TiO₂ナノチューブ上でF-アクチンがMKL1とYAP/TAZを介して間葉系幹細胞の骨形成分化を媒介

概要

チタンおよびチタン合金は整形外科インプラントに広く使用されています。ナノトポグラフィ修飾は、チタン基板の骨結合改善に新たな戦略を提供します。フィラメント状アクチン（F-アクチン）重合は機械的負荷構造として、一般に細胞移動、エンドサイトーシス、細胞分裂、細胞形状維持に関与すると考えられています。しかし、F-アクチンがナノチューブ誘導間葉系幹細胞（MSC）骨形成分化に関与するか、もし関与するなら如何に機能するかは未解明です。本研究では、陽極酸化でチタン基板表面にTiO₂ナノチューブを作製し、走査型電子顕微鏡（SEM）、X線エネルギー分散分析（EDS）、原子間力顕微鏡（AFM）で特性評価しました。アルカリホスファターゼ（ALP）染色、ウェスタンブロット、qRT-PCR、免疫蛍光染色で骨形成ポテンシャル、F-アクチンレベル、MKL1およびYAP/TAZ発現を調べました。結果、陽極酸化電圧30→70 V上昇に伴いTiO₂ナノチューブ内径と粗さが増大、高さは2 μmで一定でした。さらに、チューブ径が大きいほどMSC骨形成分化促進能が強いことがわかりました。サイトカラシンD（Cyto D）でF-アクチン重合阻害すると、MSC骨形成分化およびフォーカルアデヒジョン複合体タンパク質ビンクリン（VCL）とフォーカルアデヒジョンキナーゼ（FAK）発現が抑制されました。一方、ヤスプラキノライド（Jasp）処理でF-アクチン重合促進すると、RhoAおよび転写因子YAP/TAZ発現が増強されました。これらデータから、TiO₂ナノチューブはMSC骨形成分化を促進し、この能力は一定範囲（30-70 V）でナノチューブ径増大とともに増強されること、F-アクチンがMKL1とYAP/TAZを介してこのプロセスを媒介することを結論付けました。

はじめに

チタンおよびチタン合金は、優れた生体適合性、耐食性、機械的特性により、全関節置換術や歯科インプラントなど臨床応用で広く使用されています[1-3]。しかし、無菌性ゆるみや感染など多くの課題が残っています[4,5]。近年、骨結合促進と抗菌性向上を目的とした多数の研究が行われています。例えば、チタンインプラント上のMoS₂/PDA-RGDコーティングは、チタンインプラントと宿主骨の結合促進のみならず、高効率で細菌増殖抑制も可能です[6]。さらに、表面トポグラフィが注目されており、トポグラフィ修飾はマイクロ/ナノスケール構造のみを変化させる点で化学修飾と異なります。化学シグナルによる細胞刺激は不安定で細胞毒性を持つ可能性があります。比較して、安全で制御可能な物理シグナルは化学分子による副作用を回避できます。したがって、インプラント表面トポグラフィ修飾とトポグラフィ構造による骨結合制御は、インプラント挿入後の骨結合不良という臨床問題解決の新たな道を提供します。

骨組織工学と骨再生分野では、細胞-形態相互作用がシード細胞機能と分化の精密制御に有望な管理戦略と見なされています。同時に、骨自体がナノメートルからミクロン範囲で優雅な階層構造を持っています[7]。したがって、表面形態は天然骨構造を模倣する類似ニッチを提供し、宿主骨とインプラント表面でのMSC骨形成分化を促進できます。表面形態はナノチューブ、ナノワイヤ、ナノポアなど多様な構造で構成可能です。特にナノチューブアレイは、高表面積/体積比、生物学的可塑性、高吸着容量などユニーク表面特性により近年多くの分野で広範な関心を集めています[8]。例えば、窒化ホウ素ナノチューブ（BNNT）がガス感応材料としてトランスフォーマー油中溶解ガス組成と含有量検知による運転監視ガスセンサに利用可能という新研究があります[8]。生物医学では、表面トポグラフィが細胞移動、接着、増殖、分化など細胞挙動を誘導可能です。最新研究ではナノスケールトポグラフィがMSCを骨芽細胞へ分化誘導し初期骨結合強化可能と明らかになっています[9-12]。複合マイクロ/ナノスケール表面修飾がMSCを収縮性平滑筋細胞へ分化誘導する報告もあります[13]。しかし、表面トポグラフィが細胞運命決定する分子機構は未解明であり、材料安全性評価と材料設計に重要です。

フィラメント状（F）-アクチン、別名マイクロフィラメントは、真核細胞細胞骨格3主要構成要素の一つです。グロビュラー（G）-アクチン重合体で構成され、多数他タンパク質で修飾されます。全マイクロフィラメントサブユニットが同一方向を向くためF-アクチンは構造的極性を持ちます。有棘端は異なる隣接モノマー方向を向き、尖端はATP結合部位露出したアクチンサブユニットを持ちます。つまりATPがG-アクチンとF-アクチン変換プロセスに関与します。このプロセスは動的平衡状態で、重合と脱重合が同時に起こり、トレッドミリングとして知られ、ラメリポディアやフィロポディアでよく見られます[14]。したがって、アクチン動態が細胞移動、細胞分裂、細胞形状維持など細胞機能に重要役割果たすことは明らかです。しかしF-アクチンは物理的構造として機械的負荷支持のみならず、シグナル伝達と遺伝子発現など他生物学的振る舞いにも参加します。蓄積エビデンスは、F-アクチンが他タンパク質と相互作用し物理シグナルを化学シグナルに変換可能ことを示しています[15-18]。例えば、生体力学的・幾何学的再構築がアクチンモノマー重合によるF-アクチン形成阻害で腫瘍細胞アポトーシス促進[15]。超音波パルスがF-アクチン脱重合阻害でヒトMSC骨形成促進[16]。先行研究でも機械的応力がF-アクチン安定性増加示しました[17]。ナノチューブ中空構造が細胞接着サイト減少させるため、生体力学的バランス維持のため細胞骨格再配列は不可避です。したがって、F-アクチンがナノトポグラフィ誘導細胞分化を媒介する可能性が高いと確信できます。

本研究では、陽極酸化でTiO₂ナノチューブを作製しトポグラフィ修飾し、MSC骨形成分化促進能を探索。次に、F-アクチンがメカノトランスダクションで重要役割果たすか調査。シトカラシンD（Cyto D）はF-アクチン有棘端に競合結合しG-アクチンフィラメント組込み阻害でF-アクチン重合抑制に、ヤスプラキノライド（Jasp）はアクチン集合安定化促進に用いました。さらに、F-アクチンが物理キューを生化学シグナルに変換する仕組み解明も目指しました。先行研究結果に基づき、MAPK経路関与仮説を立てました[17]。Yes-associated protein（YAP）/transcriptional coactivator with PDZ-binding motif（TAZ）とMKL1など転写因子は、メカノセンサーおよびメカノトランスデューサーと見なされ、F-アクチン関連示唆研究もあるため[19-21]、F-アクチンが幹細胞運命にどう影響するかスクリーニング対象としました。総じて、ナノチューブ誘導幹細胞分化におけるF-アクチン役割を明確化し、ナノチューブ修飾インプラント材料設計と生物学的安全性評価指針提供を目指します。

材料と方法

TiO₂ナノチューブ作製

純チタンスライス（99.9%純度、2 mm厚；盛世達、河北、中国）を基板として、No.400と1500耐水ペーパーで研磨。アセトン、無水アルコール、脱イオン水で超音波洗浄機で順次洗浄、最終的に室温3時間乾燥。ナノトポグラフィ作製のため、前処理試料を陽極、白金片を対極陰極とし、0.15 M NH₄Fと90%グリコール水溶液電解質で1時間陽極酸化。陽極酸化電圧は30、40、50、60、70 V定電圧。陽極酸化後、全試料を脱イオン水で30分洗浄、無水アルコールで超音波洗浄機15分洗浄。最終的に全試料を120 °C、1時間オートクレーブ滅菌し、培地で湿潤後使用。

ナノチューブ作製反応機構は不明確で、主流理論は電界増強溶解理論。ナノチューブアレイ形成は、電界酸化、電界溶解、化学溶解作用下動的平衡結果です（図1b）。陽極酸化プロセス記述：第一段階で電解質-金属界面に酸化障壁層形成：

$$ \mathrm{Ti}^{4+} + 2\mathrm{H_2O} \to \mathrm{TiO_2} + 4\mathrm{H}^+ \tag{1} $$

次に電界増強溶解で酸化層表面に亀裂と狭いスリット出現。F⁻イオンこれら亀裂とスリット拡散で溶解速度増大。亀裂拡大し隣接亀裂と連結。最終的にチタン酸化層形成速度と溶解速度が動的平衡達し、ナノチューブ成長停止：

$$ \mathrm{TiO_2} + 6\mathrm{F}^- + 4\mathrm{H}^+ \to [\mathrm{TiF_6}]^{2-} + 2\mathrm{H_2O} \tag{2} $$

表面キャラクタリゼーション

異なる電圧（30、40、50、60、70 V）で作製試料をエタノールと脱イオン水で15分洗浄、室温乾燥。走査型電子顕微鏡（SEM450、FEI Nova Nano SEM；Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA）で表面構造観察、金薄膜コート後ナノチューブ内径と高さ測定。同時にX線エネルギー分散分析（EDS）でナノチューブ元素組成分析。原子間力顕微鏡（AFM、NanoManVS、Bruker Nano Surfaces、Bruker MicroCT、Kontich、Belgium）で表面形態と表面粗さ調査。各試料から3異なる領域選択し測定3回繰り返し。

細胞培養

4週齢雄性Sprague-Dawley（SD）ラットを上海第九人民病院実験動物センター（上海、中国）から購入。ラット大腿骨と脛骨から無菌的に骨髄間葉系幹細胞（BMSC）分離。BMSCを精製し、10%（v/v）胎仔牛血清（FBS）（Gibco/Life Technologies、Carlsbad、CA、USA）、100 mg/mLストレプトマイシン（Gibco）、100 U/mLペニシリン（Gibco）含有α-最小必須培地（α-MEM；Hyclone、Logan、UT、USA）で増殖培養、37 °C、95%空気と5% CO₂湿潤雰囲気で培養。培地2日毎更新、80%コンフルエントでトリプシン化継代。本研究使用全細胞は3-5パッセージ間。骨形成誘導培地は、増殖培地に100 nMデキサメタゾン、10 mM β-グリセロリン酸、50 mMアスコルビン酸（Sigma-Aldrich、St Louis、MO、USA）補充で調製。

細胞増殖アッセイ

TiO₂ナノチューブ修飾チタンスライスを円形切出し、24ウェルプレートウェルに配置。3-5パッセージBMSCを3×10⁴ cells/well密度でTiO₂ナノチューブ上に、増殖培地または骨形成培地で培養。2日培養後、F-アクチン重合破壊用シトカラシンD（Cyto D、Sigma-Aldrich）とヤスプラキノライド（Jasp、Sigma-Aldrich）を3日間毎日培地添加。Cyto DとJasp最終濃度と作用時間はそれぞれ5 μM、1時間と2 μM、3時間。試薬インキュベーション後培地更新。細胞生存率と増殖をCell Counting Kit-8（CCK-8）アッセイ（同仁堂、熊本、日本）で評価。Cyto DまたはJasp処理12時間後。細胞を10%（v/v）CCK-8溶液で37 °C、5% CO₂細胞インキュベーター2時間インキュベート。反応混合物100 μLを96ウェルプレートウェルに移し、マルチスキャンUV-可視分光光度計（Safire2；TECAN、Mannedorf、スイス）で450 nm吸光度（OD）測定。さらに自動細胞カウンター（AMQAX1000、Life Technologies）で概算細胞数計数。計数前、BMSCをTiO₂ナノチューブから酵素剥離し、トリパンブルー（Sigma-Aldrich）染色。

アルカリホスファターゼ染色とALP活性解析

BMSCを5種異なるTiO₂ナノチューブ修飾チタンスライス（30、40、50、60、70 V）に3×10⁴ cells/well密度で播種、骨形成培地で培養。試薬添加は上記通り。7日インキュベーション後、TiO₂ナノチューブ上BMSCをPBSで3回洗浄、4%パラホルムアルデヒド固定、ALPキット（香港喬、上海、中国）製造元指示通りALP作業液インキュベート。ステレオ顕微鏡でPBS洗浄後観察。

ALP活性解析では、細胞をプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤なしRIPAバッファーで溶解、遠心上清をALPアッセイキット（ベイタイム生物工学研究所、江蘇、中国）プロトコル通りアッセイ。活性は対応溶解液タンパク質濃度で正規化。

免疫細胞化学

Cyto DとJasp処理3日後、BMSCを4%パラホルムアルデヒド20分室温固定、PBS 3回洗浄。0.3% Triton-X 100で30分透過化、PBS 3回洗浄、ローダミン標識ファロイジンで1時間室温暗所染色。PBS洗浄後、DAPI（ベイタイム生物工学研究所）で10分室温対向染色。さらにPBS 3回洗浄後、ガラススライド固定し共焦点顕微鏡観察。

ウェスタンブロット

タンパク質発現評価のため、TiO₂ナノチューブ上培養BMSCをトリプシン（Gibco）回収。PBS 3回洗浄、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテル補充RIPAバッファーで氷上30分溶解。12,000×g、15分、4 °C遠心上清回収。総タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイキット（ベイタイム）製造元指示通り測定。ローディングバッファー添加後、95 °C 15分煮沸。ウェスタンブロット解析で、10 μLタンパク質調製液を12.5% SDS-PAGEゲル（EpiZyme Inc.、Cambridge、MA、USA）ロード、120 V 1時間電気泳動、250 mA 2時間でポリビニリデンジフルオライド（PVDF）メンブレン電気転写。メンブレンを5-10%脱脂粉乳TBSTで1時間室温シェーカー遮断、一次抗体を希釈バッファー（ベイタイム）希釈し4 °C一晩反応。TBST 3回5分洗浄後、蛍光標識二次抗体希釈バッファー添加、1時間室温暗所反応。タンパク質バンドを二色赤外蛍光イメージングシステム（Odyssey、LiCor Biosciences、Lincoln、NE、USA）検出。内部参照タンパク質バンド統一時、メンブレンストリッピング後別一次抗体で再プローブ、同プロセス繰り返し。内部参照タンパク質にGAPDH抗体使用しタンパク質発現正規化。本研究使用他一次抗体：抗ビンクリン（1:1000希釈、Abcam、Cambridge、MA、USA）、抗FAK（1:1000、Cell Signaling Technology、Danvers、MA、USA）、抗Runx2（1:1000、Cell Signaling Technology）、抗RhoA（1:1000、Cell Signaling Technology）、抗F-アクチン（1:500、Abcam）、抗Osx（1:500、Abcam）、抗pYAP（1:1000、Cell Signaling Technology）。二次抗体：ゴート抗マウスIgG H&L（IRDye® 680RD、1:5000、Abcam）、ゴート抗ウサギIgG H&L（IRDye® 680RD、1:5000、Abcam）。

定量的リアルタイムPCR

7日目に定量的リアルタイムPCR実施、骨形成培地でTiO₂ナノチューブ上培養細胞におけるrunt-related transcription factor 2（Runx2）、Osterix（Osx）、Alp、osteocalcin（OCN）、RhoA、YAP、TAZ、vinculin（VCL）、focal adhesion kinase（FAK）、megakaryoblastic leukemia 1（MKL1）遺伝子発現評価。Total RNA Kit（R6812-01HP、Omega Bio-Tek Inc.、Norcross、GA、USA）で細胞から総RNA抽出。RNA試料濃度と純度を260 nm光学密度で決定、A260/280比とA260/230比両方1.8超試料のみ解析。qScript cDNA合成キット（高田、滋賀、日本）製造元指示通りcDNA逆転写。SYBR® Premix Ex Taq™（高田）使用、QuantStudio 6 FlexリアルタイムPCRシステム（Life Technologies）で定量的リアルタイムPCR実施。ハウスキーピング遺伝子GAPDHを内部参照。比較Ct（2⁻ΔΔCt）法でデータ解析、コントロール比較でフォールドチェンジとして発現。使用プライマー配列を表1に示す。

統計解析

全データは別段指示ない限り、トリプレート試料使用し少なくとも3独立実験代表値。データは平均±標準偏差（SD）で表現。群間差は一元配置分散分析後Student-Newman-Keuls事後検定またはStudentのt検定で評価。P<0.05を統計的有意と判定。

結果

表面キャラクタリゼーション

ナノトポグラフィ作製のため、異なる定電圧（30、40、50、60、70 V）で1時間陽極酸化装置使用し純チタン基板上にTiO₂ナノチューブ形成（図1）。走査型電子顕微鏡（SEM）で均一分布自己組織化ナノチューブアレイ観察。ナノチューブ側面図と上面図を図2a,bに示します。本研究全試料ナノチューブ高さ約2 μm一定、内径は約74 nm（30 V）、92 nm（40 V）、112 nm（50 V）、128 nm（60 V）、148 nm（70 V）（図2c）。これはナノチューブ高さが陽極酸化時間関連、内径が陽極酸化電圧関連であることを示唆。X線エネルギー分散分析（EDS）でナノチューブ元素組成分析。ナノチューブはOとTiのみ2元素構成（図2d,e）。原子間力顕微鏡（AFM）でナノチューブ構造検出、ナノチューブ輪郭平均偏差として表面粗さ（Ra）測定（図2f）。データはナノチューブ表面粗さが径（陽極酸化電圧）増大とともに増加示す（図2g）。

TiO₂ナノチューブによるMSC骨形成分化誘導

7日骨誘導後、ALP染色でMSC骨形成分化評価。染色結果、TiO₂ナノチューブ上培養MSCは平滑チタン基板（コントロール群）より高ALP活性示す（図3a）。染色面積統計解析で、ナノチューブ骨形成分化誘導能がコントロール群比較有意増強。同时、実験径範囲内でTiO₂ナノチューブ径大いほど骨形成分化誘導能強い傾向観察（図3b）。したがって後続実験で70 V群使用し結果明確化。次に3日目と7日目骨形成遺伝子発現解析。TiO₂ナノチューブ上3日と7日培養MSC両方で、コントロール群比較骨形成遺伝子（RUNX2、ALP、OCN、OSX）発現有意促進（図3d-g）。ウェスタンブロット結果、7日骨誘導後RUNX2とOSXタンパク質発現も増加確認（図3c）。興味深く、TiO₂ナノチューブ群でF-アクチン上昇観察。したがって、TiO₂ナノチューブがMSCを骨芽細胞分化誘導し、ナノチューブ径関連すること明らか。結果はF-アクチン関与も示唆。

TiO₂ナノチューブ上MSC骨芽細胞分化へのF-アクチン媒介

F-アクチンがナノトポグラフィ誘導細胞分化関与するかさらに探索のため、ヤスプラキノライド（Jasp）とシトカラシンD（Cyto D）でF-アクチン重合を正負両方向で制御。ローダミン-ファロイジン染色共焦点顕微鏡写真で、Cyto D処理群F-アクチンほぼ脱重合し線維構造稀、JaspでF-アクチン安定化重合促進、コントロール群より明確明るい束状構造確認（図5a）。ウェスタンブロット解析でもF-アクチンタンパク質発現変化確認、Cyto DとJasp期待通り作用証明（図5b）。細胞増殖アッセイで、Cyto D有意増殖抑制、Jasp増殖促進（図4a）。細胞計数結果も整合（図4b）。

次に、MSC骨芽細胞分化能評価でF-アクチン媒介性調査。早期骨形成マーカーALP検出。コントロール群比較、Cyto D処理でALP発現と活性低下、Jasp処理群で上昇（図4c,d）。整合して、Jasp処理でRUNX2とOSXタンパク質レベル上昇、Cyto D逆効果（図4c）。一致して、骨特異的遺伝子（RUNX2、ALP、OCN、OSX）mRNA発現レベルも薬物処理後同傾向（図4e-h）。以上データは、F-アクチンがTiO₂ナノチューブ誘導MSC骨形成分化プロセス重要役割果たすこと示唆。F-アクチン脱重合促進はナノトポグラフィ誘導骨芽細胞分化阻害、F-アクチン安定化重合促進は骨芽細胞分化増強。

TiO₂ナノチューブ上MSC骨芽細胞分化におけるF-アクチンによるMKL1とYAP/TAZ制御

MSC運命制御におけるF-アクチン関与基盤機構解明のため、F-アクチン直接相互作用または重合影響タンパク質/分子調査。まず、ナノトポグラフィがF-アクチンとG-アクチンバランスどう影響するか特定試み。TiO₂ナノチューブ物理シグナルは膜透過性化学シグナルと異なり、細胞膜成分用いて刺激細胞内伝達必要。蓄積エビデンスで、インテグリン、タリン、フォーカルアデヒジョンキナーゼ（FAK）、ビンクリン（VCL）、テンシン等含むフォーカルアデヒジョン複合体がシグナルキャリアとして機能し、細胞外マトリックス（ECM）状態細胞へ伝達し生物学的振る舞い影響[22,23]。より重要、F-アクチンがフォーカルアデヒジョン複合体通じインテグリン結合し、細胞内アクチン束とECM間機械的連結形成[24]。したがって、フォーカルアデヒジョン複合体構成要素発現解析。結果、VCLとFAKタンパク質とmRNA発現がF-アクチン変化と整合、フォーカルアデヒジョン複合体がTiO₂ナノチューブ誘導MSC骨形成分化プロセス関与示唆（図5b、6a,b）。さらに、Rhoファミリー小GTPアーゼ蛋白RhoAがJasp処理群で上昇、Cyto Dで抑制（図5b、6a,b）。RhoAはMAPK経路重要上流シグナル伝達分子、FAK制御可能[25,26]。RhoA主機能はストレスファイバー（F-アクチン）重合安定化促進とフォーカルアデヒジョン複合体集合促進[27]。総合し、TiO₂ナノチューブがフォーカルアデヒジョン複合体とRhoA通じF-アクチン重合影響可能示唆。

ではF-アクチン如何に細胞運命制御？多く研究でF-アクチンが細胞移動、分裂、エンドサイトーシス、特に腫瘍細胞浸潤関与示す[28-30]。F-アクチンが細胞分化制御可能示唆研究少なく、特定分子機構さらに稀[31,32]。したがってF-アクチン変化言及文献検索し、ヒッポシグナル経路2密接関連転写共活性化因子YAP/TAZが細胞質と核間シャトルし、MSC分化制御メカノトランスデューサーとして機能可能性見出す[33-35]。さらに、平滑筋細胞分化鍵制御因子MKL1が転写因子血清応答因子（SRF）と相互作用し、G-アクチン結合し細胞質と核間循環可能ことも発見[21,36]。結果、最終的にYAP/TAZとMKL1がF-アクチン媒介ナノチューブ誘導骨芽細胞分化関与特定（図5b、6d-f）。興味深く、リン酸化YAPタンパク質発現逆傾向示し、YAP発現変化のみならずCyto DとJaspでYAPリン酸化も変化すること示唆（図5b）。この結果は、YAP/TAZリン酸化が細胞質隔離される報告と整合[35]。

要約すると、結果はF-アクチンがTiO₂ナノチューブ上MSC骨芽細胞分化をMKL1とYAP/TAZ通じ制御すること予備的に実証（図7）。

考察

チタンおよびチタン合金はチタン優良特性により整形外科臨床インプラント最広範使用金属材料[3]。しかし無菌性ゆるみ依然緊急解決課題、鍵はインプラントと宿主骨結合改善にありそう。先行研究で表面コーティング修飾や生物機能分子固定化が骨結合有益示唆[37]。最近、物理キュー細胞応答研究によりインプラント表面トポグラフィが多く研究者注目集める[9-11,13,38]。本研究でナノチューブMSC骨形成分化促進能実証、この能力がナノチューブ内径増大（30-70 V）とともに増強示し、インプラント表面ナノチューブ径設計指針提供。

トポグラフィ構造としてナノチューブはまず材料物理特性（吸着容量、電気/熱伝導性）変化。これら物理特性が工業分野応用決定。例：高圧電力トランス多くは絶縁材（通常トランス油或絶縁ガス）充填必要。過熱と部分放電で絶縁失敗時重大放電事故発生。したがってトランス油中溶解ガスや絶縁ガス分解成分濃度と種類正確検知しトランス運転状態監視する効果的方法探索必要[8,39-41]。従来遷移元素（d電子豊富、例Pd(111)）良好ガス吸着材料探索[39]。近年ナノチューブ良好ガス吸着特性で広く研究。HeらはCuO-BNNTがC₂H₂吸着強力でC₂H₂吸着適材料発見[8]。一方TiO₂自体ガスセンシング材料。GuiらはCoドープTiO₂がガス吸着容量さらに向上、C₂H₄分子へ優れた吸着能と伝導度変化示す[40]。本研究整合し、Mnドープグラフェンも固有グラフェンより伝導度向上とC₂H₂、CO検知優秀能力示す[41]。以上研究は本実験調製TiO₂ナノチューブがトランス運転状態監視分野潜在応用可能性示唆。しかしガスへの吸着容量と電気伝導性、特に遷移元素（例Mn）ドープ後これら特性増強か否か更なる研究必要。

表面物理特性変化に加え、ナノスケール形態は付着細胞生物学的振る舞い影響。細胞はまず材料表面接着、その後移動、増殖、分化。平坦表面比較、ナノチューブ中空構造は細胞接着サイト減少。したがって細胞がナノチューブ表面安定接着し細胞内生体力学的バランス維持するため、フォーカルアデヒジョン複合体組立成熟開始、F-アクチン強固安定化。

F-アクチン、G-アクチンモノマーからなる線形重合マイクロフィラメント、細胞骨格3主要構成要素一つ。機械的負荷構造として、一般に細胞分裂、移動、エンドサイトーシス、腫瘍細胞浸潤関与と考えられる[28-30]が、最近研究で細胞分化影響可能も示唆[31-33,36]。例：シンバスタチンによるアクチン細胞骨格脱重合が軟骨細胞分化誘導[31]、アクチン脱重合がヒト間質幹細胞脂肪分化促進[32]。本結果でも、コントロール群比較ナノチューブ上培養MSCでF-アクチンレベル高くより明確線維構造観察。一方、JaspでF-アクチン重合促進は骨形成分化増強、F-アクチン脱重合は骨形成分化抑制、F-アクチンがTiO₂ナノチューブ誘導MSC骨芽細胞分化媒介示唆。

F-アクチンはRho GTPアーゼ（Rasスーパーファミリー）制御可能[23,42]。Rhoは少なくともROCKとDia2エフェクター通じアクチン再構成誘導。ROCKはRho-GTP結合活性化、ROCK基質ミオシン軽鎖（MLC）がF-アクチン集合重要役割。ROCKはMLCホスファターゼ活性阻害、MLCリン酸化増加、ミオシンII ATPアーゼ活性刺激、F-アクチン集合促進。さらにROCKはLIMキナーゼ（LIMK）標的。リン酸化LIMKがコフィリン不活性化（リン酸化）、活性コフィリンはF-アクチン解体重合。もう一つエフェクターDia、フォルミン相同（FH）ファミリー蛋白、2FHドメイン含有。これらドメイン複数プロリン豊富モチーフ含み、G-アクチン結合蛋白プロフィリン結合。この相互作用がアクチン重合とF-アクチン組織化寄与[42]。本研究Rho GTPアーゼ一つRhoA検出、RhoA発現F-アクチンレベル整合。しかしナノチューブ如何にRhoA発現制御か明確記述不能、インテグリンシグナル、他接着受容体、Gタンパク質共役受容体（GPCR）、可溶性因子（LPA等）、受容体チロシンキナーゼシグナル等多数他制御因子存在[43]。

F-アクチンがRhoA制御可能知り、フォーカルアデヒジョン此処役割何か問う。フォーカルアデヒジョン複合体（インテグリン、タリン、ビンクリン、パキシリン、FAK含）は細胞ナノチューブ表面付着時形成成熟。インテグリンは膜貫通ヘテロダイマーでECM他フォーカルアデヒジョン蛋白質結合し細胞付着促進。単純フックのみならず、EGFR等他シグナルと共に周囲環境本質重要シグナル細胞伝達、細胞生物学的振る舞い決定促す。これらシグナルさらにF-アクチン伝達、フォーカルアデヒジョン複合体直接連結。一方面ナノスケール形態がフォーカルアデヒジョン複合体組立成熟誘導。他方FAKやSrcキナーゼファミリー等キナーゼがCRK等分子リクルートしフォーカルアデヒジョン複合体組立成熟自己制御[44-46]。本結果、F-アクチン脱重合でフォーカルアデヒジョン複合体形成成熟障害示し、公表報告と整合するフォーカルアデヒジョン複合体からアクチン集合へフィードバック存在示唆。

しかし、フォーカルアデヒジョン複合体含蛋白質がシグナル伝達機能持つこと見逃せない[47]。つまりナノチューブがシグナルカスケード直接遺伝子発現制御可能、F-アクチン単に此プロセス参加或影響受け可能。例：FAKとSrc二重キナーゼ複合体がRho GTPアーゼ（RhoA等）制御可能。これはナノチューブがインテグリンとFAK/Src複合体通じRhoA制御可能示唆。さらにSrc、非受容体チロシンキナーゼ蛋白質、FAKチロシン残基925リン酸化でRas（小GTPアーゼ）活性化可能[47,48]。Ras多数生化学経路活性化、よく研究されるMAPK経路とPI3K/AKT/mTOR経路含。MAPK経路でRasがc-Raf活性化、続きMAP2K、MAPK1/2（ERK）活性化。ERK転而SRFとc-Myc等転写因子活性化、増殖分化制御関与[49]。さらにRunx2、骨形成分化鍵転写因子、ERK制御可能[50]。先行研究で機械的応力がFAK-Erk1/2-Runx2経路通じBMSC骨形成分化促進確認[17]。したがってERKがナノチューブ誘導骨形成分化役割果たす可能性排除不能、更なる研究必要。

ではナノチューブ誘導分化におけるF-アクチン正確役割何か、其変化細胞分化影響可能？一つ可能性：F-アクチン集合変化が逆向きFAKレベル制御し、上述FAK-Erk1/2-Runx2経路通じ骨形成分化誘導。本結果でフォーカルアデヒジョン複合体とアクチン重合同傾向変化示し、細胞外環境応答一体として作用示唆。しかし他可能性存在、多数論文でMKL1とYAP/TAZがアクチン動的平衡下流作用示す[20,51-54]。両者細胞質核間シャトル、細胞骨格から核へシグナル伝達補助可能。

MKL1、別名myocardin-related transcription factor A、G-アクチンレベル変化感受性。細胞質G-アクチンレベル増加時、モノマーG-アクチンMKL1結合しSRF結合と転写活性化阻害。SRF標的遺伝子含平滑筋アクチン（SMA）等アクチン、他アクチン結合蛋白質、即時早期遺伝子c-fos、egr1等。最近研究でSRF活性変化がアディポネクチン転写因子PPARγ活性化で脂肪生成制御、IGF-1とRunx2シグナルで骨形成制御可能実証[55,56]。

YAPとTAZ、ヒッポシグナル経路2転写共活性化因子、細胞増殖制限し臓器サイズと形態形成制御重要制御経路同定[20]。LATS1/2大腫瘍抑制遺伝子1/2がリン酸化、14-3-3蛋白質結合部位作成、其結合核輸入阻害[53,54]。結果、YAP/TAZリン酸化型細胞質隔離、CtgfとAreg等遺伝子発現阻害。さらにYAP/TAZがT-box 5（TBX5）、RUNX2、p73相互作用し遺伝子発現制御示唆研究[57-59]。細胞マトリックス蛋白質接着がインテグリン/FAK/Src軸通じYAP核局在誘発示す[57-59]。本研究結果、此経路ナノチューブ誘導分化関与可能性示唆。インテグリン/FAK/Src軸下流メディエーター詳細研究で特定機構明確化必要。

他方、増加研究でF-アクチンヒッポシグナル相互作用、何らかYAPリン酸化阻害示す[54,60]。本実験結果整合、F-アクチン重合促進でリン酸化YAP発現減少。G-アクチンとF-アクチン変換関与ATPがYAPリン酸化重要役割果たす可能性仮説、未研究。

以上分子機構理解後、本研究発見実験現象説明試み。結果、ナノチューブ径大いほど骨形成分化促進能強いこと明らか。先行研究と整合[61,62]。理由：ナノチューブ径大いほど細胞供給接着サイト少、フォーカルアデヒジョン複合体組立成熟度大。伴ってF-アクチン構成ストレスファイバー強度安定性増大。これら構造骨形成分化促進シグナル増強。予測通り、ナノチューブ径過大時此効果有意減少、細胞表面接着困難[12]。同様ナノチューブ高さ不均一時、高さ差異接着サイト変化と細胞骨格再配列結果、さらに細胞分化影響。興味深く、ナノチューブ修飾なし平坦表面材料でも細胞分化変化誘導可能。多数研究で基板剛性がフォーカルアデヒジョン形成とストレスファイバー組織制御実証[63-65]、YAP/TAZも此プロセス重要役割。したがってインテグリン-FA（フォーカルアデヒジョン）-F-アクチン軸が物理シグナル細胞内化学シグナル変換役割果たすこと明らか。

要約すると、本結果F-アクチンがTiO₂ナノチューブ上MSC骨芽細胞分化をMKL1とYAP/TAZ通じ制御実証、其標的遺伝子部分MSC増殖分化説明。単一シグナル変化なく、あらゆる変化多数分子蛋白質制御下調節。一種生物学的振る舞い必ず一連シグナル経路制御結果。ナノチューブインテグリン、フォーカルアデヒジョン複合体含蛋白質、FAK、Src、Rho GTPアーゼ、MAPK経路、ヒッポ経路、他報告シグナル経路含複雑シグナルネットワーク引き金で細胞分化誘導。少なくとも同等重要、シグナルネットワーク多数シグナルサイクル存在、下流シグナルフィードバックで上流制御可能。本研究でビンクリンとFAKがF-アクチン集合逆制御可能発見、分子機能不確実性増大。したがって分子機構更詳細更研究待たれる。

結論

本結果、TiO₂ナノチューブがMSC骨形成分化促進し、此能力一定範囲（30-70 V）でナノチューブ径増大とともに増強示しました。F-アクチンがナノチューブ誘導細胞分化をMKL1とYAP/TAZ介し媒介し、細胞分化研究へ新知見提供。

データと材料の入手可能性

本研究使用解析データセットは、合理的要請に応じ責任著者より入手可能。

略語

MSCs:

間葉系幹細胞

SEM:

走査型電子顕微鏡

EDS:

X線エネルギー分散分析

AFM:

原子間力顕微鏡

ALP:

アルカリホスファターゼ

Cyto D:

シトカラシンD

Jasp:

ヤスプラキノライド

VCL:

ビンクリン

FAK:

フォーカルアデヒジョンキナーゼ

BCA:

ビシンコニン酸

PVDF:

ポリビニリデンジフルオライド

Runx2:

Runt-related transcription factor 2

Osx:

Osterix

OCN:

オステオカルシン

YAP:

Yes-associated protein

MKL1:

Megakaryoblastic leukemia 1

FBS:

胎仔牛血清

ECM:

細胞外マトリックス

MLC:

ミオシン軽鎖

LIMK:

LIMキナーゼ

FH:

フォルミン相同

GPCR:

Gタンパク質共役受容体

MAP2K:

ミトゲン活性化蛋白質キナーゼキナーゼ

ERK:

細胞外シグナル調節キナーゼ

SRF:

血清応答因子

SMA:

平滑筋アクチン

PPARγ:

ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ

LATS1/2:

大腫瘍抑制遺伝子1/2

TBX5:

T-box 5