イメージングフローサイトメトリーの最適化によるHEK293T細胞由来細胞外小胞取り込み動態と特異性の定量

概要

細胞外小胞（EV）は、ほとんどの細胞タイプから自然に分泌されるナノサイズの脂質二重層小胞で、タンパク質、脂質、遺伝物質を届けるコミュニケーション機構として機能します。EVの治療可能性にもかかわらず、EV取り込み動態と特異性に関する情報は限られています。ここでは、ヒト胚性腎細胞（HEK293T）由来EVの内在化における用量、時間、受容細胞特異性の効果を高スループットで定量評価するため、イメージングフローサイトメトリー（IFC）ベースのプラットフォームを最適化しました。HEK293T EV取り込みが用量と時間依存的な能動的プロセスであることを発見しました。さらに、EV取り込みの選択性をin vitroで定量化し、HEK293T EVが同起源細胞により多く取り込まれることを確認しました。最後に、神経幹細胞が成熟ニューロンよりも有意に多くHEK293T EVを取り込むことがわかり、より代謝活性の高い幹細胞や前駆細胞が、終末分化細胞よりも高い能動的EV内在化率を持つ可能性が示唆されました。EV取り込み、特に特異性、用量と時間依存性、動態アッセイの特性評価は、標的化された効率的なEVベース治療薬の開発に役立つでしょう。

はじめに

細胞外小胞研究は、天然および人工EVの治療的・診断的有用性により急成長中の分野です。EVは直径50〜1000 nmで、全細胞タイプから産生され、CD63、CD81、CD9などの膜貫通タンパク質、脂質、タンパク質、DNA、RNA、mRNA、microRNAが豊富です[1-5]。特に活性mRNAとmiRNAを含むEV内容物は、標的細胞におけるデノボ翻訳と翻訳後制御を通じて受容細胞を調節することが示唆されています[4, 6]。運動論的EV取り込みと内在化を理解し修正することで、最終的に治療効果をもたらす十分な濃度でEV内容物を標的細胞に最適化配信できるようになります。

かつて「細胞のゴミ」と思われていたEVは、生体適合性、低免疫原性と毒性、反復投与可能、多様な投与経路、薬物と遺伝子治療の配信可能性など多くの利点により、細胞治療の代替として活用されています[3]。我々のグループは以前、神経幹細胞由来EVの脳卒中と外傷性脳損傷でのポジティブな効果を報告しました。マウスとブタの脳卒中モデル両方で、EVが脳卒中後の組織と機能回復を改善しました[3, 7, 8]。また、ロデント外傷性脳損傷モデルでEVが神経保護的で機能的利益をもたらすことも示しました[9]。これらの観察効果とEVの将来的可能性にもかかわらず、EV取り込み特異性と動態の理解が乏しく、EV治療薬の臨床応用への翻訳を妨げる可能性があります。

EVは転移ベクターとしても工学化され、遺伝子治療や化合物など治療薬を搭載し、ナノ粒子治療と配信ベクターの代替となっています[4, 10-12]。HEK293T細胞は、固有の急速増殖、高EV産生量、遺伝子操作の容易さから、EV産生細胞として広く使用されています[13-17]。HEK293T EVは乳がんへのmiRNA治療[12]など遺伝子治療を配信し、シュワンノーマモデルで化学療法薬と治療用タンパク質構造体の配信に使用されてきました[18]。合成ナノ粒子研究でのin vitro細胞毒性評価と同様に、MTT毒性アッセイでは未搭載HEK293T EVの低毒性と、化学療法薬搭載時の高細胞毒性が示されました[10, 18-21]。このHEK293T EVの豊富な利用を踏まえ、本研究ではその動態と特異性を分析しました。

選択的または特異的取り込みとは、EVが特定細胞タイプを標的とする固有の能力を指します。EV内在化メカニズムに関する豊富な証拠があるものの、取り込み特異性についてはコンセンサスがありません[22]。多くの場合、EVは親細胞と類似の受容細胞により選択的に取り込まれます。上皮細胞は他の受容細胞より上皮由来EVを多く取り込み[23, 24]、間葉系幹細胞（MSC）はin vitroで他の細胞株よりMSC由来EVを有意に多く取り込みます[24]。しかし、他の研究ではEVが全細胞タイプによって取り込まれ、in vivo投与時に非選択的な生体分布を示すと報告されています[22, 25]。EVの莫大な治療可能性と関心にもかかわらず、EV取り込み特異性の理解に欠けがあります。EV取り込み特異性をより良く理解することで、関心のある受容細胞により選択的に取り込まれるEV産生細胞を適切に選択し、EVの治療適用性を向上できます。

EV取り込み結果の矛盾の潜在的理由は、用量と時間効果の分析を含む測定プラットフォームの標準化不足にあります。最近、国際細胞外小胞学会（ISEV）専門家グループが、EV取り込みにおける用量と時間などの交絡因子分析の必要性を強調するポジションペーパーを発表しました[26]。グループは「一つの用量が全てに適合するわけではない」と述べ、用量がEV取り込みや選択性に影響する可能性を指摘しました[26]。HEK293T EVの用量増加はin vivoでの生体分布パターンをシフトさせます[27]。血清由来EVの取り込みプロファイルは用量で有意に変化しました[28]。また、受容細胞とのEV共培養時間が15分から48時間まで幅広く[24, 29-33]、取り込み測定を変える可能性があります。EV研究者と業界が採用すれば、標準的用量と時間曲線を決定し最小有効用量を特定する定量的で信頼性のあるプロセスが、より堅牢で有用な研究につながるでしょう。

以前、研究者たちは標準フローサイトメトリーと様々な低スループット顕微鏡（共焦点顕微鏡など）を用いてEV取り込みを分析してきました[32-34]。しかし、これら技術にはいくつかの制限があります。共焦点顕微鏡は時間がかかり主観的です。従来のフローサイトメーターは細胞サイズの生物学的粒子測定向けに設計されており、EVスワームやコインシデンスを区別できず、トリガーによるノイズ増大があります[35-38]。ISEVグループが指摘するように、従来フローサイトメトリーの物理的限界への認識が高まり、100 nm範囲の検出限界を持つ特殊フローサイトメトリーへの需要が高まっています[26, 38]。イメージングフローサイトメトリー（IFC）は、フローサイトメトリーの高スループット定量性と、固有に小さな蛍光粒子を100 nm径まで分解できる蛍光イメージング技術を組み合わせたものです[38]。IFC機能により、低ノイズ/バックグラウンド、スワーミング減少、電荷結合素子による画像鮮明化が実現します[37, 39]。これら特性は、視覚的確認を伴う高スループットでのEVと取り込みの特性評価のためのゲーティング戦略開発を支援し、正確で定量可能なEV取り込みプラットフォームとなります[36, 37, 40]。

本研究では、治療開発での一般的使用により、CD63-eGFP発現HEK293T細胞をEV産生ドナー細胞株として利用しました。分離した蛍光EVを、神経細胞と内皮細胞を含む受容細胞株と共培養しました。取り込みをIFCで定量化し、in vitro細胞系での重要な運動論的EV取り込みと内在化特徴を測定する標準化プラットフォームを構築しました。さらに、異なる条件と培養細胞株での蛍光EV取り込み定量プロセスのデータを提供し、選択的EV取り込みを解明しました。

材料と方法

細胞培養

ヒト胚性腎細胞（HEK293T）をATCCから購入し、10%胎児牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン含有DMEMで培養しました。ヒト神経幹細胞（hNSC）、SH-SY5Y神経細胞、C3A肝上皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、ニューロンを、EV取り込みアッセイ前に37℃、5% CO₂標準条件で培養しました。

EV標識と分離

CD63-eGFPプラスミドDNAをAddgene（#62964）から入手しました。CD63-pEGFP C2はPaul Luzioからの寄贈（Addgeneプラスミド#62964）です。HEK293T細胞を10 cm皿で70%コンフルエントまで培養し、リポフェクタミン2000を用いて製造元指示に従い10 μgプラスミドDNAをトランスフェクションしました。トランスフェクション24時間後、培地を胎児牛血清除去HEK293T標準培地に変更し、3日間連続で回収しました。先行研究[3]に従い、HEK293T培地を0.22 μmフィルターで濾過し、100 kDa再生セルロースアミコン遠心フィルターユニットで超濾過濃縮し、PBS++で2回洗浄しました。EVを1 mLに濃縮し、濃度とサイズ分布をナノサイトNS300で製造元プロトコル（マルバーン、英国）により測定しました。EVを異なるHEK293T培養容器から分離し、各容器を独立した生物学的レプリカとし、各生物学的レプリカ内で3技術的レプリカ（各条件最小9サンプル総計）としました。

取り込みアッセイ

受容細胞株を6ウェルプレートで60%コンフルエントに播種し、37℃標準培養条件で24時間培養しました。標準培地を胎児牛血清フリー（FBS⁻）培地に変更し、細胞外小胞共培養前に行いました。緑色蛍光タンパク質（GFP）標識EVを、様々な用量と時間点で細胞に投与しました。共培養後、細胞を5%トリプシンで再懸濁し、約100万細胞/50 μLに濃縮してフローサイトメトリー用としました。37℃は、細胞培養とin vitro EV取り込みプラットフォーム両方で標準として使用されてきたため、アッセイでの標準です[31, 41-44]。

阻害アッセイ

低温アッセイ

EVを受容細胞と4℃で共培養し、細胞培養成長を効果的に「一時停止」し、能動的プロセスを阻害しました[45]。4℃は全ての能動的EV取り込み形式を阻害します[31, 41-44]。

固定アッセイ

受容細胞を4%パラホルムアルデヒドで氷上30分間固定し、PBSで即座に洗浄後、EVと共培養して全ての能動的EV取り込みを阻害しました。

ImageStreamX取得

取得は、INSPIREソフトウェアを用いてImageStreamX Mark IIイメージングフローサイトメーター（Luminex Corporation、シアトル、ワシントン）で実施しました。最小5000〜10,000細胞イベントを取得しました。各生物学的サンプルを3技術的レプリカウェルで複製し、個別にISxで取得しました。明視野画像をチャネル1、側方散乱（785 nm）をチャネル6で取得しました。緑色蛍光タンパク質（GFP）を488 nmアルゴンレーザー200 mWで励起し、蛍光をチャネル2（480-560 nm）で取得しました。全サンプルで60倍拡大を使用し、高感度のため低取得レートとしました。

IDEAS解析

データと画像解析は、IDEASソフトウェア（Luminex）で実施しました。ゲーティング戦略は以下の通りです：

1. 焦点ゲートを、Gradient RMS値を用いて視野焦点外の細胞を除外するために決定しました。
2. 焦点が合った細胞を、明視野面積vs明視野アスペクト比でゲートし、ダブレットとデブリを除外しました。ゲートデータを用いてヒストグラムを作成し、蛍光強度（画像内全ピクセル合計）、最大ピクセル強度（画像内最も明るいピクセル強度）、内部アルゴリズムによるスポットカウント値など、全サンプルの統計参照を生成しました。スポットカウント特徴は、適用可能なIDEASウィザードで生成しました。スポットカウント、平均強度、最大ピクセル比は、（EVあり出力値/EVなし出力値）の式で計算しました。

統計解析

全定量データをGraphPad Prism 8.1.2（サンディエゴ、カリフォルニア）で解析し、三重実施しました。データは平均±標準誤差（SEM）で提示します。統計的有意性は、非対応t検定または一元配置分散分析（ANOVA）に続くTukeyまたはDunnettの多重比較事後検定（適切な場合は対照と比較）で決定しました。p < 0.05を有意としました。

結果

CD63-eGFP標識HEK293T細胞外小胞の特性

細胞外小胞の動態と取り込み分析のため蛍光標識EVを生成するため、HEK293T細胞をCD63-eGFP融合タンパク質担持プラスミドでトランスフェクションしました。CD63はエキソソーム膜に豊富なテトラスパニンタンパク質で、EV蛍光標識の最適標的です[46, 47]。HEK293T細胞培養から消費培地を回収し、先行報告[8]通りにEVを分離しました。CD63-eGFPトランスフェクションHEK293T細胞から分離したEVと非トランスフェクションHEK293T細胞からのEVのサイズと分布を比較しました。対照とCD63-eGFPトランスフェクションHEK293T EVは、ナノトラッキングソフトウェア測定で平均中央径がそれぞれ110.28 nmと103.616 nmで、報告されているHEK293T EVサイズと整合しました[13, 15, 27, 48]。非トランスフェクションとCD63-eGFPトランスフェクションHEK293T細胞由来EVの中央径（p = 0.1615）と分布（p = 0.4225）に有意差は観察されませんでした。eGFP標識はHEK293T EVサイズを変化させませんでした（図1b）。

IFCアッセイでCD63-eGFPがEVと関連しているか判定しました。蛍光陰性対照として、バッファー溶液中の1.34 μMビーズ（図1c上段）は488 nm励起波長で蛍光を示さず、明視野（BF）と側方散乱（SSC）で可視でした。非標識HEK293T EVはBF、GFP、SSCで陰性で、BF閾値以下の小さなサイズと蛍光欠如を示唆しました（図1d中段）。BFでの不在は300 nm未満のEVサイズを意味し、EVスワーミングが最小限であることを示唆します。最後に、CD63-eGFP標識EVはBFで陰性、GFPチャネルで陽性で、HEK293T EVの陽性蛍光を示しました（図1c下段）。GFPチャネルの陽性信号は、単一EVまたは蛍光EV群を示唆します。これら結果は、分離HEK293T EVがHEK293Tエキソソームの先行報告と整合する標準的サイズとタンパク質マーカープロファイルを持ち、eGFP標識がHEK293T EVサイズを変化させないことを示します[5, 27]。

市販フローサイトメトリーベース法で一般的EVマーカーを測定し、全体的EVテトラスパニンプロファイルを決定しました[5]。対照とCD63-eGFP発現HEK293T細胞から分離したHEK293T EVは、CD9、CD63、CD81など標準的EVマーカーで相対蛍光単位で陽性でした（図1d）。先行報告通り、CD29もHEK293T EVとCD63-eGFPトランスフェクションHEK293T EV表面に見つかりました[5]。これら結果は、HEK293T EVの分離と標識法が、一般的HEK293Tエキソソームマーカーを持つEVをもたらすことを示します。

HEK293T EVの能動的取り込み

2種類の阻害内在化アッセイを実施しました。HEK293T EVを受容細胞と4℃（低温）で共培養、またはパラホルムアルデヒドで予め固定した受容細胞（固定）で共培養しました。処理は、生理的条件下でEVと共培養した受容細胞と比較して、受容細胞内のeGFP標識EV存在を減少させました（図2a）。低温と固定阻害アッセイは、処理なし受容細胞と比較してスポットカウント（低温: p = 0.0127、固定: p = 0.0078）、強度（低温: p = 0.0105、固定: p = 0.0374）、最大ピクセル（低温: p = 0.0159、固定: p = 0.0149）の蛍光信号を減少させ、EV取り込み阻害を示しました。これら結果は、eGFP局在と出力パラメータ増加が、以下の取り込みアッセイでHEK293T EVが内在化されることを示唆します。

HEK293T EVの用量依存的取り込み

IFCプラットフォームの標準用量曲線を開発するため、HEK293T EVをHEK293T受容細胞と37℃で、0〜20,000 EV/細胞の増加用量で共培養しました。代表的IFC画像は、EV用量増加に伴うeGFP蛍光の視覚的増加を示しました（図3a）。検出可能な最低EV数は、共培養HEK293T細胞あたり6000 EVでした。このレベルで、スポットカウント（p = 0.0012）、強度（p = 0.0075）、最大ピクセル（p = 0.0005）測定値がEVなし受容細胞より有意に大きかったです（図3b-d）。したがって、実験条件下での取り込み低閾値は6000 HEK293T EVです。同様に、10,000と20,000 EV用量では、EVなし細胞と比較してより高いスポットカウント（10,000: p = 0.0009; 20,000: p < 0.0001）、強度（10,000: p < 0.0001; 20,000: p < 0.0001）、最大ピクセル（10,000: p < 0.0001; 20,000: p < 0.0001）を示しました。高用量間比較では、6000 vs 10,000（p = 0.999）、10,000 vs 20,000（p = 0.0927）でスポットカウントに有意差なし、強度（6000 vs 10,000: p = 0.8482、10,000 vs 20,000: p = 0.999）、最大ピクセルカウント（6000 vs 10,000: p = 0.6056、10,000 vs 20,000: p = 0.5281）でも有意差なしでした。同様に6000 vs 20,000比較でもスポットカウント（p = 0.0787）と強度（p = 0.8083）に統計的差なし。最大ピクセルのみ6000 vs 20,000で有意差（p = 0.0140）。全体として、収率曲線は全パラメータ（スポット、強度、最大ピクセル、p < 0.0001）で有意な用量依存性を示しました。これら結果は、HEK293T EV取り込みが用量依存的で、細胞あたり6000 HEK293T EVの最小閾値があることを示します。

HEK293T EVの時間依存的取り込み

細胞あたり6000 EVを用い、HEK293T EVをHEK293T細胞とIFC前の共培養時間を5分から24時間まで増やしました。EV曝露時間が受容細胞内可視蛍光量に重要な役割を果たし、12時間後減少しました（図4a）。最初、30分共培養でスポットカウント有意増加（p = 0.0081）が見られ、EV取り込みへの傾向を示唆しましたが、他の取り込みパラメータ（強度: p = 0.3073、最大ピクセル: p = 0.0952）では有意差なしでした（図4b-d）。2時間共培養で、EVなし受容細胞と比較して有意に高いスポットカウント（p = 0.0028）、強度（p = 0.0420）、最大ピクセル（p = 0.0006）を記録しました。また4時間共培養でも全パラメータが対照より大きかったです（スポットカウント: p = 0.0003、強度: p < 0.0001、最大ピクセル: p < 0.0001）。強度と最大ピクセルは4、12、24時間共培養で対照より高いままでした。4時間と12時間共培養間でいずれの取り込みパラメータも差なし（スポット: p = 0.999、強度: p = 0.5797、最大ピクセル: p = 0.2489）。しかし、強度（p = 0.0191）と最大ピクセル（p = 0.0027）が12時間と24時間共培養間で減少しました（図4c, d）。用量曲線と同様、HEK293T EV取り込みは時間依存的で、4時間共培養で一貫した取り込み、12時間でピークでした。総じて、播種細胞あたり6000 EV用量と4時間共培養を後続取り込みアッセイで標準化しました。

複数細胞株によるHEK293T EV比較取り込み

EV取り込みが選択的プロセスで、EVが自起源細胞により優先的に取り込まれるという仮説をIFCで検証しました。HEK293T EVをHEK293T細胞または他細胞株：上皮（C3A肝細胞）、内皮（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、神経（SH-SY5Y神経芽腫細胞）と共培養しました。eGFP蛍光は他細胞タイプと比較してHEK293T細胞でより豊富でした（図5a）。C3AとHUVECと比較して、HEK293T細胞はHEK293T EV共培養時に有意に高い蛍光強度を示しました（C3A: p = 0.0321; HUVEC: p = 0.0055）（図5c）。また、HEK293T細胞は全他受容細胞株と比較してより高い最大ピクセルを示しました（C3A: p = 0.0221; HUVEC: p = 0.0079; SH-SY5Y: p = 0.0486）（図5b）。強度について、SH-SY5Y細胞はHEK293T EV共培養時にHUVECより有意に高かったです（p = 0.0304）。これら結果は、HEK293T EVがin vitroで他細胞株と比較してHEK293T細胞により選択的に取り込まれることを支持します。

神経細胞分化状態とHEK293T EV内在化

EVが神経疾患標的の治療と配信目的で関与していることから、ヒト神経幹細胞（hNSC）と成熟ヒトニューロンを受容細胞株として用い、受容細胞分化状態がEV選択的取り込みに役割を果たすか検証しました。IFC代表画像は両細胞タイプでの取り込み視覚的証拠を示しましたが、最大eGFP局在はhNSCでした（図6a）。HEK293T EV共培養hNSCは、成熟ニューロンと比較してより高いスポットカウント（p = 0.0082）と最大ピクセル（p = 0.0083）を示しました。これら結果は、神経細胞分化状態がHEK293T EV取り込みに影響することを示唆します。

考察

EV in vitro取り込み標準化プロセス

EV国際専門家グループが、取り込みアッセイでのEV最小有効用量効果的決定の必要性を強調しました[26]。ここでは、分野で効果的に採用可能なシステムを開発しました。EV取り込み分析には課題があります。我々と他者が観察したように、EV用量と曝露時間を変えると結果が異なる可能性があります[26]。ここではHEK293T EV用量と濃度を運動論的変数として扱いました。また、in vitro最小有効用量がEVのin vivo生体分布をより均一に予測し、EV治療薬と配信のより一貫したin vivo投与パラメータ開発に使用できる可能性があります。in vivoマウスEV生体分布研究では、HEK293T EV用量増加が臓器間相対EV分布をシフトさせました[27]。膀胱がんEVを用いた先行in vitro研究[39]と同様に、HEK293T EVは本研究で最小有効用量6000 EVでの強い用量依存性を示しました。我々はin vitroで粒子数/細胞を感度の高い用量測定として初めて使用し、これは粒子数/体重を用いるin vivoモデルとより良く相関します。データは6000 EV後の用量飽和限界も示し、より高用量では限定的利益しかない可能性を示唆し、将来のin vivo用量範囲研究に情報提供します。

EV取り込み測定のもう一つの交絡変数は、EV取り込みへの潜在的時間効果です。我々のシステムでは、2時間で早期取り込み、12〜24時間で潜在的減少という強い時間依存性を見出しました。同様に、膀胱がん細胞、腫瘍細胞などを用いた少数研究で、15分から24時間までの時間依存性が報告されています[29-33, 39, 43, 49]。HEK293T EVで見られた24時間共培養での低値は、細胞分裂や早期時間点で内在化されたEVのリサイクル/分解による可能性があります[50]。具体的に、EVが内在化後に分解されるか、内在化後に24時間後に放出されることが示されているため、より長いインキュベーションは不正確な内在化読み取りを生む可能性があります[31, 50]。本研究は、HEK293T EV取り込みの時間依存的収率曲線について、IFCで視覚的かつ定量的証拠を提供した最初の研究です。

ISEVポジションペーパーが示唆するように、EV標識選択が取り込みに影響する可能性があり、本研究で使用したGFP標識法のような低侵襲技術が必要です。具体的に、調査参加研究者の72%が、適切な対照がない限り脂質染色実験は信頼できないと主張しています[26]。EV染色剤は小型EV内容物と確実に相関せず、小胞サイズを増大させる可能性さえあります。誤標識リポ蛋白質とタンパク質含有量の汚染、染色剤凝集が偽陽性に寄与します[51, 52]。したがって、CD63とeGFPを融合させてHEK293T EVを標識しました。他のタンパク質標識報告と同様に、HEK293T EVはGFP陽性で、直径に観察された差異なく標準的EV表面タンパク質組成を維持しました[38, 46]。ただし、特定EVタンパク質でEVを標識すると、それぞれのマーカーを発現するEVサブタイプのみ追跡可能になる制限があることに注意が必要です。他の潜在的制限として、蛍光強度がタンパク質発現レベル、EV膜標識効率、光源励起強度に依存する可能性があります[53]。しかし、IFCは感度が高く、100 nm範囲でのCD63-GFP粒子の正確な視覚化と共に低蛍光強度を検出できます[38, 54]。

選択的取り込み

EVは選択的取り込みをもたらすタンパク質や他のシグナルを表示します[22, 23, 55]。EV生合成の第一歩が形質膜陥入であるため、EV膜はドナー細胞膜と比較して類似のタンパク質、受容体、接着分子、インテグリンを含みます[22, 24, 55]。ドナー細胞により制御されるEV膜上の脂質組成とテトラスパニンタンパク質が、受容細胞とのEV嗜み性に寄与する可能性があります[23, 34, 56]。MSC EVは単球への近接性にもかかわらず、MSCへ選択的に内容物を輸送しました[24]。対照的に、天然EVがEV起源に関わらず全細胞タイプで等しく取り込まれると報告する研究もあります[11, 22, 25, 57]（イメージングや機能ノックダウンアッセイ利用時）。IFCプラットフォームを用いて、HEK293T細胞外小胞が他報告細胞株よりHEK293T細胞でより多く取り込まれることを発見し、固有のEV取り込み特異性を示唆しました。この結果とIFCの汎用性により、EVソースを特定受容細胞標的向けに適切に選択・分析できます。我々の知識では、IFCを用いてHEK293T EV特異性を分析した最初の研究です。

自己選択性に加え、受容細胞分化状態がEV取り込みに役割を果たすと仮説されています[32, 58, 59]。我々のグループと他者が示したように、EVは中枢神経系で治療効果を持ち、神経発達と成人の細胞機能を調節することが知られています[3, 7-9, 60]。ここでは初めて、ニューロン分化状態がEV取り込みに影響し、ヒト神経幹細胞が成熟ニューロンより有意に多くHEK293T EVを取り込むことを示しました。未熟hNSCが静止成熟ニューロンより外因性EVをより活発に内在化します。hNSCが培養で高増殖性細胞であるため、非特異的に栄養素とEVを内在化する可能性があります。同様に、未熟樹状細胞が成熟樹状細胞より高レベルでEVを内在化しました[32, 59]。しかし、骨髄前駆細胞研究では、成熟樹状細胞とマクロファージが未熟樹状細胞と単球より多くEVを内在化しました[58]。観察された差異は、さらに分化した骨髄細胞の食作用活性に起因する可能性があります。選択的取り込みを支持するin vitro証拠により、HEK293T EVは将来の治療応用で未分化ニューロン調節に使用できます。

結論

要約すると、HEK293T EV取り込み動態を定量化する定量的高スループットプラットフォームをさらに開発しました。このプラットフォームは、他ドナーEVと受容細胞タイプ、リポソームと合成ナノ粒子配信ベクターアッセイに拡張可能です。重要なことに、HEK293T EV取り込みが選択的プロセスで、HEK293T細胞への特異性を持つことを発見しました。ここで開発したIFCアッセイは、in vivo用量増加と生体分布研究で使用されるパラメータをより良く定義し、in vivoでのEV取り込み結果予測モデルに不可欠な情報を提供できます。