黑リンナノ粒子は、TG2発現のアップレギュレーションを通じてEMSCの骨形成分化を促進します

はじめに

臨床現場では、骨再生の欠如は、一般的な骨折でも予後不良をもたらす可能性があり、骨再生材料の緊急の必要性が存在します[1]。その後、自家移植片、同種移植片、人工骨足場などの多くの治療戦略が再生材料として使用されてきました。近年、生体材料は骨の再生に寄与することが成功裏に実証されており、これは多様な生体材料の用途における目覚ましい進歩を示しています[2]。しかしながら、優れた骨伝導、骨誘導、および骨統合を備えた人工骨代替物の開発が依然として緊急に必要とされている。生体活性ポリマー[3,4,5]とセラミック[6]は骨工学用の足場になり、イオンを放出することによって骨形成を促進する足場[7]が特に懸念されています。特に、標的細胞または組織に特異的に作用する無機リン酸塩は、鉱化作用に関連する生物学的プロセスを研究し、生物に触発された鉱化作用に基づく医療工学を進歩させるための有望な道を提供することができます[8]。

2014年、Liらは、黒リン（BP）ナノシートをバルクBPから剥離できることを報告し、ナノ電子デバイスへの応用のための新しい2次元（2D）材料としてのBPナノシートの可能性を実証しました[9]。層内の明確なプリーツ構造、調整可能な直接バンドギャップ、高いキャリア移動度、および多くの興味深い層内異方性など、BPの優れた特性により、BPは現在潜在的な生物医学的用途について調査中です[10]。これらの利点により、骨の再生を刺激するBPナノマテリアルベースの足場が過去2年間に広く研究されてきました。以前の研究では、リンベースの生体材料は、リン酸イオンの局所濃度を高めることにより、石灰化と骨の再生を促進できることが示されています[11]。 BPは骨の再生を促進する理想的な候補と見なすことができますが、一般にポリマーにカプセル化されるか、骨組織エンジニアに適用するために浸漬によって生体材料の足場に導入されます。これまで、BPによる骨再生を調節する分子メカニズムはほとんど知られていないため、クリニックでの骨修復のためのBPベースの治療法のさらなる開発を妨げています。

間葉系幹細胞（MSC）は、自己複製および多系統分化を行う能力を備えた多能性間質細胞です[12]。骨折後、MSCはinvivoでの骨修復プロセスにおいて重要な役割を果たします[13、14、15]。骨髄幹細胞（BMSC）とそれらの骨形成分化の可能性は、長年にわたって乱暴に研究されてきました。ただし、BMSCの収集プロセスは、感染のリスクがあり、プロバイダーにとって苦痛になる可能性があります。胚発生時の頭蓋神経堤に由来する外胚葉系間葉系幹細胞（EMSC）は、成人の鼻腔の呼吸粘膜から簡単に採取できます。さらに、EMSCは自己再生可能であり、多方向の分化の可能性があります。これは、以前の研究で徹底的に特徴付けられています[16、17]。我々は、EMSCが脂肪細胞、神経細胞、軟骨細胞、骨細胞を含むいくつかの細胞系統に分化できることを証明しました[18、19]。これらの特別な特性により、EMSCは、BPを含む化学信号によってEMSCの骨形成分化を調節する潜在的な分子メカニズムを探索するための有望なツールとして機能します。しかし、骨形成分化は、異なる細胞の増殖と分化の緊密な調整、細胞外マトリックス（ECM）の合成と石灰化を含む複雑なプロセスです[20]。以前の研究では、トランスグルタミナーゼ2（TG2）は、骨芽細胞の増殖、分化、細胞外マトリックスの生成、および石灰化に影響を与えることにより、骨芽細胞の骨形成を刺激できることが報告されています[21、22、23]。

上で引用した報告は、BPがEMSCの優れた骨形成分化誘導物質となり得る生物医学的応用の途方もない可能性を持っていることを示しています。これまで、EMSCの差別化に対するBPの影響に関する研究は報告されていません。本研究の主な目的は、EMSC関連のinvitro骨形成分化および増殖に対するBPの影響を調査することでした。その調査の後、EMSCの増殖と骨形成分化におけるBPの潜在的な分子メカニズムも注意深く調べられました。全体として、私たちのデータは、BPが組織工学による足場に潜在的に有用な化学薬品である可能性があることを示しています。

材料と方法

黒リンナノ粒子

バルクBPは、Nanjing XFNANO Materials Tech Co.、Ltd。から購入しました。ジメチルスルホキシド（DMSO）、水酸化ナトリウム（NaOH）、および N -メチル-2ピロリドン（NMP）は、Aladdin Industrial Co.、Ltdから提供されました。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）は、Beijing Solarbio Science＆Technology Co.、Ltdから入手しました。 Hyclone; GE Healthcare Life Sciences）、ストレプトマイシン、ペニシリン、ウシ胎児血清（FBS）は、BI Science and Technology Co.、Ltd。から入手しました。

BP合成は、以前のレポートと同様でしたが、わずかな変更が加えられています[24]。まず、20mgのバルクBPを飽和NaOH / NMP溶液に浸し、粉砕機械的方法で精製しました。次に、混合物を1500 rpmで10分間遠心分離した後、沈殿物を廃棄しました。その後、混合物を氷/水浴で6時間超音波処理し、100μmのBD Falconフィルター（Becton Dickinson、カリフォルニア州サニーベール）でろ過しました。最後に、懸濁液のさらなる遠心分離（13,000 rpm、4°Cで10分）を実行し、沈殿物を収集しました。

鼻粘膜のEMSCの蛍光抗体染色

インビボでEMSCを示すために、鼻中隔の呼吸粘膜を解剖し、次に免疫蛍光染色のために4％PFAで一晩固定した。組織をPBSで洗浄した後、グラジエントスクロース溶液で脱水しました。組織は凍結切片用にOCT（Sakura Finetek、日本）に埋め込まれ、ライカクライオミクロトームを使用して厚さ25mmの冠状連続切片に切断されました。これらの切片をPBSで10分間洗浄し、PBS中の1％ウシ血清アルブミンと0.1％Triton-X100で透過処理しました。鼻粘膜のEMSCは、抗ネスチンの一次抗体とCy3結合二次抗体で免疫蛍光染色されました。パラレルネガティブコントロールは、一次抗体なしで同じ手順にかけられました。染色された組織は、免疫蛍光顕微鏡（AxioObserver、ZEISS、ドイツ）で観察されました。

細胞培養

すべての動物実験は江南大学動物管理倫理委員会によって承認され、この研究では動物研究のための国際ガイドラインに厳密に従った。初代外間葉系幹細胞は、以前の研究[17、25]に従ってラット呼吸粘膜から分離されました。簡単に説明すると、100gの成体SpragueDawley（SD）ラットに、ペントバルビタールナトリウム（0.05 g / kg）の腹腔内注射で麻酔をかけました。鼻中隔の中央3分の1を細かく切り刻み、0.25％トリプシン溶液（Hyclone; GE Healthcare Life Sciences）で37°Cで25分間インキュベートした後、鼻中隔の粘膜を注意深く剥がしました。最後に、鼻中隔粘膜組織を細かく切った。得られた組織の懸濁液を100umナイロンメッシュふるいに通し、1000 gで5分間遠心分離した後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄しました。組織懸濁液を増殖培地（DMEM / 12には10％FBS、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlストレプトマイシンを含む）の細胞培養フラスコに入れ、37°C​​、5％CO _{2 <で培養しました。 / sub> 飽和湿度の95％空気。培地は3日ごとに交換され、細胞は毎週継代されました。 3継代の細胞は、すべての特性評価研究に使用されました。ビメンチンやネスチンなどの幹細胞マーカーに対する抗体で培養細胞を特徴づけるために、免疫蛍光抗体法が実施されました[26]。}

EMSCの多方向差別化能力の識別

EMSCを6ウェルプレートに播種し、DEME / F12培地で24時間70％コンフルエンスまで培養しました。次に、培地を骨形成分化培地（10％FBS、0.1 mMデキサメタゾン、10mMβ-グリセロホスフェート二ナトリウム、および0.2 mM l-アスコルビン酸を添加したDMEM）に交換して、骨形成を誘導しました。培地を7日ごとに交換し、28日目に0.5％Alizarin Red S（Sigma-Aldrich）でアリザリンレッドS染色を行いました。90％コンフルエンスに成長したEMSCを脂肪生成分化培地で培養し、21日間脂肪生成を誘導しました。オイルレッド染色は、メーカーの指示に従ってオイルレッド染色キット（Solarbio）を使用して実施しました。

BPの特性評価

走査型電子顕微鏡（SEM）は、BPの形態とサイズを特徴づけるために使用されました。サンプルは、脱イオン水中のBP溶液を1 mg / mlの濃度で、formvarでコーティングされた銅グリッド上に滴下し、風乾することによって調製しました。サンプルは、走査型電子顕微鏡（H-7500;日立、東京、日本）によって撮影されました。 BPの平均サイズは、image Pro Plusソフトウェア（Media Cyber​​netics Inc.、MD、USA）を使用して分析されました。ゼータ電位の評価は、Malvernゼータサイザー（ZEN3600）によって確認されました。 X線回折（XRD）は、Bruker D8 Discover回折計を使用して、Bragg–BrentanoパラフォーカスジオメトリとCuKα放射線で実行されました。回折パターンは、2 θの10°から80°の間で収集されました。 0.01°2 θのステップで ステップあたり0.2秒の取得時間。得られたデータは、HighScore Plus3.0eソフトウェアを使用して評価されました。 514 nmのレーザー励起を備えたラマン分光計（LabRam HR800）を使用して、サンプルのラマンスペクトルを測定しました。サンプルの表面組成は、X線光電子分光法（[XPS] Omicron NanoTechnology GmbH、ドイツ）によって測定されました。

Cell Counting Kit‑8（CCK‑8）アッセイ

細胞増殖に対するBPの効果は、細胞計数キット（CCK-8）アッセイを使用して評価されました。簡単に説明すると、EMSC（3000細胞/ウェル）を96ウェルプレートにプレーティングし、BP（0、1、2、4、8、16、32、64、128、および512μg/ ml）で24時間37時間処理しました。 °C。 CCK8を検出するために、分析の4時間前に10μlのCCK8試薬を培地に添加しました。 450 nmでの光学密度（OD）は、マイクロプレートリーダー（Thermo Fisher Scientific、マドリッド、スペイン）を使用して、製造元の指示に従って測定しました。さらなる調査に使用されるBPの濃度は、CCK-8アッセイの結果に基づいて選択されました。 Ki-67染色に関しては、EMSC（1×10 ⁴ ）を24ウェルプレートで培養し、Ki-67（ウサギポリクローナル;カタログ番号ab15580; abcam; 1：300）の蛍光抗体法で染色しました。 DAPIを使用して核を染色しました。画像は蛍光顕微鏡（倍率、200倍、Eclipse Ti、nikon Corporation）でキャプチャされ、Image ProPlusソフトウェアで分析されました。

骨形成分化

骨形成分化のために、EMSCを3,000細胞/ cmの密度で播種しました ² 増殖培地で70％コンフルエンスまで培養しました。次に、細胞を骨形成分化培地で2週間誘導した。特に、β-グリセロリン酸ナトリウムの影響を回避するために、骨形成分化培地には、10％FBS、0.1 mMデキサメタゾン、および0.2 mM l-アスコルビン酸（Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国））が追加されました。 β-グリセロリン酸ナトリウムではありません。分化を誘導した後、アルカリホスファターゼ（ALP）とアリザリンレッド染色およびRT-qPCRを使用して、EMSCの骨形成分化に対するBPの影響を評価しました。EMSCは2×10 <の密度で播種されました。 sup> 5 6ウェルプレートに細胞/ウェルを入れ、骨形成培地とインキュベートします。製造元の指示に従って、ALP染色は14日目にALP染色キット（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute）を使用して評価しました。リン酸カルシウムの沈着を視覚化するためにアリザリンレッドS染色を適用しました。簡単に説明すると、固定した細胞を脱イオン水で再度洗浄し、1 ml /ウェルのアリザリンレッド染色液（0.5％（w / v）アリザリンレッドS（Sigma-Aldrich）を含むPBS）と37°Cで10分間インキュベートしました。溶液を除去し、サンプルを脱イオン水で再度洗浄しました。フィールドごとの石灰化した小結節を示す陽性染色領域をImage-Pro plusソフトウェアでカウントし、それぞれのコントロールに対して正規化しました。

RT-qPCR

RT-qPCRは前述のように実行されました。簡単に説明すると、RNA精製キット（TaKaRa、日本）を製造元の指示に従って使用して、単培養またはソーティングからトータルRNAを単離しました。 2マイクログラムのmRNAは、cDNA合成キット（Fermentas）を使用してcDNAに逆転写されました。 RT-PCRに使用されるプライマーは、表1に示すように、南京GenScript Bioengineering Technology and Services Co.、Ltd（南京、中国）によって設計および構築されました。RT-PCRは、SYBR Green / Fluorescein qPCRマスターミックスキット（Fermentas）を使用して操作しました。 ABI Prism7500システムを使用します。データは、相対的な発現レベルを示すためにグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に正規化されました。すべての測定は3回行った。

ウエスタンブロット

培養細胞をPBSで2回洗浄した後、ホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含むRIPA溶解バッファーで氷上で30分間溶解しました。総TG2を収集するために、6ウェルプレートの細胞溶解物とECMをセルスクレーパーで収集しました。プレートをPBSで洗浄し、細胞洗浄液も収集した。 12,000× g で遠心分離することにより、上清からライセートを回収しました。 5分間、等量のSDSローディングバッファーと混合し、5分間煮沸します。タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイキット（Beyotime、上海、中国、P0012）を使用して決定しました。タンパク質をRIPA溶解緩衝液で抽出し、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲルで分離し、電気泳動でニトロセルロースメンブレン（Millipore、LA、USA）に転写しました。メンブレンは、0.5％Tween 20（Suolaibao、北京、中国）を含む0.01 Mトリス緩衝生理食塩水（TBS）中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックされ、抗TG2（1：200; sc-48387、Santa Cruz Biotechnology、Inc。）、抗FN（1：500;カタログ番号BA1772; Wuhan Boster Biological Technology、Ltd。）および抗LN（1：500;カタログ番号BM4921; Wuhan Boster Biological Technology、Ltd。）、anti-OCN（1：200; sc-390877、Santa Cruz Biotechnology、Inc。）、anti-OPN（1：200; sc-73631、Santa Cruz Biotechnology、Inc。）、anti- COL I（1：500;カタログ番号BA0325; Wuhan Boster Biological Technology、Ltd。）、4°Cで12時間。次に、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG（1：5000; Boster、Wuhan、China）と室温で2時間反応させました。タンパク質バンドは、Pierce ECL Plus基質（Thermo Fisher Scientific）を使用して視覚化し、化学発光イメージングシステム（Clinx Science Instruments、上海、中国）でスキャンしました。

抑制実験

TG2の関与を確認するために、EMSCでTG2阻害実験を実施しました。中和実験は、抗ＴＧ２中和抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴから）を用いて実施された。細胞を通常の培地を含む6ウェルプレートに24時間播種して接着させ、抗TG2抗体（10μg/ ml）で処理しました。同時に、対照群が設定されました。 6ウェルプレートに24時間播種した後、BP（2μg/ ml）を含む骨形成培地を使用してEMSC骨形成を14日間誘導し、阻害剤を含む培地を7日ごとに新鮮な骨形成培地に交換しました。リン酸カルシウムの沈着を視覚化するために、アリザリンレッドS染色を適用した。ウエスタンブロッティングを使用して、オステオカルシン、オステオポンチン、および1型コラーゲンのレベルを評価しました（それぞれ、OCN、OPN、およびCOL Iの発現）。

蛍光抗体法による染色

培養細胞を4％パラホルムアルデヒドで4°Cで8時間固定しました。固定した細胞をPBSで3回洗浄し、0.2％Triton X-100と1％BSA（Suolaibao、北京、中国）を含むPBSで30分間透過処理しました。透過処理後、これらの固定細胞をPBSで洗浄し、一次抗体と4°Cで8時間インキュベートした後、すべての一次抗体を除去しました。次に、細胞をPBSで3回洗浄し、二次抗体Alexa Fluor-594（1：800、Life Technologies Molecular Probes、Carlsbad、CA、USA）と室温で2時間、37°C​​で2時間インキュベートしました。核を4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（[DAPI]; Sigma-Aldrich）で対比染色した。テストしたグループはすべて、免疫蛍光顕微鏡で観察されました。

統計分析

データは、上記の3つの別々の実験から得られ、平均±標準偏差（SD）として表されました。データ分布の分析は、学生の t を使用して実行されました -治療群と対照群の違いの重要性を分析するためのテスト。一元配置分散分析（ANOVA）とそれに続くテューキー事後検定を実行して、グループ間の有意差を評価しました。 p <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果

BPの特性評価

動的光散乱（DLS）によって測定されたBPサイズ分布は、100〜200 nmの範囲で比較的狭く、ピーク値は132nmでした。結果を図1Aに示します。 BPのゼータ電位は−23.7±0.65mVと決定され（図1B）、BPの安定性が確認されました。粒子のサイズは、走査型電子顕微鏡（SEM）によってさらに調査されました（図1C）。結果は、DLSによる粒度分布の測定とよく一致しています。

BPの特性。 A 黒リンナノ粒子（BP）のサイズ分布。 B ゼータ電位が−23.7±0.65mVのBPのゼータ電位レポート。 C BPナノシート（BPN）の走査型電子顕微鏡（SEM）画像。 D BPのラマンスペクトル; E X線回折図と F BPのP2p高分解能X線光電子分光法（XPS）スペクトル。 G BPのXPSスペクトル

ラマン散乱（図1D）により、362.3、438.5、および466.9 cm ^-1 に3つの顕著なピークが明らかになりました。 面外フォノンモードに関連付けられています（ A ¹ _g ）および2つの面内モード（ B ² _g および A ² _g ）BPの[17、18]、それぞれ。 XRD（図1E）は、準備された材料の相純度を示しており、平均結晶サイズは102.7nmです。回折パターンの広がりは、個々の微結晶のナノメートルサイズを示しています。 P 2 pの高分解能XPSスペクトル（図1F）は、表面酸化によって引き起こされたP–O結合に由来する135 eVの追加のピークに加えて、黒リンのP–P結合に対応する130eVのメインピークを示しています。 BPの。 BP表面をワイドスキャンX線で検査しました（図1G）。

EMSCの特性評価

鼻粘膜の蛍光抗体染色は、ネスチン陽性EMSCが鼻中隔の呼吸上皮の下の固有層に位置していることを示しました（図2A）。 3継代で培養されたEMSCは線維芽細胞様細胞として現れ、プラスチックプレート上で急速に増殖しました（図2B）。 28日目にアリザリンレッド染色により骨形成培地の骨形成分化を評価しました（図2C）。脂肪生成誘導培地での脂肪生成分化は、21日目にオイルレッドO溶液で染色することにより評価されました（図2D）。免疫蛍光染色では、図2Eに示すようにネスチン（> 95％）や図2Fに示すようにビメンチン（> 95％）など、ほとんどすべてのEMSCが神経堤細胞マーカーを発現していることが示されました。幹細胞マーカーの共発現の結果は、これらのEMSCが間葉系幹細胞の一種であることを示しています。

外胚葉性間葉系幹細胞（EMSC）の同定。 A ネスチン陽性EMSC（cy3、赤）は、鼻中隔の呼吸上皮の下の固有層に位置していた。 B 位相差画像は、3継代で培養されたEMSCが線維芽細胞様細胞として現れ、プラスチックプレート上で急速に増殖したことを示しました。 C 骨形成培地中の骨形成分化EMSCはアリザリンレッドで染色された。 D 脂肪生成誘導培地中の脂肪生成分化EMSCはオイルレッドOで染色されました。 E 、 F 神経堤細胞マーカーの免疫蛍光染色は、ほとんどすべてのEMSCがネスチンとビメンチンを発現していることを示した。 IgG-Cy3（赤）を免疫蛍光染色の二次抗体として使用し、核をHoechst 33342（青）で対比染色しました

細胞毒性

予備実験として、BPの細胞毒性を評価するためにCCK-8アッセイを実施しました。 BPへの24時間の曝露後のEMSCの生存率を図3に示します。最大32μg/ mlのBPへの曝露後の有意な細胞毒性は認められませんでした。ただし、BPへの曝露は、高用量（>32μg/ ml）で有意な細胞毒性を引き起こします。核小体と染色体でのKi-67の発現は、低用量群で観察されました（図4A–C）。ただし、Ki-67陽性核と核の総集団の比率では、未処理のコントロールと比較して、低用量のBP処理EMSCに有意差は見られませんでした（図4D）。したがって、本研究では、有意な細胞毒性が観察されなかった以下の実験で、2および4μg/ mlのBPの濃度を選択します。

BPの細胞毒性。細胞をBP（0、2、4、8、16、32、64、128、256、および512 µg / ml）で24時間処理し、EMSCの生存率を細胞計数キット（CCK-8）増殖アッセイでテストしました（ n =9）。データは平均±標準偏差（SD）として表されました。 ** p <0.01。

BPs治療群の細胞増殖の評価。 EMSCはBP（0、2、および4μg/ ml）で24時間処理されました。細胞増殖は、抗Ki67抗体（赤）とDAPI（青）を用いた免疫蛍光染色によって測定され、マージされた画像が表示されました（ A – C ）。 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）陽性細胞のうちKi67陽性細胞を、3枚のプレートのそれぞれの2つの高倍率視野でカウントしました。データは平均±SD（ D ）として表されます 。

アリザリンレッドS染色

図5Aに示すように、細胞内の無機化は、馴化培地で14日間処理した後、アリザリンレッドS染色によって評価されました。カルシウム結節はすべて3つのグループで観察されたが、形状のないカルシウム結節は対照グループに存在した。対照群と比較して、2および4μg/ ml群に沈着したカルシウム結節は大きかった（ p <0.05）、しかし、治療群間で明らかな違いは観察されませんでした（ p > 0.05）図5Cに示すように。

アルカリホスファターゼ（ALP）およびアリザリンレッド染色アッセイ。 A 14日目にアリザリンレッド溶液で染色された骨形成分化EMSC。 B ALP染色は顕微鏡下で視覚化されました。 C チャートは、アリザリンレッド沈着領域の定量化を示しています。 D BP治療群では対照群よりも有意に高いALP活性が示された。データは平均±SDとして表されました。 ** p <0.01

ALPテスト

EMSCの骨形成分化を研究するためにALP染色を行った。対照群と比較して、2および4μg/ mlBP群のEMSCは色が濃く（図5B）、BPの添加がEMSCのALP発現の増強を引き起こしたことを示唆しています。 BPで処理された細胞は、7日目に対照群よりも高いALP活性を示しました（ p > 0.05）、ただし2と4μg/ mlの間に有意差は観察されませんでした（ p > 0.05）図5Dに示すように。

RT-qPCR

図6に示すように、ラント関連転写因子2（RUNX 2）、ALP、COL 1、OCN、OPN、および骨形成タンパク質2（BMP-2）を含む主な分化マーカーを14日目に分析しました。これらすべての遺伝子マーカーのうち、7日目に3つのグループの細胞で検出されました。2〜4μg / mlのグループ間で遺伝子発現に明らかな違いは見られませんでした。しかし、対照細胞と比較して、BP処理細胞における上記の遺伝子の発現は有意に増加しました。

BPはEMSCの骨形成を強化します。 EMSCは、0μg/ ml、2μg/ ml、4μg/ mlのBPを含む骨形成培地で14日間培養しました。 EMSCの骨形成に関与する遺伝子の発現は、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）によって定量化されました。 ** p <0.01、* p <0.05。

BPは、TG2発現をアップレギュレートすることによりEMSCの骨化を促進します

インテグリンを介した分化とECM沈着に対するTG2の有意な影響が広範囲の細胞で実証されたため、BPがTG2発現のアップレギュレーションを介してEMSCの骨形成分化を促進するかどうかを調査しました。図7に示すように、BP治療群では細胞内および細胞外TG2の明らかなアップレギュレーションが検出されました。 2および4μg/ mlのBP処理細胞のラミニン（LN）およびフィブロネクチン（FN）は、対照群よりも高レベルでした（図7A）。 BPに曝露されたEMSCは、対照群と比較してTG2レベルの約2倍の増加を示しましたが、BP治療群間で有意差は観察されませんでした（図7B）。高分子タンパク質として、抗TG2抗体は細胞膜を通過できませんでした。したがって、細胞外TG2は抗体によってブロックされ、さ​​まざまな成長因子とECMタンパク質を架橋できませんでした。 Alizarin Red S（図8A、C）の結果は、抗TG2がBPを介したカルシウムおよびECM沈着の増加を著しく抑制したことを示しています。一方、図8Dに示すように、抗TG2はBP処理細胞のALP活性の増加を有意に抑制しました。さらに、抗TG2は、OCN、OPN、COL Iなどの骨基質タンパク質の発現に対するBPの影響を効果的に無効にしました（図9）。

Transglutaminase 2 (TG2) was involved in the osteogenic differentiation of EMSCs. EMSCs were incubated with BPs (2 and 4 μg/ml) for 14 days, and fibronectin (FN), LN, and TG2 levels were assessed by immunoblotting. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05.

Osteogenic differentiation of EMSCs with TG2 neutralizing antibody. A ALP staining. B ARS staining performed to examine extracellular mineralization. C Quantitative ALP analysis. D Quantitative Alizarin red staining analysis. **p  < 0.01

Anti-TG2 inhibited BP-induced EMSC osteogenic differentiation. A Representative western blots of osteoponin, osteocalcin, and collagen 1 (OPN, OCN, LN, FN, and COL I, respectively) in differentiated EMSCs following treatment with 2 μg/ml BPs and 2 μg/ml anti-TG2 or 2 μg/ml BPs alone. B Quantification of OPN, OCN, and COL I protein expression. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05

Discussion

To the best of our knowledge, modification of phosphorus was first exhaustively studied as early as 1914; unfortunately, these studies did not receive much attention for an entire century [27]. Phosphorus is one of the essential elements making up about 1% of the total body weight as a bone component in the human body [28], while most of the other materials cannot warrant such a natural biocompatibility. In 2014, BP was introduced as a new member of the 2D layered materials.

In this study, the BP nanoparticles were prepared on a large scale from bulk BP crystals by using an improved mechanical grinding and continuous ultrasound method. Compared with other methods, this ultrasound and mechanical grinding synthesis is facile and efficient and enables production of BPs on a large scale. For characterization of BPs, SEM was carried out to examine the morphology of BPs. SEM images illustrated that BPs were successfully synthesized, and the typical sizes of BPs are about 100 to 150 nm. The size of particles was further investigated using DLS in the relatively narrow range around 133 nm. The result of SEM corresponded well with the measurement of particle size measurements based on DLS. Interestingly, previous studies demonstrated that BP with larger lateral size has higher cytotoxicity than small BP, while ultra-small BPs were even considered nontoxic up to the high concentration of 1000 μg/ml [29, 30]. Thus, for biomedical applications, the BP nanomaterials still need further study. In addition, Raman scattering revealed the presence of three prominent peaks at 361.5, 437.1, and 465.2 cm ⁻¹ that were associated with the out-of-plane phonon mode (A ¹ _g ) and two in-plane modes (B ² _g and A ² _g ) of BPs. These results were consistent with previous reports [31] in which showed that the BPs had been prepared successfully from bulk BP. XRD shows the phase purity of the prepared BPs. Broadening of the diffraction pattern indicates the nanometer size of individual crystallites.

To evaluate the stability and degradation rate of BPs, Wang and co-workers performed an experiment in which normalized absorption spectra of the BP nanosheets were dispersed in water and exposed to air. After 6 days, they found that the absorbance of the BP nanosheets at 450 nm decreased by 43% compared to the initial value, indicating that BP is easily degraded in the physiological environment [32]. Also, it is well-known that BP is sensitive to water and oxygen, but this shortcoming is considered a merit for biomedical applications. Because of these special characteristics compared with other biomaterials, BPs could potentially avoid material accumulation in human body and then reduce cytotoxicity caused by such material noumenon.

Since MSCs play key roles in bone formation, there is no doubt that transplanting MSCs in animal models of bone defects enhance bone regeneration and promotes functional recovery via BMSC acquisition [33]. Unfortunately, BMSC acquisition procedures are painful for the donor and frequently cause surgical site infection, and the number of harvested BMSCs is low [34]. Previous studies from our laboratory and other reports have shown that EMSCs could be isolated from several adult tissues, such as dental pulp and the nasal mucosa, without causing invasive injury. Moreover, EMSCs were easily induced into osteoblasts, rendering those cells as promising seed cells for bone tissue engineering. Therefore, EMSCs were used in this study. We attempted to obtain the maximum safety BP concentration for EMSCs. As shown in the results, we achieved the maximum safe concentration of BPs (less than 64 μg/ml). The concentrations of 2 and 4 μg/ml of BPs were chosen for further study to avoid any possible potential toxic. The Ki-67 assay was also used to quantify and evaluate EMSC proliferation in these samples after treating these cells with BPs (2 and 4 μg/ml) for 24 h. We did not observe any statistically significant suppression of EMSCs growth in the case of BPs. Meanwhile, our results indicate that during treatment with safe concentrations of BPs, promotion of EMSCs proliferation also occurred.

Some reports have shown that the concurrent binding of BP and calcium ions may benefit osteogenic differentiation, thereby leading to enhanced bone regeneration [35, 36]. To investigate these effects, in vitro EMSCs exposed to BPs were used in osteogenic differentiation experiments. Interestingly, the results of the ALP test and Alizarin Red S staining show that exposure to BPs could promote rather than compromise osteogenetic differentiation of EMSCs compared to the control group. Similar findings have been reported in which phosphorus-rich materials can stimulate mineralization and bone regeneration. Co-expression of osteogenesis-related genes, including ALP, OPN, OCN, COL1, and RUNX2, in differentiated EMSCs was detected at days 7 and 14 by RT-qPCR. Indeed, the expression levels of these osteogenic genes significantly increased in differentiated EMSCs treated with BPs, also providing confirmation of the osteogenic potential of the BPs. Similar results were reported in which BP could induce both the proliferation and osteogenic differentiation of human pre-osteoblast cells. Together these results indicate that the BPs were able to induce osteogenic differentiation of EMSCs.

It can be asked, “How do BPs promote osteogenetic differentiation of EMSCs?” It is well accepted that phosphorus can capture Ca ²⁺ in vivo to form calcium phosphate deposits that accelerate bone regeneration, while BP can be the resource of phosphorus ions [36]. Tong et al. believes that BP generate mild heat (40–42 °C), which causes up-regulation of heat shock protein (HSPs) expression and stimulates bone regeneration [37, 38]. Moreover, in this study, the upregulated activation of TG2 levels was also observed in BPs treatment groups. To the best of our knowledge, TG2 has important enzymatic and non-enzymatic functions at these locations in which it crosslinks various ECM proteins and modulates the interactions of cells with the ECM and soluble growth factors by non-covalent interactions with and regulation of integrins [39,40,41]. Obviously, the BPs can react strongly with oxygen and water and finally degrade to non-toxic phosphate in aqueous solutions, which is a crucial component of ATP. Nakano Y et al. reported that ATP can act as a significant phosphate (Pi) source for mineralization in MC3T3-E1 osteoblast cultures, indicating that ATP-hydrolyzing enzymes could induce mineral deposition [42]. They also found that TG2 could not only act as a phosphatase but could be involved in ATP hydrolysis in the osteoblast cultures thus further contributing to the elevation in Pi levels required for mineral deposition, which may be beneficial to EMSC energy metabolism. This process may be part of the contribution that BPs makes toward enhancement of EMSC osteogenic differentiation. On the other hand, thanks to TG2 bio-functions, a wide variety of ECM adhesion proteins, including LN, COL I, and FN, could maintain a stable state. Indeed, in the present study, we observed that ECM (FN, COL I, and LN) were significant higher in BP-treated EMSC groups. BPs provide a favorable ECM microenvironment for promoting greater osteogenic EMSC differentiation and proliferation.

Until now, no secretory signal sequences and hydrophobic or transmembrane domains have been clearly identified in TG2 because the protein is not localized in the endoplasmic reticulum (ER)/Golgi compartments [39, 43], and only few studies reported about these factors that control TG2’s secretion. Therefore, it remains unclear as to the exact mechanism of BP regulation of expression patterns of TG2 in the progress of EMSC osteogenic differentiation.

Conclusion

In the present study, BPs were successfully fabricated using mechanical grinding and continuous ultrasound method. At bio-safe concentrations, BPs activated TG2, and promoted the expression of ECM, which further promoted osteogenic differentiation of EMSCs. From these results, we can conclude that BPs would be suitable for incorporation into tissue-engineered scaffolds that utilize EMSCs to repair bone defects. Although our research highlights the great potential of BPs in nano-biomedicine, large-scale preclinical and clinical studies concerning its safety are needed before any clinical applications are established.

データと資料の可用性

The datasets generated during and/or analyzed during the study are available from the corresponding author on reasonable request.

略語

BPs:

Black phosphorus nanoparticles

EMSCs:

Ectodermal mesenchymal stem cells

TG2:

Transglutaminase 2

2D:

Two-dimensional

ECM:

Extracellular matrix

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

NMP:

N -Methyl-2pyrrolidone

PBS:

Phosphate-buffered saline

DMEM/F12:

Dulbecco's modified Eagle's medium/nutrient mixture F12

FBS:

Fetal bovine serum

SD:

Sprague Dawley

SEM:

Scanning electron microscopy

XPS:

X-ray photoelectron spectroscopy

CCK-8:

Cell counting kit

OD:

Optical density

RT-qPCR:

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

GAPDH:

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

BSA:

Bovine serum albumin

TBS:

Tris-buffered saline

DAPI:

4′6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Dynamic light scattering