イメージングフローサイトメトリーを使用したHEK293T細胞外小胞取り込みの速度論と特異性

はじめに

細胞外小胞の研究は、天然および人工の細胞外小胞（EV）の治療および診断の有用性により、急成長している分野です。 EVの直径は50〜1000 nmで、すべての細胞タイプから生成され、CD63、CD81、CD9などの膜貫通タンパク質が豊富に含まれています。脂質;タンパク質; DNA、RNA、mRNA、およびマイクロRNA [1,2,3,4,5]。 EVコンテンツ、特にアクティブなmRNAとmiRNAは、標的細胞のdenovo翻訳と翻訳後調節を介したレシピエント細胞の調節に関与しています[4、6]。動的EVの取り込みと内部移行を理解して変更することで、最終的には、治療効果を得るのに十分な濃度の標的細胞へのEVコンテンツの最適化された配信につながります。

かつて「細胞のゴミ」と考えられていたEVは、生体適合性、免疫原性と毒性の低さ、反復投与能力、さまざまな投与経路、薬物送達の可能性など、多くの利点があるため、細胞治療の代替として利用されてきました。および遺伝療法[3]。私たちのグループは、脳卒中や外傷性脳損傷における神経幹細胞由来のEVのプラスの効果を以前に報告しました。マウスとブタの脳卒中モデルの両方で、EVは脳卒中後の組織と機能の回復を改善しました[3、7、8]。また、EVは、齧歯類の外傷性脳損傷モデルにおいて機能的な利点を備えた神経保護作用があることを示しました[9]。これらの観察された効果とEVの将来の可能性にもかかわらず、EVの取り込みの特異性と動態についてはほとんど理解されておらず、EV治療薬の診療所への翻訳を妨げる可能性があります。

EVはまた、転移ベクターとして設計されており、ナノ粒子治療および送達ベクターの代替として、遺伝子治療および化合物を含む治療薬がロードされています[4、10、11、12]。 HEK293T細胞は、その固有の急速な増殖、高いEV収量、および遺伝子操作の容易さにより、EVプロデューサー細胞として広く使用されています[13、14、15、16、17]。 HEK293T EVは、乳がんのmiRNA治療を含む遺伝子治療を提供し[12]、神経鞘腫モデルで化学療法薬および治療用タンパク質構築物を提供するために使用されてきました[18]。インビトロで細胞毒性を評価する合成ナノ粒子研究と同様に、MTT毒性アッセイは、無負荷のHEK293T EVの毒性が低く、化学療法剤を負荷した場合の細胞毒性が高いことを示しました[10、18、19、20、21]。 HEK293T EVが豊富に利用されているため、この研究ではそれらの動態と特異性を分析しました。

選択的または特定の取り込みとは、特定の細胞タイプをターゲットとするEVの自然な能力を指します。 EVの内部移行のメカニズムについては豊富な証拠があり、取り込みの特異性についてはほとんどコンセンサスがありません[22]。多くの場合、EVは親細胞と同様のレシピエント細胞による選択的取り込みを示し、上皮細胞は他のレシピエント細胞よりも多くの上皮由来EVを内在化し[23、24]、間葉系幹細胞（MSC）はMSC由来EVのかなりの量を内在化します。 invitroで他の細胞株と[24]。しかし、他の研究では、EVはすべての細胞型に内在化され、in vivoで投与されると非選択的な生体内分布を示すことがわかりました[22、25]。 EVの治療の可能性と関心は計り知れませんが、EVの取り込み特異性の理解には欠陥があります。 EV取り込みの特異性をよりよく理解することにより、対象のレシピエント細胞によって選択的に内在化されるEVプロデューサー細胞を適切に選択し、EVの治療適用性を向上させることができます。

EVの取り込み結果が矛盾する潜在的な理由は、線量と時間の影響の分析を含む、測定プラットフォームの標準化の欠如です。最近、国際細胞外小胞学会（ISEV）の専門家グループが、EV摂取に関する他の交絡因子の中でも特に線量と時間の分析の必要性を強調するポジションペーパーを発表しました[26]。このグループは、「1回の投与ですべてに対応できるわけではない」と述べ、その投与はEVの取り込みまたは選択性に影響を与える可能性がある[26]。 HEK293T EVの投与量を増やすと、生体内分布パターンが変化します[27]。血清由来EVの取り込みプロファイルは、用量によって有意に変化しました[28]。さらに、EVとレシピエント細胞の共培養時間は15分から48時間の範囲であり[24、29、30、31、32、33]、取り込み測定値が変わる可能性があります。 EVの研究者や業界で採用された場合、最小有効量を特定するのに役立つ標準用量と時間曲線を決定するための定量化可能で信頼性の高いプロセスは、より堅牢で有用な研究につながる可能性があります。

以前は、研究者は、EVの取り込みを分析するために、共焦点顕微鏡を含むさまざまな形態の低スループット顕微鏡とともに標準フローサイトメトリーを使用していました[32、33、34]。ただし、これらのテクノロジにはいくつかの制限があります。共焦点顕微鏡は時間がかかり、主観的である可能性があります。従来のフローサイトメーターは、細胞範囲内の生物学的粒子を測定するように設計されており、EVの群れや偶然の一致を区別できず、トリガーによってノイズが増加します[35、36、37、38]。 ISEVグループが述べたように、従来のフローサイトメトリーの物理的限界に対する認識が高まっており、100 nm範囲の検出限界を備えた特殊なフローサイトメトリーの需要が浮き彫りになっています[26、38]。イメージングフローサイトメトリー（IFC）は、フローサイトメトリーの高スループットの定量的性質と、直径100nmまでの本質的に小さな蛍光粒子を分解できる蛍光イメージング技術を組み合わせたものです[38]。 IFC機能により、ノイズ/バックグラウンドが低くなり、スウォーミングが減少し、結合デバイスが帯電して画像が鮮明になります[37、39]。これらの特性は、正確で定量化可能なEV取り込みプラットフォームとして、ハイスループットな方法でEVと取り込みを視覚的に確認するためのゲーティング戦略の開発に役立ちます[36、37、40]。

この研究では、CD63-eGFPを発現するHEK293T細胞が、治療法の開発で一般的に使用されているため、EV産生のドナー細胞株として利用されました。単離された蛍光EVは、神経細胞および内皮細胞を含むレシピエント細胞株と共培養されました。取り込みはIFCを使用して定量化され、invitro細胞システムの重要な動的EV取り込みおよび内部移行機能を測定するための標準化されたプラットフォームが得られました。さらに、選択的なEV取り込みを解明するために、さまざまな条件および培養細胞株での蛍光EV取り込みの取り込みを定量化するプロセスに関するデータを提供します。

材料と方法

細胞培養

ヒト胎児腎臓細胞（HEK293T）はATCCから購入し、10％ウシ胎児血清、100 U / mLペニシリン、および100μg/ mLストレプトマイシンを含むDMEMで培養しました。ヒト神経幹細胞（hNSC）、SH-SY5Y神経細胞、C3A肝上皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、およびニューロンはすべて、37°C​​、5％CO _{2 細胞外小胞取り込みアッセイの前。}

EVのラベル付けと分離

CD63-eGFPプラスミドDNAはAddgene（＃62964）から入手しました。 CD63-pEGFP C2は、Paul Luzio（Addgeneプラスミド＃62964）からの贈り物でした。 HEK293T細胞を10cmディッシュで70％のコンフルエンシーまで培養し、製造元の指示に従ってLipofectamine2000を使用して10μgのプラスミドDNAをトランスフェクトしました。トランスフェクションの24時間後、培地をウシ胎児血清を含まない標準のHEK293T培地に交換し、3日間連続して回収しました。前述のように[3]、HEK293T培地を0.22μmフィルターでろ過し、100 kDaの再生セルロースAmicon遠心フィルターユニットを使用した限外ろ過で濃縮し、PBS ++で2回洗浄しました。 EVは1mLに濃縮され、濃度とサイズの分布は、製造元のプロトコル（Malvern、UK）によってNanosightNS300で測定されました。 EVは異なるHEK293T培養容器から分離され、各容器は別々の生物学的複製と見なされ、各生物学的複製内に3つの技術的複製があります（各条件で合計9つ以上のサンプル）。

取り込みアッセイ

レシピエント細胞株は、37℃の標準的な培養条件下で、6ウェルプレートに60％のコンフルエンシーで24時間播種されました。細胞外小胞の共培養の前に、標準培地をウシ胎児血清を含まない（FBS-）培地に変更しました。緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きEVは、さまざまな用量と時点で細胞に投与されました。共培養後、細胞を5％トリプシンに再懸濁し、フローサイトメトリー用に50μLあたり約100万個の細胞に濃縮しました。摂氏37度は、細胞培養とin vitro EV取り込みプラットフォームの両方に使用されている標準であるため、私たちのアッセイにおけるEV取り込み実験の標準です[31、41、42、43、44]。

抑制性アッセイ

コールドアッセイ

EVは4°Cでレシピエント細胞と共培養され、細胞培養の成長を効果的に「一時停止」し、活発なプロセスを阻害しました[45]。摂氏4度は、EVの取り込みのすべてのアクティブな形式を抑制します[31、41、42、43、44]。

固定アッセイ

レシピエント細胞を4％パラホルムアルデヒドで氷上で30分間固定し、EVとの共培養の直前にPBSで洗浄して、EVの取り込みのすべての活性型を阻害しました。

ImageStreamXの取得

取得は、INSPIREソフトウェアを使用して、ImageStreamX Mark IIイメージングフローサイトメーター（Luminex Corporation、ワシントン州シアトル）で実行されました。少なくとも5000〜10,000のセルイベントが取得されました。各生物学的サンプルは、3つの技術的な複製ウェルで複製され、ISxで個別に取得されました。明視野画像はチャネル1で収集され、側方散乱（785 nm）はチャネル6で収集されました。緑色蛍光タンパク質（GFP）は、200mWで488nmのアルゴンレーザーによって励起され、チャネル2（480-560 nm）で蛍光が収集されました。すべてのサンプルで60倍の倍率が使用され、高感度のために低い取得率が使用されました。

IDEAS分析

データと画像の分析は、IDEASソフトウェア（Luminex）を使用して実施されました。ゲーティング戦略は次のとおりです。

1. 1。

   フォーカスゲートは、勾配RMS値を使用して、フォーカスフィールドにないセルを排除するように決定されました。

2. 2。

   集束された細胞は、面積明視野対アスペクト比明視野を使用してダブレットおよび破片を排除するためにゲート制御された。ゲートデータを使用してヒストグラムを作成し、蛍光強度（画像内のすべてのピクセルの合計）、最大ピクセル強度（画像内の最も明るいピクセルの強度）、およびすべてのサンプルの内部アルゴリズムによるスポットカウント値を測定する統計参照を生成しました。スポットカウント機能は、該当するIDEASウィザードを使用して生成されました。スポット数、平均強度、最大ピクセル比は、式（EVありの出力値/ EVなしの出力値）で計算されます。

統計

すべての定量的データは、GraphPad Prism 8.1.2（カリフォルニア州サンディエゴ）を介して分析され、3回実行されました。データは、平均±平均の標準誤差（SEM）として表されます。統計的有意性は、対になっていない T を使用して決定されました テューキーまたはダネットの多重比較を事後的に使用して、必要に応じて対照と比較したテストまたは一元配置分散分析（ANOVA）。 p <0.05は有意であると見なされました。

結果

CD63-eGFP–タグ付きHEK293T細胞外小胞の特性

細胞外小胞の動態と取り込みを分析するための蛍光標識EVを生成するために、HEK293T細胞にCD63-eGFP融合タンパク質を保持するプラスミドをトランスフェクトしました。 CD63は、一般的にエクソソームの膜に富むテトラスパニンタンパク質であり、EV蛍光タグ付けの最適なターゲットになります[46、47]。使用済み培地はHEK293T細胞培養から収集され、EVは以前に報告されたように分離されました[8]。 CD63-eGFPをトランスフェクトしたHEK293T細胞から分離したEVのサイズと分布を、トランスフェクトしていないHEK293T細胞と比較しました。コントロールとCD63-eGFPをトランスフェクトしたHEK293TEVは、ナノトラッキングソフトウェアで測定した場合、それぞれ平均直径中央値110.28nmと103.616nmを示しました（図1a）。これは、報告されているHEK293T EVのサイズと一致しています[13、15、27 、48]。直径の中央値に有意差はありません（ p =0.1615）および分布（ p =0.4225）トランスフェクトされていないHEK293T細胞とCD63-eGFPでトランスフェクトされたHEK293T細胞から分離されたEVが観察されました。 eGFPラベリングはHEK293TEVのサイズを変更しませんでした（図1b）。

CD63-eGFPでタグ付けされたHEK293TEVの特性評価。 EVは、HEK293T（コントロール）およびHEK293Tを発現するCD63-eGFP細胞培養培地から分離されました。 a ナノトラッキングソフトウェアを介して記録された代表的なEVサイズ分布。 b トランスフェクトされたHEK293TEVとトランスフェクトされていないHEK293TEVの平均直径分布の定量化。 c ネガティブコントロールビーズ、HEK293TコントロールEV、およびCD63-eGFPタグ付きEVのIFC画像。 BFは明視野を意味し、GFPは緑色蛍光タンパク質（488 nm励起レーザー）を意味し、SSCは側方散乱を意味します。 GFPチャネルの陽性eGFPは、蛍光HEK293TEVを意味します。 d トランスフェクトされていないHEK293TEVおよびHEK293TCD63-eGFPEVのフローサイトメトリーベースのMACSPlex表面マーカー発現。相対蛍光で測定した場合、両方のEVソースはCD29、CD9、CD63、およびCD81に対して陽性です（陽性の場合はXで示されます）。バーは平均±SEMを表します。 N =3;対応のないT検定。 n.s. p を意味します> 0.05

CD63-eGFPがEVに関連しているかどうかを判断するためにIFCアッセイを実施しました。蛍光ネガティブコントロールとして、緩衝液中の1.34μMビーズ（図1c、上）は、488 nmの励起波長にさらされたときに蛍光を欠きましたが、明視野（BF）および側方散乱（SSC）では見えました。タグなしのHEK293TEVは、BF、GFP、およびSSCで陰性であり、BFしきい値を下回るサイズが小さく、蛍光がないことを示しています（図1d、中央）。 BFがないということは、EVのサイズが300 nm未満であることを意味します。これは、EVのスウォーミングが最小限であることを示しています。最後に、CD63-eGFPタグ付きEVは、BFで陰性、GFPチャネルで陽性であり、HEK293T EVの陽性蛍光を示します（図1c、下）。 GFPチャネルの正の信号は、単一のEVまたは蛍光EVのグループを示している可能性があります。まとめると、これらの結果は、分離されたHEK293T EVがHEK293Tエクソソームの以前の報告と一致する標準サイズとタンパク質マーカープロファイルを持ち、eGFP標識がHEK293T EVのサイズを変更しないことを示しています[5、27]。

一般的なEVマーカーを測定するために市販のフローサイトメトリーベースの方法を使用して、全体的なEVテトラスパニンプロファイルを決定しました[5]。コントロールおよびCD63-eGFPを発現するHEK293T細胞から単離されたHEK293TEVは、相対蛍光単位で測定した場合、CD9、CD63、およびCD81を含む標準EVマーカーに対して陽性でした（図1d）。以前に報告されたように、CD29はHEK293TEVおよびCD63-eGFPでトランスフェクトされたHEK293TEVの表面にも見られました[5]。これらの結果は、HEK293T EVの分離とタグ付けの方法により、一般的なHEK293Tエクソソームマーカーを備えたEVが得られることを示しています。

HEK293TEVの能動的取り込み

2つの抑制性内在化アッセイを実施した。 HEK293T EVは、4°Cでレシピエント細胞と共培養したか（低温）、または事前にパラホルムアルデヒドで固定したレシピエント細胞と共培養しました（固定）。処理により、生理学的条件下でEVと共培養されたレシピエント細胞と比較して、レシピエント細胞におけるeGFP標識EVの存在が減少しました（図2a）。コールドおよび固定阻害アッセイにより、スポット数が減少しました（コールド： p =0.0127、修正済み： p =0.0078）、強度（コールド： p =0.0105、修正済み： p =0.0374）、および最大ピクセル（コールド： p =0.0159、修正済み： p =0.0149）処理なしのレシピエント細胞における蛍光シグナルの、EV取り込みの阻害を示します。これらの結果は、eGFPの局在化と出力パラメーターの増加が、HEK293TEVが以下の取り込みアッセイのために内在化されていることを示していることを示唆しています。

EV内在化阻害アッセイ。 HEK293T細胞は、さまざまな条件下でHEK293TEVと共培養されました。コントロール（37°C）は、生理学的な37°C環境での共培養を指します。寒さは4°Cの環境での共培養を指します。固定阻害とは、共培養前にレシピエント細胞をPFA固定したアッセイを指します。 a 受信者の細胞の代表的なIFC画像。列1、BFは、明視野を示します。列2、GFPは緑色蛍光タンパク質（488 nm励起レーザー）を示し、列3はBFとGFPの融合を示します。コントロールは、EVの内部移行を表す正のGFPを示しています。 b – d スポットカウント、平均蛍光強度、および最大ピクセルを介した、コントロールと比較した阻害アッセイの定量化。バーは平均±SEMを表します。 N =3;一元配置分散分析に続いて、対照と比較したテューキーの事後検定。 * p <0.05; *** p <0.01

用量依存のHEK293TEV取り込み

IFCプラットフォームの標準的な線量曲線を作成するために、HEK293T EVをHEK293Tレシピエント細胞と、37°C​​で細胞あたり0〜20,000EVの範囲の線量で共培養しました。代表的なIFC画像は、EVの線量を上げるとeGFP蛍光の視覚的な増加を示しました（図3a）。検出できたEVの最小数は、共培養されたHEK293T細胞あたり6000EVでした。このレベルでは、スポットカウント（ p =0.0012）、強度（ p =0.0075）、および最大ピクセル（ p =0.0005）測定値は、EVのないレシピエント細胞よりも有意に大きかった（図3b–d）。したがって、6000 HEK293T EVの線量は、実験条件での取り込みの下限しきい値です。同様に、10,000および20,000 EVの線量では、スポット数が多かった（10,000： p =0.0009; 20,000： p <0.0001）、強度（10,000： p <0.0001; 20,000： p <0.0001）および最大ピクセル（10,000： p <0.0001; 20,000： p <0.0001）EVのないセルと比較。高線量を比較すると、スポット数に有意差はありません（6000対10,000： p =0.999、10,000対20,000： p =0.0927）、強度（6000対10,000： p =0.8482、10,000対20,000： p =0.999）、および最大ピクセル数（6000対10,000： p =0.6056、10,000対20,000： p =0.5281）6000〜10,000、および10,000対20,000。同様に、6000と20,000を比較すると、スポット数に統計的な違いはありません（ p =0.0787）および強度（ p =0.8083）。最大ピクセル数には、6000と20,000（ p ）の間に大きな違いがあります。 =0.0140）。全体として、イールドカーブは、すべてのパラメーター（スポット、強度、最大ピクセル、 p ）で有意な線量依存性を示しています。 <0.0001）。これらの結果は、HEK293T EVの取り込みが用量依存的であり、細胞あたり6000 HEK293TEVの最小しきい値があることを示しています。

HEK293T EVの取り込みには、6000EVの最小しきい値で線量効果があります。 HEK293T細胞は、HEK293TEVSと0から20,000 /細胞まで増加する用量で共培養されました。 a それぞれのEV線量でのレシピエント細胞の代表的なIFC画像。 GFPの局在は、HEK293TEVの取り込みを意味します。 b – d スポットカウント、平均蛍光強度、および最大ピクセル比による、コントロールおよび各グループと比較した線量アッセイの定量化。バーは平均±SEMを表します。 N =3;一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。 * p <0.05; *** p <0.01

HEK293TEVの一時的な取り込み

細胞あたり6000個のEVを使用して、HEK293T EVをHEK293T細胞と共培養し、IFCの前に5分から24時間の範囲で時間を増やしました。 EV曝露の長さは、レシピエント細胞の可視蛍光量に重要な役割を果たし、12時間後に減少しました（図4a）。当初、30分間の共培養はスポット数の有意な増加を示しました（ p =0.0081）EVの取り込みに向かう可能性のある傾向を示唆していますが、他の取り込みパラメータではそうではありません（強度： p =0.3073、最大ピクセル： p =0.0952）（図4b–d）。共培養の2時間で、スポット数が大幅に増加しました（ p =0.0028）、強度（ p =0.0420）、および最大ピクセル（ p =0.0006）EVのないレシピエントセルと比較して記録されました。繰り返しますが、共培養の4時間で、すべてのパラメーターはコントロールよりも大きかった（スポット数： p =0.0003、強度： p <0.0001、最大ピクセル： p <0.0001）。強度と最大ピクセルは、共培養の4、12、および24時間でコントロールよりも高いままでした。共培養の4時間と12時間の間で取り込みパラメーターに違いはありませんでした（スポット： p =0.999、強度： p =0.5797;最大ピクセル： p =0.2489）。ただし、強度（ p =0.0191）、および最大ピクセル（ p =0. 0027）共培養の12時間から24時間の間に減少しました（図4c、d）。用量曲線と同様に、HEK293T EVの取り込みは時間に依存し、4時間のインキュベーションで一貫したEVの取り込みがあり、12時間でピークになります。まとめると、播種された細胞あたり6000 EVの線量と4時間の共培養が、以下の取り込みアッセイで標準化されています。

HEK293TEVの取り込みは時間に依存します。 HEK293T細胞は、6000 HEK293T EV /細胞と長時間共培養しました。 a それぞれ、レシピエント細胞の代表的なIFC画像。 GFPの局在は、HEK293TEVの取り込みの増加を意味します。 b – d スポットカウント、平均蛍光強度、および最大ピクセル比を介した、コントロールおよび各グループと比較した時間経過アッセイの定量化。バーは平均±SEMを表します。 N =3;一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。 * p <0.05; *** p <0.01

複数の細胞株によるHEK293TEVの取り込みの比較

EVの取り込みは、EVがそれら自身の起源の細胞によって優先的に取り込まれる選択的なプロセスであるという仮説は、IFCを使用してテストされました。 HEK293T EVは、HEK293T細胞または他の細胞株（上皮（C3A肝細胞）、内皮（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、神経（SH-SY5Y神経膠芽細胞腫細胞））と共培養しました。 eGFP蛍光は、他の細胞タイプと比較してHEK293T細胞でより豊富です（図5a）。 C3AおよびHUVECと比較して、HEK293T細胞は有意に高い蛍光強度を示しました（C3A： p =0.0321; HUVEC： p =0.0055）（図5c）、HEK293TEVと共培養した場合。さらに、HEK293T細胞の最大ピクセル数は高かった（C3A： p =0.0221; HUVEC： p =0.0079; SH-SY5Y： p =0.0486）（図5d）他のすべてのレシピエント細胞株（図5b）と比較。強度に関しては、SH-SY5Y細胞はHEK293T EVと共培養した場合にHUVECよりも有意に高かった（ p =0.0304）。これらの結果は、invitroで他の細胞株と比較してHEK293T細胞によるHEK293TEVの選択的取り込みをサポートしています。

HEK293T EVは、HEK293T細胞よりも取り込みの優先度を示します。 HEK293T EVは、HEK293T細胞、C3A上皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、およびSY5Y神経細胞と共培養されました。 a HEK293TEVと共培養されたレシピエント細胞の代表的なIFC画像。 b – d スポットカウント、平均蛍光強度、および最大ピクセル比を介した、コントロールおよび相互と比較したEV取り込み優先アッセイの定量化。バーは平均±SEMを表します。 N =3;一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定。 * p <0.05; *** p <0.01

神経細胞の分化状態とHEK293TEVの内部移行

EVは神経疾患を標的とする治療および送達の目的に関与しているため、ヒト神経幹細胞（hNSC）および成熟ヒトニューロンをシステムのレシピエント細胞株として使用して、レシピエント細胞の分化状態が選択的取り込みに役割を果たすかどうかを調べました。 EVの。 IFCからの代表的な画像は、両方の細胞型での取り込みの視覚的証拠を示しましたが、hNSCで最大のeGFP局在を示しました（図6a）。 HEK293T EVと共培養されたhNSCは、スポット数が多くなります（ p =0.0082）および最大ピクセル（ p =0.0083）成熟ニューロンと比較して。総合すると、これらの結果は、神経細胞の分化状態がHEK293TEVの取り込みに影響を与えることを示唆しています。

神経分化状態はHEK293TEVの取り込みに影響を与えます。 HEK293T EVは、成熟したヒトニューロンおよびヒト神経幹細胞と共培養されました。 a HEK293TEVと共培養されたレシピエント細胞の代表的なIFC画像。 b – d スポットカウント、平均蛍光強度、および最大ピクセル比を介した、コントロールおよび相互と比較したEV取り込み優先アッセイの定量化。バーは平均±SEMを表します。 N =3;対になっていない T テスト。 * p <0.05; *** p <0.01（0 EV（コントロール）と比較）

ディスカッション

EV invitro取り込み標準化プロセス

EVに関する国際的な専門家のグループは、取り込みアッセイのためにEVの最小有効量を効果的に決定する必要性を強調し、ここで私たちは現場で効果的に採用できるシステムを開発しました[26]。 EVの取り込みを分析する際には課題があります。たとえば、私たちや他の人が観察したように、EVの線量と曝露時間を変更すると結果が異なる可能性があります[26]。 HEK293TEVの用量と濃度を速度論的変数として扱いました。また、インビトロでの最小有効量は、ＥＶのインビボでの生体内分布をより均一に予測し、ＥＶ治療および送達のためのより一貫したインビボ投与パラメータを開発するために使用され得る。 in vivoマウスEV生体内分布研究では、HEK293T EVの用量を増やすと、臓器内の相対EV分布がシフトしました[27]。膀胱がんEVを使用した以前のinvitro研究での発見[39]と同様に、HEK293T EVは、我々の研究では6000EVで最小有効量で強い用量依存性を示しました。細胞あたりの粒子をinvitroでの高感度線量測定として使用したのは初めてであり、体重あたりの粒子を使用したinvivoモデルとの相関性が高くなっています。私たちのデータはまた、6000 EV後の線量飽和限界を示しており、より高い線量では効果が限られている可能性があることを示すことで、将来のinvivo線量設定試験に情報を提供する可能性があります。

EVの取り込みを測定するもう1つの交絡変数は、EVの取り込みに対する潜在的な時間的影響です。私たちのシステムでは、2時間という早い時期に取り込みを伴う強い時間依存性が見られ、12時間から24時間の間に潜在的な減少が見られました。私たちの調査結果と同様に、時間依存性は、膀胱がん細胞、腫瘍細胞、および15分から24時間までの取り込みを伴うその他の研究で報告されました[29、30、31、32、33、39、43、49]。 HEK293T EVで見られるように、共培養の24時間での低い値は、細胞分裂または初期の時点で内在化されたEVのリサイクル/分解の結果である可能性があります[50]。具体的には、EVは内在化されてから分解されるか、内在化されてから24時間後に放出されることが示されているため、インキュベーションが長くなると、不正確な内在化の読み取り値が生成される可能性があります[31、50]。私たちの研究は、IFCを使用して、HEK293TEVの取り込みに関する時間依存のイールドカーブの視覚的および定量的な証拠を提供する最初の研究です。

ISEVのポジションペーパーが示唆しているように、EVラベルの選択は取り込みに影響を与える可能性があり、私たちの研究で使用されたGFPタグ付け方法などのより破壊的でない技術を必要とします。具体的には、調査に参加した研究者の72％が、適切な管理が行われない限り、脂質色素実験は信頼できないと主張しています[26]。 EV色素は、少量のEV含有量と確実に相関するわけではなく、ベシクルサイズを大きくすることさえあります。誤って標識されたリポタンパク質とタンパク質含有量の汚染および色素凝集が偽陽性の一因となった[51、52]。したがって、CD63とeGFPを融合して、HEK293TEVにラベルを付けました。タンパク質タグ付けに関する他の報告と同様に、HEK293T EVはGFP陽性であり、直径に違いは見られず、標準的なEV表面タンパク質組成を維持していました[38、46]。それにもかかわらず、特定のEVタンパク質でEVをラベル付けすると、追跡がそれぞれのマーカーを発現するEVの少数のサブタイプのみに制限される可能性があることに注意することが重要です。他の潜在的な制限は、蛍光強度がタンパク質発現レベル、EV膜標識の効率、および光源の励起強度に依存することである可能性があります[53]。ただし、IFCは感度が高く、100 nmの範囲でCD63-GFP粒子を正確に可視化して低蛍光強度を検出します[38、54]。

選択的取り込み

EVは、選択的な取り込みをもたらす可能性のあるタンパク質やその他の信号を表示します[22、23、55]。 EV生合成の最初のステップは原形質膜の陥入であるため、ドナー細胞膜と比較した場合、EV膜には同様のタンパク質、受容体、接着分子、およびインテグリンが含まれています[22、24、55]。ドナー細胞によって調節されるEV膜上の脂質組成とテトラスパニンタンパク質は、レシピエント細胞とのEV向性に寄与する可能性があります[23、34、56]。 MSC EVは、単球に近接しているにもかかわらず、コンテンツをMSCに選択的に輸送しました[24]。対照的に、他の人は、イメージングまたは機能的ノックダウンアッセイを利用する場合、EVの起源に関係なく[11、22、25、57]、自然のEVがどの細胞タイプにも等しく取り込まれたと報告しています。 IFCプラットフォームを使用して、HEK293T細胞外小胞が、報告されている他の細胞株よりもHEK293T細胞に大量に取り込まれることを発見しました。これは、固有のEV取り込み特異性を示唆しています。この結果とIFCの多様性により、EVソースを適切に選択して分析し、特定の受信者セルをターゲットにすることができます。私たちの知る限り、これはHEK293TEVの特異性を分析するためにイメージングフローサイトメトリーを利用した最初の研究です。

自己選択性に加えて、レシピエント細胞の分化状態は、EVの取り込みに役割を果たすと仮定されています[32、58、59]。私たちのグループや他のグループが示しているように、EVは中枢神経系に治療効果があり、神経発達と成人の細胞機能を調節することが知られています[3、7、8、9、60]。ここで初めて、ニューロンの分化状態がEVの取り込みに影響を及ぼし、ヒト神経幹細胞は成熟したニューロンと比較してHEK293TEVの取り込みが有意に多かった。未成熟なhNSCは、静止状態の成熟したニューロンよりも積極的に外因性EVを内在化します。 hNSCは培養中の増殖性の高い細胞であるため、栄養素やEVを非特異的に内在化する可能性があります。同様に、未成熟樹状細胞は、成熟樹状細胞よりも高いレベルでEVを内在化した[32、59]。しかし、骨髄前駆細胞を用いた別の研究では、成熟樹状細胞とマクロファージが未成熟樹状細胞と単球よりも多くのEVを内在化することがわかりました[58]。観察された違いは、さらに分化した骨髄細胞の食作用に起因する可能性があります。選択的取り込みをサポートするinvitroの証拠により、HEK293T EVは、将来の治療用途で未分化ニューロンを調節するために使用できます。

結論

要約すると、HEK293TEVの取り込み動態を定量化するための定量的で高スループットのプラットフォームをさらに開発しました。このプラットフォームは、他のドナーEVおよびレシピエント細胞タイプ、およびリポソームおよび合成ナノ粒子送達ベクターのアッセイに拡張できます。重要なことに、HEK293T EVの取り込みは選択的なプロセスであり、HEK293T細胞に特異的であることがわかりました。ここで開発されたIFCアッセイは、in vivoの用量漸増および生体内分布研究で使用されるパラメーターをより適切に定義し、invivoでのEV取り込み結果の予測モデルの機器情報を提供するために使用できます。

データと資料の可用性

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

略語

EV：

細胞外小胞

HEK293T：

ヒト胎児腎臓細胞株

IFC：

イメージングフローサイトメトリー

hNSC：

ヒト神経幹細胞

GFP：

緑色蛍光タンパク質

BF：

明視野

SSC：

側面散乱

ISEV：

細胞外小胞の国際学会