する可能性があります[12]。解析により、最も制御されていないmiRNA(miR-143とmiR-145)が、血管内皮増殖因子(VEGF)などのシグナル経路や、細胞運動・接着を制御する他の遺伝子を共通して標的とすることが明らかになりました[13]。VEGFA変異のIAにおける予測的重要性も明らかにされています[14]。したがって、血管内皮障害誘発性IAにおけるMALAT1/miR-143/VEGFAシグナル軸のメカニズムを評価しようとしました。

材料と方法

倫理声明

本研究は、中国科学技術大学生命科学医学部第一附属病院の機関審査委員会の承認を得て、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施されました。参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供しました。すべての動物実験は、米国国立衛生研究所の実験動物飼育使用ガイドラインに準拠しています。プロトコルは、中国科学技術大学生命科学医学部第一附属病院の動物実験倫理委員会の許可を得ています。

研究対象

画像検査で診断され、中国科学技術大学生命科学医学部第一附属病院で神経外科クリッピングを受けた20例のIA患者(IA群)を実験対象として選択しました。男性11名、女性9名、年齢43.27 ± 6.25歳でした。IA組織を採取しました。一方、扁桃体と海馬硬化症による側頭葉てんかんの20例(対照群)から、側頭極の側頭皮質動脈血管組織を切除しました。切除組織は術後病理組織学的に正常動脈組織として確認され、男性13名、女性7名、年齢44.18 ± 5.91歳でした。IA群と対照群の間で性別と年齢に有意差は認められませんでした(いずれもP > 0.05)。全例から空腹時朝に同時に静脈血サンプル(2本)を採取しました。

IAラットモデルの確立

清潔級スプラグ・ドーリー系雄ラット60匹(湖南SJA実験動物有限公司、湖南省、中国)、体重200-250 gを、7日間飼育しました(25 ± 2℃、相対湿度65-70%、12時間明暗サイクル、自由飲食)。豚膵エラスターゼを外頸動脈と分岐部動脈壁周囲に滴下しました。外頸動脈を分岐部から約1.5 mmの位置で2本の手術用糸で結紮し、その間を切断して外頸動脈盲端に内頸動脈瘤を形成しました。術後1週間、1%生理食塩水で飼育しました。1ヶ月後に脳血管造影を行い、動脈瘤形成を観察しました。

IAラットモデル確立後、50匹をランダムに5群に割り付けました: ブランク群(n=10、ステレオタクティック注射で1日1回100 μLリン酸緩衝液(PBS)投与)、sh-ネガティブコントロール(NC)群(n=10、sh-MALAT1 NC 100 μL投与)、sh-MALAT1群(n=10、sh-MALAT1プラスミド 100 μL投与)、過剰発現(Oe)-NC群(n=10、Oe-MALAT1 NCプラスミド 100 μL投与)、Oe-MALAT1群(n=10、Oe-MALAT1プラスミド 100 μL投与)[15]。上記プラスミドは上海Genechem社(上海、中国)で作製しました。

ラット血圧測定

術後第1、4、12週でラット尾動脈血圧を測定しました。測定前にラットを恒温加温装置に入れ外気温の影響を防ぎ、専用ラットケージで数分間安静にさせ活動の影響を防ぎました。血圧変動が大きい場合は、異なる時間に2-3回測定し平均値を採用しました。

動脈瘤組織採取

3ヶ月後、1%ペントバルビタールナトリウム(40 mg/kg)腹腔内投与で麻酔し、静脈から血液サンプルを採取しました。ラットを安楽死させ、胸部を開き、左心室を大動脈に插管し、下大静脈を切開して出血させました。同時に、ヘパリンナトリウム含有30 mL生理食塩水で急速心臓灌流し血液を洗い流し、次に10%ポリホルムアルデヒド/0.1 M PBS(pH 7.4) 10 mLを脳に注入しました。灌流固定後、ラット脳を開き、頭蓋底動脈循環を慎重に観察し、動脈瘤組織を分離し、顕微鏡下で動脈瘤変化を観察しました。

酵素免疫測定法(ELISA)

血清関連指標をELISAキットで測定しました。採取血液サンプルを37℃恒温槽で1時間置き、3000 rpmで10分間遠心分離しました。エンドセリン-1(ET-1)とフォン・ヴィレブランド因子(vWF)発現をキット指示に従って検出しました(すべてのキットは南京建成生物工学研究所製、江蘇省、中国)。

ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色

サンプルを10%ホルマリンで24時間以上固定し、パラフィンブロックに包埋しました。パラフィンブロックをキシレンで20分脱パラフィンし、勾配降順アルコール系列(100%、95%、80%、75%)で各1分脱水し、ヘマトキシリンで10分染色しました。その後、蒸留水で洗浄、塩酸エタノールで30秒脱色、50℃温水で5分浸漬しました。エオシン液で染色後、蒸留水で洗浄、70%と90%アルコールで脱水、キシレンで透明化、中性ガムで封入しました。高倍率顕微鏡で組織形態を観察しました。

透過型電子顕微鏡観察

予備組織を2.5%グルタルアルデヒドと1%オスミウム酸で固定し、脱水後Epon812レジンで包埋しました。半薄切片をトルイジンブルーで染色し、トリミングして超薄切片を作製しました。切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、JME-2000EX透過型電子顕微鏡(日立ハイテクノロジーズ、上海、中国)で観察しました。

TUNEL染色

TUNELキット(Roche、バーゼル、スイス)に基づき、IAラットの内皮細胞アポトーシスを観察しました。作製したラット動脈瘤切片をキシレンで2回洗浄(各5分)、降順アルコール系列(100%、95%、80%、75%)で3回脱水(各5分)。20 μg/mLプロテアーゼK溶液(DNaseフリー)で15-30分処理し、50 μL TUNEL反応液を滴下して60分、25℃で50 μLジアミノベンジジン(DAB)で10分間発色しました。その後、ヘマトキシリンで対比染色、勾配アルコールで脱水、キシレン透明化、中性ガム封入しました。光学顕微鏡で観察し、アポトーシス指数を算出しました。

動脈瘤血管内皮細胞の単離と同定

内皮細胞単離はBoscoloらの方法[16]に従って行いました。IA組織を3 mm²断片に切断し、0.1%コラゲナーゼB/0.1%ディスパーゼ(Roche)で37℃、25分間インキュベートしました。その後、プレデタッチした組織を2 mLピペットで2分間撹拌し、100 μmストレーナー(Thermo Fisher Scientific、米国イリノイ州ロックフォード)で濾過しました。その後、細胞懸濁液を遠心分離し、MV2培地(増殖因子と20%胎児牛血清含む)(PromoCell、ドイツ・ハイデルベルク)に再懸濁しました。細胞を1 μg/cm²フィブロネクチンでコートした培養フラスコに1 × 10⁴ cells/mLで播種しました。Jacksonらの方法[17]に従い、80-100%コンフルエンスの細胞を、Ulex europaeus凝集素I(UEA)(Vector Laboratories、英国ピーターバラ)でコートしたビーズ(Dynabeads M-450 Tosylactivated、Oxoid、英国ハンプシャー)で分離しました。レクチンコートビーズに付着した内皮細胞を磁気粒子濃縮器で回収し、非結合細胞を基礎培地で洗浄しました。UEA陽性細胞を培養培地に再懸濁し、フィブロネクチンコート培養フラスクに播種して細胞接着と増殖率を向上させました。

細胞をフィブロネクチンコートチャンバースライド上でMV2培地で培養しました。コンフルエンス80-100%に達したら、4℃でアセトン固定し、1%トリトンX-100で5分、0.5%牛血清アルブミン(BSA)で15分処理しました。vWF一次抗体(1:300、Abcam、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)を滴下し2時間インキュベートしました(一次抗体なしでNC実施)。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識免疫グロブリンG(1:150、Abcam)を滴下し30分インキュベートしました。50 μL DABで25℃、5分間発色し、ヘマトキシリン対比染色、0.1%塩酸脱色、アルコール脱水、キシレン透明化、中性ガム封入しました。乾燥後、倒立顕微鏡で撮影しました。

細胞群分けとトランスフェクション

対数増殖期の動脈瘤血管内皮細胞を5群に分けました: ブランク群(無処理)、sh-NC群(sh-MALAT1 NCプラスミドトランスフェクション)、sh-MALAT1群(sh-MALAT1プラスミドトランスフェクション)、Oe-NC群(Oe-MALAT1 NCプラスミドトランスフェクション)、Oe-MALAT1群(Oe-MALAT1プラスミドトランスフェクション)。上記プラスミドはGenechemで合成しました。細胞トランスフェクションはリポフェクタミン™ 2000試薬(11668-027、Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド)の指示に従って実施しました。

MTTアッセイ

各群の血管内皮細胞を96ウェルプレートに3 × 10⁴ cells/mL密度で播種し、37℃、5% CO₂で48時間培養しました。各群5並列ウェルを設け、各ウェルに新鮮なMTT溶液(5 mg/mL、Sigma、米国ミズーリ州セントルイス)20 μLを添加しました。4時間反応後、細胞をジメチルスルホキシド200 μLと混合しました。完全溶解後、マイクロプレートリーダー(BioRad、米国カリフォルニア州ヘラクレス)で490 nmにて光学密度を測定しました。

フローサイトメトリー

プロピジウムヨウ化物(PI)染色で細胞周期分布を検定しました。血管内皮細胞を剥離、遠心分離、プレコールド75%エタノールで再懸濁し、-20℃で一晩固定しました。遠心分離して上清を除去し、450 μL PBS、100 μL RNase A、400 μL PIを添加し、4℃、避光下で30分間染色しました。フローサイトメーター(FACSCalibur、Becton Dickinson、米国ニュージャージー州)で細胞周期分布を測定しました。

Annexin V/PI二重染色で細胞アポトーシスを検定しました。剥離内皮細胞を回収しPBSで3回洗浄。100 μLプレコールド1×バインディングバッファーで再懸濁し、5 μL Annexinと5 μL PIをそれぞれ混合しました。フローサイトメーターで細胞アポトーシスを測定しました。Annexin Vを横軸、PIを縦軸として、左上象限は機械的損傷細胞(Annexin V⁻/PI⁺)、右上象限は後期アポトーシス/壊死細胞(Annexin V⁺/PI⁺)、左下象限は陰性正常細胞(Annexin V⁻/PI⁻)、右下象限は初期アポトーシス細胞(Annexin V⁺/PI⁻)を表します。総アポトーシス細胞(Annexin V⁺/PI⁻とAnnexin V⁺/PI⁺)を算出しパーセンテージで表しました。

逆転写定量PCR(RT-qPCR)

組織と細胞の総RNAをTrizol(タカラバイオテクノロジー、大連、中国)で抽出し、RNA濃度と純度を測定しました。逆転写キット(K1621、Fermentas、米国メリーランド州ニューヨーク)の指示に従い、RNAから相補的DNAへの逆転写を行いました。MALAT1、miR-143、VEGFAプライマー配列(表1)をGenechemで設計・合成しました。lncRNA、miRNA、mRNA発現評価のため、SYBR Green PCR Master Mix(タカラ、東京、日本)とRoche Real-Time PCRシステム(Roche)でRT-qPCRを実施しました。U6をmiR-143の内部パラメータ、MALAT1とVEGFAにはグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)を内部パラメータとして設定しました。標的遺伝子の相対転写レベルを2^(-ΔΔCt)法で算出しました。

ウェスタンブロット解析

組織と細胞から総タンパク質を抽出し、BCAキット(ブースター生物技術有限公司、武漢、湖北省、中国)指示に従ってタンパク質濃度を測定しました。10%ポリアクリルアミドゲル(ブースター生物技術)で電気泳動分離し、ポリビニリデンフルオライド膜に転写、5% BSAで1時間ブロッキングしました。Ki-67(1:1000)、VEGFA(1:1000)、vWF(1:1000)、MMP-9(1:1000、Abcam、英国ケンブリッジ)、Cyclin D1(1:1000)、Bax(1:1000)、Bcl-2(1:1000、Santa Cruz Biotechnology、米国カリフォルニア州サンタクルーズ)、GAPDH(1:2000、Jackson Immuno Research、米国ペンシルベニア州グローブ)、およびホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体(1:500、Jackson Immuno Research)で免疫反応させました。Odyssey二色赤外蛍光スキャンイメージングシステムで膜を撮影し、Quantity One画像解析ソフトウェアでバンドのグレー値を測定しました。

二重ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ

MALAT1とmiR-143の結合部位をバイオインフォマティクスウェブサイト(https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/)で予測・解析しました。MALAT1とmiR-143の結合関係をルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイでさらに検証しました。合成MALAT1 3'非翻訳領域(3'UTR)遺伝子断片をpmiR-Reportルシフェラーゼレポーターベクター(Thermo Fisher Scientific)に導入し、制限酵素BamHIとEcoRI部位でMALAT1ワイルドタイプ(MALAT1-WT)を作製しました。配列の相補的変異部位をMALAT1-WTに設計し、標的断片をpmiR-Reportベクターに挿入し、T4 DNAリガーゼで制限酵素消化後にMALAT1変異型(MALAT1-MUT)を作製しました。正しくシーケンスされたMALAT1-WTとMALAT1-MUTを、ミミックNCとmiR-143ミミックと共に血管内皮細胞に共トランスフェクションしました。トランスフェクション48時間後に細胞を回収・溶解し、ルシフェラーゼ検出キット(BioVision、米国カリフォルニア州サンフランシスコ)とルミノメーター(Glomax20/20、Promega、米国ウィスコンシン州マディソン)でルシフェラーゼ活性を測定しました。

miR-143とVEGFAの標的関係と、miR-143とVEGFA 3'UTRの結合部位をバイオインフォマティクスウェブサイト(https://www.targetscan.org/vert_72/)で予測しました。miR-143結合部位を含むVEGFA 3'UTRプロモーター領域配列を合成・クローニングし、pmiR-Reportベクターに導入してVEGFA-WTを作製しました。このレポーターを基に、VEGFA-WTとmiR-143の結合部位を変異させてVEGFA-MUTを作製しました。VEGFA-WTまたはVEGFA-MUTレポーターをミミックNCまたはmiR-143ミミックと混合し、血管内皮細胞に48時間共トランスフェクションしました。その後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ検出キットでルシフェラーゼ活性を測定しました。

RNAプルダウンアッセイ

miR-143とMALAT1の結合関係を検証するためRNAプルダウンアッセイを実施しました。3種類のビオチン標識miRNA配列(Bio-miR-143-WT、Bio-miR-143-MUT、Bio-miR-NC)を設計し、GenePharma社(上海、中国)に委託しました。これらのビオチン標識オリゴヌクレオチドを細胞に48時間トランスフェクションしました。その後、細胞を回収し、特定細胞溶解液(Ambion、米国テキサス州オースティン)で10分間インキュベートしました。その後、RNaseフリーと酵母tRNA(すべてSigma製)でプレコートしたM-280ストレプトアビジンビーズで4℃、3時間ハイブリダイズし、コールド溶解液で2回、低塩バッファーで3回、高塩バッファーで1回洗浄しました。拮抗miR-143プローブをNCとして設定しました。Trizolで総RNAを抽出し、RT-qPCRでMALAT1濃縮レベルを測定しました。

統計解析

すべてのデータをSPSS 21.0ソフトウェア(IBM Corp.、米国ニューヨーク州アーモンク)で解析しました。測定データを平均 ± 標準偏差で表示しました。2群間比較は独立標本t検定、多群比較は一元配置分散分析(ANOVA)、対比較はTukeyの多重比較検定で実施しました。MALAT1発現とIA臨床病理学的特徴の関係をカイ二乗検定で判定しました。P < 0.05を統計的有意差としました。

結果

IA組織でMALAT1とVEGFAが過剰発現し、miR-143がダウンレギュレーションされる

IA群と対照群の血清中ET-1とvWF発現をELISAで検出し、両方ともIA群で有意に増加していました(いずれもP < 0.05)(図1a, b)。

HE染色でIA組織の病理変化を観察しました。正常動脈組織では内皮、内皮細胞、平滑筋細胞に明らかな損傷はなく、細胞は整然と配列し完全な構造を持っていました。IA組織では内皮細胞損傷、平滑筋細胞変性、動脈壁薄化、弾性線維断裂、炎症細胞浸潤が認められました(図1c)。

透過型電子顕微鏡でIA組織と正常動脈組織の超微細構造変化を観察しました。正常動脈組織では内皮細胞が完全で外膜構造が完全、内部弾性膜断裂や平滑筋細胞アポトーシスは見られませんでした。IA組織では血管壁の重度変性が見られ、主に大部分の内皮細胞消失、内部弾性層重度断裂、平滑筋細胞重度損傷・変性、血管外膜の無秩序が呈されました(図1d)。

IA組織と正常動脈組織で、RT-qPCRでMALAT1、miR-143、VEGFA mRNA発現、ウェスタンブロットでVEGFA、MMP-9、vWFタンパク質発現を測定しました。正常動脈組織と比較して、IA組織ではMALAT1、VEGFA、MMP-9、vWF発現レベルが上昇し、miR-143発現が低下していました(いずれもP < 0.05)(図1e, f)。

Hunt-Hessグレード、内皮障害度、喫煙歴がIA組織のMALAT1発現と相関する

MALAT1中央値発現に基づき、患者を低発現群と高発現群に分けました。IA患者のMALAT1発現と臨床病理学的特徴の関係を解析しました。結果、Hunt-Hessグレード、内皮障害度、喫煙歴がMALAT1発現と関連していました(いずれもP < 0.05)。一方、年齢、性別、手術方法はMALAT1発現と関連しませんでした(いずれもP > 0.05)(表2)。

MALAT1ダウンレギュレーションがIAモデルラットの血圧、ET-1、vWF、MMP-9発現、血管内皮細胞アポトーシス指数を抑制する

表3に示すように、MALAT1ノックダウンで第4週と第12週の血圧が低下し、MALAT1過剰発現で上昇しました。

ELISAにより、MALAT1ダウンレギュレーションでIAモデルラット血清中ET-1とvWF発現が減少し、MALAT1上昇で増加しました(図2a, b)。

各群のIA組織病理変化をHE染色で調べました。ブランク群、sh-NC群、Oe-NC群では内膜損傷、内皮細胞剥離、平滑筋細胞変性、細胞と層の減少、動脈壁肥薄が認められました。sh-MALAT1群では、頭蓋内動脈の内皮、内皮細胞、平滑筋細胞層、外膜層がわずかに損傷しているものの整然と配列していました。Oe-MALAT1群では、内膜層消失、内皮細胞剥離、弾性線維断裂、炎症細胞浸潤が見られました(図2c)。

各群のラットIA組織を透過型電子顕微鏡で観察しました。ブランク群、sh-NC群、Oe-NC群では変性内皮細胞、亜内皮層崩壊、内部弾性層消失、平滑筋細胞減少が見られました。sh-MALAT1群では扁平内皮細胞、楕円核、コラーゲン線維増加が見られましたが弾性層はありませんでした。Oe-MALAT1群では内皮細胞消失、弾性層が筋層から分離して腔内に崩壊していました(図2d)。

IAラット血管内皮細胞アポトーシス指数をTUNEL染色で測定しました。MALAT1沈黙化でアポトーシス指数が減少し、MALAT1過剰発現で逆の効果が見られました(図2e, f)。

IA組織でRT-qPCRによるMALAT1、miR-143、VEGFA mRNA発現、ウェスタンブロットによるVEGFA、MMP-9、vWFタンパク質発現を測定しました。MALAT1除去でMALAT1、VEGFA、MMP-9、vWF発現が抑制され、miR-143発現が上昇しました。逆にMALAT1上昇でこれらの遺伝子発現に逆の影響が見られました(図2g, h)。

MALAT1低発現がIA血管内皮細胞の生存率を促進しアポトーシスを抑制する

免疫組織化学染色で内皮特異的マーカーvWF発現を検出しました。IA血管内皮細胞細胞質が微細な褐色顆粒で覆われ陽性を示し、NC群細胞質では褐色顆粒が見られませんでした。培養細胞が内皮細胞であることが確認されました(図3a, b)。

MTTアッセイ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロットで血管内皮細胞生存率とアポトーシスを検定しました。MALAT1減少で血管内皮細胞生存率が促進され(Cyclin D1とKi-67発現上昇)、アポトーシスが抑制されました(G0/G1期細胞減少、S期とG2/M期細胞増加、Bax減少、Bcl-2上昇)。一方、MALAT1上昇はMALAT1減少とは逆の効果を示しました(図3c-g)。

miR-143がMALAT1と結合し、VEGFAがmiR-143の標的遺伝子である

各群の動脈瘤血管内皮細胞でのMALAT1、miR-143、VEGFA発現をRT-qPCRとウェスタンブロットで検証しました。MALAT1ノックダウンでMALAT1とVEGFA発現が抑制され、miR-143発現が上昇しました。逆にMALAT1過剰発現でMALAT1とVEGFA発現が増加し、miR-143発現が減少しました(図4a, b)。

オンライン解析ソフトウェアでMALAT1とmiR-143の特定結合領域を予測しました(図4c)。二重ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果、MALAT1-WT + miR-143ミミック群でルシフェラーゼ活性がMALAT1-WT + ミミックNC群と比較して低下しました(P < 0.05)。一方、MALAT1-MUT + miR-143ミミック群とMALAT1-MUT + ミミックNC群の間でルシフェラーゼ活性に有意差はありませんでした(P > 0.05)。これはmiR-143が特異的にMALAT1に結合することを示しています(図4d)。RNAプルダウンアッセイでは、Bio-miR-143-WT群のMALAT1濃縮レベルがBio-miR-NC群より高かったです(P < 0.05)。一方、Bio-miR-143-MUT群ではMALAT1濃縮レベルに有意差はありませんでした(P > 0.05)(図4e)。

バイオインフォマティクスソフトウェアでmiR-143とVEGFAの標的関係を予測しました(図4f)。ルシフェラーゼ活性結果では、VEGFA-WTとmiR-143ミミックを血管内皮細胞に共トランスフェクションすると相対ルシフェラーゼ活性が抑制されました(P < 0.05)。一方、VEGFA-MUTとmiR-143ミミック共トランスフェクションでは血管内皮細胞の相対ルシフェラーゼ活性に影響ありませんでした(P > 0.05)(図4g)。これはVEGFAがmiR-143の直接標的遺伝子であることを示しています。

考察

IAは主にクモ膜下出血を引き起こす重篤な頭蓋内疾患です[18]。先行研究でlncRNA関連競合性エンドジェノウスRNAネットワークのIA関与が示されています[19]。また、最近の研究でmiR-143/145遺伝子プロモーター領域の機能的多型がIAリスクと関連することが証明されています[20]。Xuらの研究では、VEGFAなどの血管新生因子過剰発現がIA形成と破裂に関連する可能性が示されています[21]。MALAT1のIAにおける分子メカニズムを説明するため、一連のアッセイを実施し、血管内皮障害誘発性IAがMALAT1/miR-143/VEGFAシグナル軸によって制御されることが明らかになりました。

まず、本研究はIA組織でMALAT1とVEGFAがアップレギュレーションされ、miR-143がダウンレギュレーションされることを実証しました。最近の研究で、MALAT1が脳虚血過程で最もアップレギュレーションされるlncRNAの1つであることが示されています[22]。別の研究では、MALAT1が卵巣がん細胞でアップレギュレーションされ、アポトーシス、遊走、増殖に関与することが示されています[23]。未破裂・破裂IA発現プロファイル研究では、VEGFAなどの血管新生因子発現が破裂動脈瘤でアップレギュレーションされることが示されています[21]。また、臨床研究でIA患者のmiR-143/145クラスタが健常者と比較してダウンレギュレーションされることが示されています[11]。さらに、miR-143/145が動脈瘤形成に関連する様々な生物学的プロセスに参加し、IA患者でダウンレギュレーションされることが以前議論されています[20]。これらすべての知見は、以前の探索結果とおおむね一致します。

上記知見に加え、本研究はgain-of-functionとloss-of-functionアッセイでMALAT1のIAにおける機能的役割を探索しました。まとめると、MALAT1ダウンレギュレーションで血圧、血清ET-1レベル、IA組織中vWFとMMP-9発現が減少しました。以前、MALAT1ダウンレギュレーションがグルコース誘導性ET-1転写産物アップレギュレーションを抑制することが示唆されています[24]。また、異所的MALAT1発現がvWF生成の誘導因子であることが報告されています[25]。別の研究では、骨髄由来マクロファージでのMALAT1枯渇がMMP-9発現を抑制することが検証されています[26]。

また、細胞実験でMALAT1のIAにおける機能をさらに確認しました。結果、MALAT1ノックダウンでIA血管内皮細胞生存率が促進されアポトーシスが抑制されました。同様に、MALAT1攪乱が大動脈壁構造を改善し動脈瘤成長を遅延させることが記録されています[8]。本研究知見を補完するものとして、MALAT1低発現が急性骨髄性白血病細胞のアポトーシス誘導と増殖抑制を誘発する研究[27]、MALAT1ノックダウンがヒト変形性関節症軟骨細胞増殖を抑制する研究[28]、MALAT1ダウンレギュレーションがグリオーマ細胞のアポトーシス誘導と増殖減弱を誘発する研究[29]、RNA干渉によるMALAT1低発現が多発性骨髄腫細胞のアポトーシス促進と増殖抑制をもたらす研究[30]があります。これらの研究は、MALAT1のIAにおける分子メカニズムをある程度説明しています。

さらに、本研究はmiR-143がMALAT1と結合し、VEGFAがmiR-143の標的遺伝子であることを証明しました。同様に、MALAT1が直接miR-143と結合しその発現を抑制することが報告されています[10]。Zhuらは、MALAT1が子宮頸がん細胞でmiR-143と相互作用して機能を発揮することを発見しました[31]。MALAT1がmiR-200b-3pを介して間接的にVEGFAを調節することも確認されています[32]。また、別の研究ではmiR-143-3pが血液中のVEGFAを含む多数のタンパク質ターゲットへのZFPM2効果を媒介することが示唆されています[33]。しかし、IAにおけるMALAT1、miR-143、VEGFAの相互作用については議論されておらず、さらなる研究が必要です。

結論

これらの結果から、MALAT1ノックダウンがmiR-143/VEGFA軸を調節することでIA血管内皮細胞のアポトーシスを抑制し生存率を促進することが明らかです。共発現ネットワークは、VEGFAの関与によりMALAT1とmiR-143の関連を示唆しています。本研究の知見はIA発症・進展の病因を部分的に開示し、研究対象ターゲットがIA病理を別の視点から明らかにする顕著な潜在的エントリーポイントとなり得ます。限定的に、MALAT1/miR-143/VEGFA軸のIAにおけるメカニズムを包括的に解明するには、さらなる大規模研究が必要です。