骨髄幹細胞由来エクソソームmiR-133aがMAML1抑制によりウイルス性心筋炎の線維化とEMTを軽減

要旨

心筋炎は、効率的な治療法のない心筋の局所的またはびまん性炎症を特徴とする疾患です。本研究では、骨髄間葉系幹細胞由来エクソソーム（BMSC-Exo）から分泌されるmicroRNA-133（miR-133）が、mastermind-like 1（MAML1）を制御することで、ウイルス性心筋炎（VMC）ラットの心筋線維化と上皮間葉転換（EMT）に及ぼす制御機構を探索しました。ラットBMSCを分離・培養し、免疫表現型と骨形成・脂肪形成能を同定。BMSC-Exoを抽出・同定。エクソソームは超遠心分離で得られ、透過型電子顕微鏡とウェスタンブロットで同定。ラットにコクサッキーB3ウイルスを注射してVMCモデルを作製し、心筋細胞を分離・培養、動物実験と同様に群分け（NCExo、Ad-miR-133aExo、Adas-miR-133aExo）。インビボとインビトロ実験で、エクソソームmiR-133aとMAML1の炎症、アポトーシス、EMT、線維化、細胞生存率における役割を解明。miR-133aとMAML1の標的関係をデュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイで検証。BMSC-ExoはVMCラットでmiR-133a発現を上昇させ、心機能と心筋線維化を効果的に改善、心筋細胞生存率を向上させEMTプロセスを抑制。エクソソーム内miR-133a上昇で改善が強化。miR-133a沈黙はBMSC-ExoのVMCラットへの効果を効果的に逆転。miR-133aはMAML1を標的とする。MAML1阻害はVMCラットの心機能と心筋線維化を改善し、miR-133a沈黙エクソソームのVMCラットへの効果を逆転可能。本研究は、エクソソームmiR-133a上昇がMAML1をダウンレギュレートすることでVMCラットの心筋線維化とEMTを抑制し、心筋炎進行を阻害することを示唆します。

はじめに

心筋炎は心筋細胞の炎症性疾患と見なされています。男性に女性より明らかに多く発症。ウイルス性心筋炎（VMC）は、拡張型心筋症（DCM）と若年者の突然死の主要因。心筋炎の臨床像は多様で、曖昧な症状を伴う無症状から、ウイルスと免疫細胞による深刻な心筋破壊で心原性ショックと不整脈をきたすまで様々。心筋炎は、ウイルス、細菌、クラミジア、リケッチア、真菌、原虫など多様な感染因子、および非感染性誘因で誘発されます。中でもウイルス感染が最も一般的な原因、特に小児で。コクサッキーB3ウイルス（CVB3）は心筋炎を引き起こす最重要ウイルスで、VMCの発症機序で酸化ストレス応答とアポトーシスを引き起こしますが、VMCの特別な治療法は報告されていません。さらに、VMCの発症機序は十分に文書化されておらず、確実な臨床治療も欠如。したがって、疾患予後改善のための新規ターゲットが緊急に必要です。

マイクロRNA（miRNA）は、タンパク質コーディング遺伝子発現を制御するエンドゲノス非コーディングRNA。miR-133aは心臓特異的miRNAの一つで、心臓発達と心筋梗塞（MI）などの心血管疾患に関与。また、慢性シャガス病心筋症で異常発現するmiRNAの一つ。さらに、心筋中のmiR-133aレベルは、炎症、左室機能、炎症性心筋症の臨床転帰と関連。miRNAはマウスとヒト肥満細胞由来エクソソームで発見。エクソソームは、ほとんどの細胞種から放出されるナノサイズ小胞で、様々な生物学的流体に存在。エクソソームはその荷物を受容細胞に輸送し、受容細胞の生化学的組成とシグナル伝達経路を変化させることが示されています。変化したエクソソームmiRNAがCVB3誘発心筋炎の発症機序に関連する証拠あり。低酸素条件下骨髄間葉系幹細胞由来エクソソームmiR-125b-5pが心筋細胞アポトーシス減少と虚血性心臓修復促進に寄与との報告。また、MSC由来エクソソームmiR-25-3pが心筋細胞アポトーシスと炎症応答減少でMIを軽減との報告。興味深いことに、エクソソーム心臓発現miR-133aが心筋トロポニン心筋トロポニンIと関連との報告。Mastermind-like 1（MAML1）は、本研究でmiR-133aのクロススクリーニング下流遺伝子として特定され、心筋虚血/再灌流（I/R）障害に関与との報告。また、最近の研究でMAML1ノックダウンが肝線維化で抗線維化機能を持つことが言及されています。

先行研究に触発され、BMSC由来エクソソームmiR-133aが心筋炎を媒介するかどうかを検討。したがって、miR-133がBMSC由来エクソソーム（BMSC-Exo）によってシャトルされ、MAML1制御を通じてVMCラットの心筋線維化と上皮間葉転換（EMT）を改善するという仮説のもと、本研究を開始しました。

材料と方法

倫理的承認

本研究は、第4附属病院・浙江大学医学部の機関動物実験委員会の承認を得て実施。動物は人道的に取り扱いました。

BMSCの分離

実験動物は成熟特定病原体フリー（SPF）グレードのスプラグ・ドーリー（SD）系雄ラット（浙江大学医学部実験動物センター、浙江、中国）。ペントバルビタールナトリウム腹腔内注射で安楽死、75%アルコールで滅菌。超清潔台上で大腿骨と脛骨を取り出し、筋肉と結合組織を除去、骨髄腔を低グルコースDulbecco改変Eagle培地（DMEM）で繰り返し洗浄。液体を遠心分離して沈殿を回収、再懸濁し24時間培養（培地は2-3日ごとに交換）。対数増殖期に達したBMSCを0.25%トリプシン（Gibco、カールスバッド、カリフォルニア、米国）で剥離、遠心分離、MSC培養液（Cyagen Biosciences Inc.、広州、中国）で再懸濁。1:2の比率で継代。上記操作を繰り返し、4パッセージ目のBMSCを後続実験に使用。

BMSCの同定

対数増殖期の4パッセージ目BMSC表面抗原をフローサイトメトリーで同定。BMSCを0.25%トリプシン（1mL）含むEDTAで剥離、遠心分離、適切なリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で再懸濁、151gで遠心分離。BMSCを2%新鮮胎児牛血清（FBS）（Gibco）含むPBSで再懸濁し、単一細胞懸濁液を作製。FITC-CD34、PE-CD29、PE-CD44モノクローナル抗体（各5μL、BD Biosciences、フランクリンレイクス、ニュージャージー、米国）を細胞懸濁液（100μL）とインキュベート、151gで遠心分離、1%パラホルムアルデヒド含む500μL PBSで再懸濁、30分固定。同型対照からのモノクローナル抗体でバックグラウンドマーカーを同定。フローサイトメトリー：単一細胞懸濁液を固定、151gで遠心分離。BMSCを1%パラホルムアルデヒド含むPBSで再懸濁、MACS Quartフローサイトメーターで測定、対応ソフトウェアで解析。

BMSCの骨形成と脂肪形成誘導

4パッセージ目BMSCを200cells/mLで6ウェルプレートに播種。骨芽細胞誘導液と脂肪細胞誘導液（Cyagen Biosciences Inc.）を60-70%コンフルエントのBMSCに添加。他の2ウェルは誘導液なしで対照。14日間誘導後、4%パラホルムアルデヒドで固定。分化した骨芽細胞と脂肪細胞をアリザリンレッド染色とオイルレッドO染色（武漢普蘭徳生物技術、武漢、中国）で実施、顕微鏡観察。

エクソソームの分離と同定

4パッセージ目BMSCを48時間培養し、上清を回収。遠心分離（800gと2000g）、0.22μmと100,000MWフィルター膜で濾過、遠心分離（100,000g）で沈殿回収。沈殿をPBSで再懸濁、再度100,000gで遠心分離してエクソソーム沈殿取得。PBS中のBMSC-Exo懸濁液をビシンコニン酸（BCA）法で濃度検出、エクソソームマーカータンパク質（CD63、CD81、CD9）をウェスタンブロットで検出（Proteintech、シカゴ、イリノイ、米国）。

組み換えアデノウイルス感染によるBMSCのmiR-133a遺伝子改変

BMSCを一晩継代。正常対照（同量PBS）、miR-133aネガティブコントロール（NC）、miR-133a過剰発現（Ad-miR-133a）、miR-133a低発現（Adas-miR-133a）（Hanbio Biotechnology Co., Ltd.、上海、中国）を、100多重感染度（MOI）でBMSCにトランスフェクション。BMSCを培養し、対応するエクソソーム（NCExo、NCExo、Ad-miR-133aExo、Adas-miR-133aExo）を超遠心分離で取得。

ラットVMCモデル確立と実験動物群分け

成熟雄SPFグレードSDラットを10群に分け、各群8匹。コクサッキーウイルスB3（CVB3）を中国医学科学院医学生物技術研究所（北京、中国）から提供。CVB3（10mg/kg）を腹腔内注射、PBSまたはBMSC-Exo（100μg）を尾静脈注射。正常対照ラットにはCVB3培養液とPBSを注射。10mg/kg CVB3注射ラットをさらにPBS、MSCExo、NCExo、Adas-miR-133aExo、Ad-miR-133aExo、si-NC、またはsi-MAML1（RIBOBIO、広州、中国）注射群に分割。ラットを7日間連続注射後、眼球血採取。血液を遠心分離し血清回収、分包、-20℃保存。ラット安楽死後、心臓検体採取、10%ホルマリン固定、勾配アルコール脱水、キシレン透明化、パラフィン包埋、切片化して組織学的観察。一部切片を-80℃で分子生物学実験用保存。

エコー心臓図

ウイルス注射7日目、ペントバルビタールナトリウム25mg/kg腹腔内注射。完全麻酔後、心電図機の肢誘導を電極針でラット四肢末端に皮下挿入、肢誘導心電図記録。ラットを左寄りの仰臥位で固定、胸部除毛、II誘導心電図を接続し、胸骨傍四腔心断面での大動脈血流パルスドップラースペクトル取得。指標：左室後壁厚（LVPW）、左室末期収縮期径（LVIDs）、左室短縮率（FS）、左室駆出率（LVEF）。

ヘマトキシリン-エオシン（HE）染色

組織を4%パラホルムアルデヒド固定、脱水、透明化、パラフィン包埋。4μm切片を脱蝋、ヘマトキシリン（Servicebio、武漢、中国）染色、1%塩酸アルコールで分化、返青、エオシン染色、脱水、キシレン透明化、中性ガム封入、光学顕微鏡（オリンパス、東京、日本）で観察。

マッソン膠原染色

パラフィン切片を脱蝋、ヘマトキシリン染色（2分未満）、リチュンマゼンタ溶液染色、0.5%酢酸溶液で急速洗浄。1%リン酸アルミニウム水溶液染色、暗赤→明赤→ピンクに染色変化、顕微鏡観察。アニリンブルー（普蘭徳）染色、キシレンで慣例脱水封入。医用画像解析ソフトImage-Pro Plus 6.0で膠原線維陽性染色面積測定、膠原体積分率（CVF）=膠原面積/総視野面積。膠原線維の染色部位と色を区別（心筋細胞は赤、膠原線維は細胞間隙の青帯状または均質構造）。

TUNEL染色

パラフィン切片を脱蝋、クエン酸緩衝液に入れ350Wで10分加熱。50μL TUNEL溶液添加、50μL変換剤-ペルオキシダーゼ添加、DABで発色、顕微鏡観察。ヘマトキシリン対染、95%エタノールI-II、無水エタノールI-II、キシレンI-II、封入。光学顕微鏡で解析。

酵素免疫測定法（ELISA）

腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン（IL）-1β、IL-6をELISAキット（BOSTER生物技術、武漢、中国）で検出。眼球血を604gで遠心分離し上清血清回収。細胞実験では培養上清の遠心分離上清を検出。サンプル希釈標準に7濃度勾配。ブランクウェルにサンプル希釈液、別ウェルにテトラメチルベンジジン（TMB）、各濃度で複製ウェル2つ設定。サンプルウェルにサンプル希釈液50μLとサンプルを順次添加。各ウェルを一次抗体（TMBウェル除く）100μLで1時間反応、さらに0.01Mトリス緩衝生理食塩水（TBS）300μLとアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体作業液100μL（TMBウェル除く）で反応。各ウェルに0.01M TBS 300μL添加、TMB 100μLでインキュベート。光学密度（OD）値と各ウェル濃度を即時測定、標準曲線作成。

逆転写定量PCR（RT-qPCR）

心筋組織と心筋細胞でのmiR-133a、コラーゲンI、コラーゲンIII、α-SMA、TGF-β1、CTGF、E-カドヘリン、FSP-1発現をRT-qPCRで検出。心筋細胞または心筋組織から総RNA抽出、RNA抽出キット（タカラ、大連、中国）でcDNAに逆転写、RT-PCRプライマーをInvitrogen（広州、中国）で合成、配列を表1に示す。グリセラールデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）またはU6を内部対照遺伝子とし、2^(-ΔΔCt)法で相対的定量遺伝子発現解析。

ウェスタンブロット解析

ラットを麻酔下で安楽死。心筋組織を液体窒素で凍結粉砕。プロテアーゼインヒビターPMSFストック溶液を細胞溶解バッファーに1:100で混合（Beyotime Biotechnology、上海、中国）。混合液でサンプル溶解、細胞タンパク質抽出。BCAキットで総タンパク質濃度測定。サンプルを5×ローディングバッファーと4:1で混合、沸騰水浴10分、アイスバス、遠心分離。電気泳動分離、電気転写液でポリフッ化ビニリデン（Servicebio）メンブレーンにタンパク質転写。メンブレーンを5%脱脂粉乳でブロッキング、一次抗体CD63、CD81、CD9（ウサギ抗ラットポリクローナル抗体、Proteintech、1:100）、MAML1（ab65090、Abcam、マサチューセッツ、米国、1:1000）、GAPDH（Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア、米国、1:1000）で反応。二次抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識IgG（Cell Signaling Technology、ベバリー、マサチューセッツ、米国、1:1000）で反応、增強化学発光反応液（Pierce、ロックフォード、イリノイ、米国）に浸漬。GAPDHをローディングコントロールとし、ImageJ2xソフトウェアでタンパク質インプリント画像解析。

心筋細胞培養と継代

生後3-5日のSDラット（浙江大学医学部実験動物センター、浙江、中国）を使用。心室部分を予冷Hank's平衡塩液で洗浄、小片に切断、0.25%トリプシンで剥離。片に適量10%完全培地添加で剥離終了、151gで遠心分離。20%FBS含むDMEMで細胞再懸濁。差速接着法で心筋細胞精製、トリパンブルー染色で生存率観察、生存心筋細胞を培養。24時間後、心筋細胞が壁に接着し拍動開始。72時間後、偽足拡大。

心筋細胞VMCモデル構築

対数増殖期の4パッセージ目心筋細胞を選択、MSCExo、NCExo、Adas-miR-133aExo、Ad-miR-133aExoで感染。100Tcid50 CVB3ウイルス溶液（100μL）を細胞に添加し細胞VMCモデル誘導。同時に同量維持液を対照細胞に添加、感染1時間後対応エクソソームを心筋細胞に添加、47時間培養。

CCK-8アッセイ

CCK-8細胞検出キット（Beyotime）で心筋細胞生存率検出。対数増殖期に達した細胞を0.25%トリプシンで剥離、96ウェルプレートに2.5×10⁴cells/wellで播種。CCK-8溶液（10μL/well）添加、1-4時間継続培養、マイクロプレートリーダーでOD450nm値測定。

フローサイトメトリー

Annexin V-APC/ヨウ化プロピジウム（PI）二重染色法で細胞アポトーシス検出。細胞を遠心分離、250μL結合バッファー（4mL結合バッファー+12mL脱イオン水）で再懸濁、1×10⁶cells/mLに調整。100μL細胞懸濁液にAnnexin V-APC 5μL（BD Biosciences）とPI溶液5μL（BD Biosciences）添加、フローサイトメーター搭載、コンピュータで自動解析。

デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ

MAML1 3'非翻訳領域（UTR）のワイルドタイプ（wt）または変異型（mut）配列をpGL3-Mベクター（Promega、ウィスコンシン、米国）にクローニング、MAML1-3'-UTR-wtまたはMAML1-3'-UTR-mutを生成。ベクターをmiR-133aミミックまたはNCと共にリポフェクタミン2000で心筋細胞にコトランスフェクション。48時間後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子システム（Promega）でルシフェラーゼ活性測定。

RNA免疫沈降（RIP）アッセイ

RIPキット（Millipore、米国）でMAML1とmiR-133aの結合検出。細胞をRIPAバッファー（P0013B、Beyotime、上海、中国）で溶解、1400gで遠心分離、抗体でインキュベートし共沈殿。磁気ビーズ（50μL）を100μL RIP洗浄バッファーで再懸濁、5μg抗MAML1抗体（1μg/mL、ab155786）またはIgG（1:100、ab172730）でインキュベート。磁気ビーズ-抗体複合体を900μL RIP洗浄バッファーで再懸濁、100μL細胞抽出液と相互作用、プロテアーゼKで消化、RT-qPCRで検出。

統計解析

SPSS 21.0統計ソフトウェア（IBM Corp.、アーモンク、ニューヨーク、米国）でデータ解析。測定データを平均±標準偏差で表示。2群間比較にt検定、群間比較に一元配置分散分析（ANOVA）、事後検定にTukey法。P値0.05以下で有意と判断された予測因子を保持。

結果

BMSCとBMSC-Exoの同定

顕微鏡下でBMSCは紡錘形と円形で、渦巻きまたは放射状パターンで壁に接着（図1A）。脂肪形成誘導後オイルレッドO染色で、4パッセージ目BMSCの脂肪滴が赤色、異なるサイズの円形脂肪滴を観察（図1B）。骨形成誘導後、石灰化結節発現細胞がアリザリンレッド染色で赤色、石灰化結節の不均一分布と細胞重なりを観察（図1C）。フローサイトメトリーで、MSCマーカーCD29とCD44（>95%）が発現、造血幹細胞表面抗原CD34（<95%）は非発現（図1D）。これらの結果はBMSCが高純度で、国際細胞治療学会のMSC基準に適合することを示しています。

透過型電子顕微鏡で、BMSC-Exoが明確な周辺膜構造を持つ楕円形小胞で、異なるサイズ、直径40-100nmと観察（図1E）。ウェスタンブロットで、抽出物がエクソソーム由来特性タンパク質CD9、CD63、CD81を発現することを実証（図1F）。

上昇したエクソソームmiR-133aが心筋炎症状を改善

miR-133a組み換えアデノウイルスによるBMSCトランスフェクションを観察（図2A）。倒立蛍光顕微鏡でNC、Ad-miR-133a、Adas-miR-133aの大量緑色蛍光発現を観察、組み換えアデノウイルスベクターがBMSCを効果的にトランスフェクトできることを示唆。miR-133aトランスフェクション効率をテストするため、BMSCとそのエクソソームでのmiR-133a発現をRT-qPCRで測定。miR-133a上昇でmiR-133a発現増加、miR-133a低下で発現減少を確認（図2B）。その後、miR-133a含有エクソソームをラットに注射。倒立蛍光顕微鏡で、NCExo、Ad-miR-133aExo、Adas-miR-133aExo処理VMCラットで緑色蛍光発現観察、組み換えアデノウイルスベクターがラット心筋組織に感染したことを示唆（図2C）。RT-qPCR実験でも、VMCラットでmiR-133a発現が明らかに低下；Ad-miR-133aExo注射VMCラットでmiR-133a発現が明らかに上昇、Adas-miR-133aExo注射VMCラットで低下（図2D）。ラットの一般状態では、正常対照ラットは正常、VMCラットとAdas-miR-133aExo注射VMCラットでVMC特徴が明確に発現（粗い無秩序な毛、呼吸困難、少食）。MSCExo、NCExo、Ad-miR-133aExo処理VMCラットではこれら症状が程度差はあるが改善。VMCラット体重は感染1日目から持続減少、MSCExo、NCExo、Ad-miR-133aExo注射で体重増加。Ad-miR-133aExo処理VMCラットで体重明確に増加、Adas-miR-133aExo注射VMCラットで明確に減少（図2E）。

心機能観察では（図2F）、VMCラットでLVPWとLVIDs増加、FSとLVEF減少。エクソソーム注射後、VMCラットでLVPWとLVIDs低下、FSとLVEF明確に上昇。Adas-miR-133aExo処理は悪化、Ad-miR-133aExoはVMCラット心機能を改善。

上昇したエクソソームmiR-133aがVMCラット心筋組織の炎症を抑制

HE染色で、正常対照ラット心筋線維が緊密に配列、間質に炎症細胞浸潤なし。VMCラット心筋細胞は無秩序に配列、間質に大量炎症細胞浸潤。MSCExoまたはNCExo注射VMCラットで心筋細胞が整然と配列、間質に少量炎症細胞浸潤。Adas-miR-133aExo処理VMCラットで心筋細胞無秩序配列、間質に炎症細胞浸潤。Ad-miR-133aExo処理VMCラットで心筋細胞整然と配列、明らかな炎症細胞浸潤なし（図3A）。

ELISAで（図3B、C）、炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）がVMCラットで明らかに増加。Ad-miR-133aExo注射VMCラットで炎症因子レベル低下。Adas-miR-133aExo処理でVMCラット炎症因子上昇。

上昇したエクソソームmiR-133aがVMCラット心筋組織のCVFを減少

マッソン染色で、正常ラット心筋線維が緊密に配列、青色膠原線維ほぼなし。CVB3注射後、心筋細胞肥大、結合組織增生、大量青色膠原線維、CVF明確上昇。エクソソーム処理で心筋細胞整然と配列、細胞間結合組織增生減少、青色膠原線維とCVF明確減少。Adas-miR-133aExo注射VMCラットで心筋細胞間隙拡大、細胞明確肥大、青色膠原線維とCVF明確増加；Ad-miR-133aExo処理VMCラットで細胞間隙減少、青色膠原線維分布とCVF減少（図4A、B）。

上昇したエクソソームmiR-133aがVMCラット心筋組織のコラーゲンI、コラーゲンIII、TGF-β1、CTGF発現を減少

コラーゲンIとコラーゲンIIIは膠原の主要成分、主に細胞接合部と細胞膜、細胞間質、細胞質に分布。TGF-β1とCTGFは線維化の代表的タンパク質。RT-qPCR結果で、コラーゲンI、コラーゲンIII、TGF-β1、CTGF mRNA発現レベルがVMCラットで増加、エクソソーム処理で減少。Ad-miR-133aExo処理VMCラットでこれらmRNA発現レベル減少、Adas-miR-133aExo処理VMCラットで逆の状況（図5A-C）。

上昇したエクソソームmiR-133aがVMCラット心筋組織の心筋細胞アポトーシスを抑制

TUNEL染色で、アポトーシス心筋細胞が褐色または褐黄色、核凝縮を示す。アポトーシス細胞数がVMCラットで増加、エクソソーム処理で減弱。Ad-miR-133aExo注射VMCラットでアポトーシス細胞数減少、Adas-miR-133aExo注射VMCラットで増加（図6A、B）。

上昇したエクソソームmiR-133aがVMCラット心筋組織のEMTを抑制

E-カドヘリン、α-SMA、FSP-1はEMTの主要指標。RT-qPCR結果で、α-SMAとFSP-1 mRNA発現レベルがVMCラットで上昇、E-カドヘリン mRNA発現レベルが低下。エクソソーム処理後、VMCラットでα-SMAとFSP-1 mRNA発現レベル低下、E-カドヘリン mRNA発現レベル上昇。Adas-miR-133aExo処理VMCラットでα-SMAとFSP-1 mRNA発現上昇、E-カドヘリン mRNA発現低下、Ad-miR-133aExo注射VMCラットでこれら指標発現は逆（図7A、B）。

上昇したエクソソームmiR-133aがVMC心筋細胞の炎症を抑制

結果として、倒立蛍光顕微鏡でNCExo、Ad-miR-133aExo、Adas-miR-133aExo処理VMCラットで緑色蛍光発現観察、組み換えアデノウイルスベクターがラット心筋細胞に感染したことを示唆（図8A）。RT-qPCRとELISAで（図8B、D）、miR-133a発現低下と炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）増加がVMCラットで認められ、エクソソーム処理で逆転。Ad-miR-133aExo処理VMCラットでmiR-133a上昇と炎症因子減少、Adas-miR-133aExo処理でmiR-133a低下と炎症因子増加。

上昇したエクソソームmiR-133aがVMC心筋細胞の細胞生存率促進とアポトーシス抑制

アポトーシスと細胞生存率をAnnexin V-APC/PI二重染色とCCK-8アッセイで検出。結果で、VMCラット心筋細胞でアポトーシス率明確増加、細胞生存率低下。エクソソーム処理でアポトーシス率減少、生存率向上。Adas-miR-133aExoでVMCラット心筋細胞のアポトーシス率増加、生存率阻害。Ad-miR-133aExo処理で心筋細胞に逆の効果（図9A-C）。

miR-133aがMAML1を標的とする

miRNA-193b上昇がMAML1標的化で心筋I/R障害を軽減との報告に基づき、バイオインフォマティクスサイトPITA、miRanda、PicTar、microT、miRmapでmiR-133a下流遺伝子をクロススクリーニングし、MAML1をmiR-133a標的として選択（図10A）。MAML1-wtまたはMAML1-mutを構築、心筋細胞にmiR-133aミミックまたはNCと共にコトランスフェクション。結果で、miR-133aミミックがMAML1-wtのルシフェラーゼ活性を低下（図10B）。RIP実験でmiR-133aとMAML1の標的関係をさらに検証（図10C）。RT-qPCRとウェスタンブロットでMAML1発現検出、miR-133aミミックトランスフェクション心筋細胞でMAML1発現低下（図10D、E）。

MAML1阻害が心筋炎ラットに保護効果を示し、miR-133a阻害エクソソームのVMCラットへの効果を逆転

miR-133a制御MAML1のVMCラットへの効果をさらに研究するため、si-MAML1またはsi-NCアデノウイルスをVMCラットまたはmiR-133a沈黙エクソソーム処理済みVMCラットに注射。注射成功をRT-qPCRとウェスタンブロットで検証（図11A、B）。結果で、si-MAML1注射でVMCラット体重増加（図11C）、心機能改善（図11D-G）、心筋組織病理と線維化減弱（図12A-C）、血清炎症（図12D、E）と心筋細胞アポトーシス（図13A-G）抑制。また、miR-133a沈黙エクソソームのVMCラットへの有害効果がsi-MAML1注射で逆転。

考察

心筋炎はDCMと心不全を招く炎症性心疾患で、CVB3などウイルス感染が最も頻繁な誘因。miR-133がVMCマウスで心筋細胞アポトーシスと電気的リモデリングを軽減との報告。また、変化したエクソソームmiRNAがCVB3誘発心筋炎の発症機序とリンクとの発見。心臓前駆細胞由来エクソソームがCVB3増殖抑制でCVB3誘発アポトーシスを緩和との報告。本研究では、BMSC由来エクソソームmiR-133がVMCラットの心筋線維化とEMTに及ぼす制御機構を探索（補足図1）。

本研究で、VMCでmiR-133a発現低下を発見。以前にMIでmiR-133a発現低下が実証。VMCマウス心臓でmiR-133相対発現が対照と比較して明らかに低下との研究も。miRNAとエクソソームには関連あり。疾患でのエクソソームとエクソソームmiRNAの差別的発現は、非侵襲的臨床診断のバイオマーカーとしての性能と治療ポテンシャルを併せ持つと見なされています。Linらは、miR-133が低酸素/再酸素化（H/R）誘発ヒト内皮前駆細胞由来エクソソームに特異的にソートされ、線維芽細胞血管新生とEMTを増加と報告。別研究で、MSCが脳実質細胞とコミュニケーションし、エクソソーム経由でmiR-133bを神経細胞に輸送することで神経突起伸長を調節可能と報告。

本研究の主要知見は、上昇したエクソソームmiR-133aがVMCラットで細胞生存率促進、炎症・アポトーシス・EMT・線維化抑制を示したこと。これは、miR-133a沈黙がアストラガルス多糖体治療誘導の骨肉腫MG63細胞増殖抑制逆転とアポトーシス促進を逆転との先行研究と整合。別研究で、miR-133a過剰発現が血管新生・アポトーシス・線維化・炎症抑制、虚血性心疾患での治療的心臓リモデリング加速と報告。本研究と類似して、LiらはmiR-133がVMCマウス心臓でアポトーシス関連遺伝子発現制御により心筋細胞アポトーシス抑制と報告。miR-133a過剰発現が低酸素誘発アポトーシス抑制と心筋細胞生存強化との報告。一方、上昇した血清エクソソームmiR-30aとmiR-181dがVMC診断バイオマーカーとして応用可能性ありとの報告。

本研究の別の知見は、上昇したエクソソームmiR-133aがVMCラットでCVF減少、コラーゲンIとコラーゲンIII発現減少を示したこと。コラーゲン膜から放出される線維芽細胞増殖因子-18が骨芽細胞活性を引き起こし、miR-133aダウンレギュレーションに関与との報告。インビトロでmiR-133a過剰発現が心筋細胞肥大抑制とコラーゲン発現減少を示す別研究による裏付け。CVFは膠原面積/(心筋面積+膠原面積)の比、平均値が切片のCVFを示す。この発見は、WangらがCVB3感染でVMCマウスモデルを成功裏に構築し、対照群と比較して明らかに高いCVF発現を示したことと一致。さらに、Ferreiraらが慢性シャガス病心筋症発症機序での遺伝子発現調節におけるmiR-133aの主要な役割、診断・予後ツールとしての潜在的リンクを実証したことと整合。また、MAML1ノックダウンが前処理心筋細胞肥大を軽減との報告。本研究でMAML1がmiR-133a標的遺伝子であり、MAML1阻害がmiR-133a沈黙エクソソームのVMCラットへの効果を逆転することを発見。心筋虚血-再灌流障害では、miR-193b介在MAML1ダウンレギュレーションが梗塞と心筋酵素減少、心筋細胞アポトーシス減弱に部分的に寄与との報告。また、MAML1欠損が肝線維化を緩和との報告もあります。

結論

結論として、本研究はVMCラットでmiR-133aがダウンレギュレートされ、上昇したエクソソームmiR-133aがMAML1標的化を通じてVMCラットの心機能改善、心筋線維化とEMT抑制、心筋細胞生存率向上とアポトーシス抑制をもたらす証拠を提供します。また、MAML1阻害が心筋炎ラットに保護効果を示し、miR-133a阻害エクソソームのVMCラットへの効果を逆転することを示唆。心筋炎における心筋線維化とEMTでのエクソソームmiR-133aの同定は、心筋炎の基盤機構理解を広げる可能性があり、新規分子ターゲットとして臨床的価値も持つかもしれません。この疾患治療への道筋をつけるため、さらなる研究が必要です。

略語

miR-133:

MicroRNA-133

BMSC-Exo:

骨髄間葉系幹細胞由来エクソソーム

EMT:

上皮間葉転換

VMC:

ウイルス性心筋炎

CVF:

膠原体積分率

DCM:

拡張型心筋症

CVB3:

コクサッキーB3ウイルス

miRNAs:

マイクロRNA

MI:

心筋梗塞

SPF:

特定病原体フリー

SD:

スプラグ・ドーリー

DMEM:

Dulbecco改変Eagle培地

PBS:

リン酸緩衝生理食塩水

FBS:

胎児牛血清

NC:

ネガティブコントロール

MOI:

多重感染度

LVPW:

左室後壁厚

LVIDs:

左室末期収縮期径

LVEF:

左室駆出率

HE:

ヘマトキシリン-エオシン

TUNEL:

末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTP-ビオチンニックエンドラベリング

ELISA:

酵素免疫測定法

TMB:

テトラメチルベンジジン

TBS:

トリス緩衝生理食塩水

ABC:

アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体

OD:

光学密度

RT-qPCR:

逆転写定量PCR

GAPDH:

グリセラールデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ

CTGF:

結合組織増殖因子

CCK:

細胞計数キット

PI:

ヨウ化プロピジウム

ANOVA:

分散分析