骨統合を改善するためのチタン上の銅ドープミクロポーラスコーティングに対する骨芽細胞の応答

はじめに

医療用硬組織インプラント材料は、強度、弾性率、耐摩耗性、耐疲労性などの適切な機械的特性を備えている必要があります。これにより、インプラントは、インプラント領域の生理学的負荷に長期間耐えることができます。同時に、インプラントが人体に有害反応を引き起こすことなくインプラント領域の生理学的組織と良好な組み合わせを形成できるように、材料は良好な生体適合性および生物活性さえも持たなければならない。純チタンおよびチタン合金は、優れた機械的特性と生体適合性を備えており、現在最も広く使用されている金属製インプラント材料です。

インプラントが埋め込まれた後、一連の生化学反応が最初に材料の表面で発生し、表面の特性が内部環境へのインプラントの応答に重要な役割を果たします。インプラント表面の微細構造と化学組成はタンパク質の吸着を変化させる可能性があり、タンパク質は細胞接着を調節し、最終的にそれらの機能を決定します[1]。チタンとチタン合金は最も広く使用されている整形外科用インプラント材料ですが、チタンには生物活性がありません。体内に移植した後は、移植領域の骨組織と化学結合を形成することはできません。チタンおよびチタン合金は、主に機械的インターロックに依存して保持を実現し[2]、体内の長期的な身体機能を促進しません。

チタンインプラントの表面コーティングは、チタンの機械的特性を補完し、不十分な生物活性に関連する欠点を克服することができます。つまり、基板としてのチタンは機械的特性を提供することができ、良好な表面構造と生物活性を備えた元素がコーティングとして使用されます。この層は生物学的活動を提供し、この分野の研究は研究のホットスポットになっています。

現在、金属表面への生物活性コーティングの調製に使用される技術には、主にプラズマ溶射、イオンビーム支援蒸着、電気泳動蒸着、パルスレーザー物理蒸着、マイクロアーク酸化、マグネトロンスパッタリング蒸着、ゾルゲル、直接レーザークラッド、およびレーザーアブレーション[3,4,5,6,7,8,9,10]。その中で、プラズマ溶射技術には商業的用途があります。しかしながら、現在のコーティング技術は、主に以下の問題のために、依然として臨床要件を満たすことができない。コーティングの生物活性相は、結晶化度が低く、生物活性が低い。コーティングと基材の間の接着強度が良くありません。コーティングの内部材料は容易に溶解し、それは体内のコーティングの長期安定性に影響を及ぼします。コーティングの準備プロセスが複雑すぎ、プロセス条件が厳しく、コストが高く、効率が低い[11]。

金属インプラントの表面改質に現在広く使用されている効果的な表面改質技術であるマイクロアーク酸化は、プラズマ高温高圧の瞬間焼結効果を利用しています。材料の表面が粗くて多孔質の表面を生成するだけでなく、生物学的に活性な要素もコーティングに導入することができます。マイクロアーク酸化技術によって修飾された材料の表面は、マトリックス材料の表面形態、粗さ、疎水性、表面エネルギー、およびその他の物理的および化学的特性を大幅に改善できるため、材料の生物活性と生体適合性が大幅に向上します。輸入された材料と骨組織の間のオッセオインテグレーションは非常に重要です[12]。

銅（Cu）は、骨芽細胞の成長を促進したり、血管内皮の接着と増殖に有益な内膜組織における血管内皮成長因子の発現を促進したりするなど、さまざまな機能を持つ人体に不可欠な微量元素です。細胞。 Cuはまた、脂質過酸化反応を促進し、細菌のエネルギー代謝を妨害し、薬剤耐性を容易に引き起こさない細菌の活性DNAおよび関連酵素の合成を阻害します[13]。さらに重要なことに、特定の濃度範囲の銅イオンは、高い生物学的活性と優れた抗菌特性の両方を備えていると認識されています。したがって、銅イオンは、生体材料の設計に使用すると、優れた生体適合性を持つことが証明されています[14]。

細胞とインプラントの間の相互作用は、オッセオインテグレーションインターフェースの形成を誘導する上で重要な要素です。この相互作用は主に、表面の化学組成、表面エネルギー、表面電荷、表面形態など、インプラント表面の材料特性に依存します。細胞とインプラントの間のこの相互作用は、細胞の接着、増殖、分化に影響を与える可能性があります。多孔質表面は細胞接着、増殖、分化を促進することが証明されており、無機イオン（亜鉛、ストロンチウム、マグネシウムなど）をドープしたインプラントもオッセオインテグレーションを促進することが証明されています[15、16]。

マイクロアーク酸化装置のプロセスは簡単で、準備されたコーティングの特性を調整することができます。電解質の組成を変えることにより、異なるイオンでドープされたコーティングを調製することができます。銅は生物の中で重要な役割を果たしています。コーティング中の適切な量の銅イオンは、骨芽細胞の増殖を促進し、表面の細菌の付着を阻害する可能性があります。したがって、この研究では、ミクロポーラスCu–TiO ₂ を準備しました。 チタン表面にコーティングし、in vitroの細胞実験と動物実験を使用して、ミクロポーラスCu–TiO ₂ の効果を観察および分析しました。 チタンの表面活性と生体適合性のコーティング。また、ミクロポーラスCu–TiO ₂ の実現可能性についても調査しました。 MC3T3-E1細胞の接着、増殖、骨形成分化を促進し、インプラントと骨の界面での新しい骨の形成とオッセオインテグレーションを促進して、微孔性Cu–TiO ₂ チタンインプラントの表面のコーティング。

材料と方法

サンプルの準備と特性評価

チタンはワイヤーカットにより、直径12 mm、厚さ1mmのサンプルに加工されました。インプラントは、直径3 mm、長さ8mmのチタンロッドになりました。サンドペーパーを滑らかにし、アセトンと脱イオン水で洗浄してコーティングを準備しました。この研究では、自家製の低電力マイクロアーク酸化電源を使用しました。マイクロアーク酸化電圧は450V、モードは定電流、マイクロアーク酸化時間は5分、周波数は1000Hzでした。

ブランクの対照群はTiとラベル付けされ、酢酸カルシウムとグリセロリン酸カルシウムが基本的な電解質溶液として使用されました。塩基性電解質溶液中のマイクロアーク酸化後のTiサンプルはTCPで標識され、塩基性電解質溶液中の異なる酸化銅含有量でのマイクロアーク酸化後のサンプルはTCP CuIおよびTCPCu IIで標識されました（表1）。

電界放出型走査電子顕微鏡（FE-SEM）を使用してサンプルの表面形態を観察し、エネルギー分散型分光法（EDS）を使用してコーティング表面の元素分布を観察し、表面粗さプロファイラーを使用してさまざまなサンプル。 X線回折（XRD）とX線光電子分光法（XPS）を使用して、コーティング相と化学状態の元素組成と微細構造を観察しました。

細胞培養

MC3T3-E1細胞（マウス頭蓋骨細胞から抽出）をinvitro細胞試験に使用しました。細胞を、5％CO ₂ 中37℃で10％ウシ胎児血清αを含むMEMでインキュベートしました。 。細胞が融合して80％の密度に成長したら、0.25％トリプシンで消化および継代しました。 3番目の継代は細胞実験に使用されました。

ライブ/デッド染色

各グループの細胞毒性は、生/死蛍光染色によって評価されました。細胞播種密度は1.5×10 ⁴ でした。 セル/ cm ² 。 3日間の培養後、サンプルを滅菌PBSでリンスし、生/死生存率/細胞毒性キットに従って処理しました。材料の細胞毒性は蛍光顕微鏡で観察されました。

細胞接着と増殖

細胞を各グループの表面に1.5×10 ⁴ の密度で接種しました。 セル/ cm ² 。 1時間、2時間、6時間インキュベートした後、細胞をPBSでリンスし、4％パラホルムアルデヒドで30分間固定しました。 PBSでリンスした後、光染色を避けるために40μLのDAPI染色剤をサンプルの表面に10分間滴下し、レーザー共焦点顕微鏡でサンプルを観察および画像化しました。

細胞の播種密度と培養方法は上記と同じで、細胞の増殖活性は細胞培養の1、3、10日後にCCK-8キットで測定しました。

骨形成分化に関連する遺伝子の発現

細胞接種密度および培養方法は上記と同じである。接種から1、3、10日後に細胞を収集し、リアルタイム定量PCRを使用して、骨形成分化関連遺伝子（ BMP を含む）のmRNAレベルを検出しました。 、COL-I、 ALP および OCN ）。標的遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子 GAPDH の発現レベルに正規化されました。 。プライマーセットを表2に示します。

動物と手術

動物実験は、Guizhou Provincial People'sHospitalのInstitutionalAnimal Care andUseCommitteeによって承認されました。体重3.6kg（3.2〜3.9 kg）のオスとメスの16匹の成体ウサギを、私立東呉大学の実験動物センターから購入し、実験群と対照群（それぞれ8匹）に分けました。静脈麻酔は、3％ペントバルビタールナトリウム（体重1キログラムあたり0.1 mL）を使用して実施しました。皮膚の準備後、皮膚を固定し、定期的に消毒しました。外側顆を露出させるために、外側大腿骨顆に縦切開を行った。外科用電気ドリルを使用して、直径2.7 mm、深さ6mmの穴を平らな面に開けました。 2組のチタンロッドを骨欠損部に移植し（実験群では左、対照群では右）、感染を防ぐために手術後3日間連続してペニシリンを投与しました。

マイクロCTアッセイ

手術後、ウサギは別々のケージに入れられ、自由に水を食べたり飲んだりした。術後4週間および8週間で、8匹のウサギを空気塞栓術により安楽死させた。実験群と対照群のチタンロッドを含むウサギの大腿顆を取り除き、サンプルサイズをトリミングし、サンプルをホルマリン固定し、マイクロCTスキャンを使用して3次元再構成を行いました。 Micro-CTソフトウェアを使用して関心領域（ROI）を設定し、関心領域の骨体積分率（骨量/総量、BV / TV％）を測定しました。

トルイジンブルーおよびフクシン-メチレンブルー染色による組織学的評価

サンプルをグラジエントアルコール（70％、80％、85％、90％、95％、100％、100％）で脱水しました。脱水されたサンプルは、メタクリル酸メチルで埋め込まれました。埋め込みが成功した後、サンプルをカットしてトリミングし、接着剤でスライサーに固定してカットし、最後にサンドペーパーで約20〜30μmのスライス厚に研磨しました。 （1）トルイジンブルー染色：スライスの表面にトルイジンブルー染料を添加し、水浴でスライスを染色した。表面染料を濾紙で乾燥し、すすぎ、空気中で自然乾燥させた。フィルムを密封し、光学顕微鏡で観察した。 （2）フクシン-メチレンブルー染色：方法はトルイジンブルー染色と同じでした。まず、染色用スライスの表面にメチレンブルー染色液を加え、風乾し、すすいだ。次に、スライスを染色用のフクシン染色液に浸し、空気中で自然乾燥させ、密封して観察しました。

統計分析

データは、SPSS16.0ソフトウェアによって決定された平均±標準偏差として表されます。一元配置分散分析とSNK検定を使用して、グループ間の差異を比較しました。 P <0.05は有意差を示します。

結果

サンプルの表面形態、相、および化学元素組成

図1は、さまざまなサンプルのSEM表面形態を示しています。 Tiグループと他のグループの形態は大きく異なります。 Tiグループは表面に穴がなく、表面は比較的平坦で、わずかな傷しか残っていません。 TCPグループは典型的なミクロアーク酸化表面形態を持ち、表面はさまざまなサイズのミクロポアで覆われています。これらの微細孔は互いに交差し、おおよその「三次元構造」を持っています。大小の細孔は互いに入れ子になっており、細孔には決まった規則はありません。形が不規則です。また、穴の隙間に焼け跡があります。 TCPグループの表面形態と同様に、TCP CuIおよびTCPCu IIグループの表面も不規則な形状の微細孔で覆われており、グループ間の表面形態に明らかな違いはありません。銅のドーピングは、ミクロポアの構造と形態に影響を与えません。

Ti、TCP、CP CuIおよびTCPCuIIの表面形態

図2は、ミクロポーラスCu–TiO ₂ のマッピングとEDS図を示しています。 コーティングEDSダイアグラムに見られるように、ミクロポーラスCu–TiO ₂ コーティングは、Cu、Ti、Ca、P、およびOで構成されています。Cu、Ca、およびPを含む溶液は、コーティングに完全に組み込まれています。さらに重要なことに、他の有毒で有害な要素は見つかりませんでした。ミクロポーラスCu–TiO ₂ のマッピング結果 コーティングは、銅、カルシウム、リンがコーティングに均一に分布していることを示しています。

Cu–TiO ₂ のマッピングとEDS図 コーティング（TCP Cu II）

図3は、Ti、TCP、TCP Cu I、およびTCP CuIIのXRDパターンを示しています。すべてのコーティングは主にTi、ルチル、アナターゼです。さらに重要なことに、CuOはミクロポーラスCu–TiO ₂ に現れました コーティング。これは、銅がCuOの形で存在することを示しています。

Ti、TCP、TCP CuI、TCPCuIIのXRDパターン

図4は、ミクロポーラスCu–TiO ₂ のXPS画像です。 コーティング。図3aは、ミクロポーラスCu–TiO ₂ の全スペクトルを示しています。 X線光電子分光法によって決定されたコーティング。これは、チタン、酸素、カルシウム、およびリンを除いて、EDSの結果と同様です。銅の特徴的なピークに加えて、銅の特徴的なピークもあります。 Ti2 p のピーク スペクトルはTiO ₂ に対応します 、およびCu2 p のピーク 932.7 eVは、CuOを示すと見なされます[17、18]。

ミクロポーラスCu-TiO ₂ のXPS画像 コーティング。 a XPSスペクトル、 b Ti2 p 、 c Cu2 p 、 d Ca2 p 、 e P2 p および f O1 s スペクトル

図5は、さまざまなサンプルの形状測定器の形態を示しています。 Tiサンプルを除いて、各グループのプロフィロメータの表面形態は類似しており、火山のような多段の細孔空洞構造を示しています。各グループの粗さRaをさらに分析すると、TCP、TCP CuI、およびTCPCuIIの粗さがTiの粗さよりも大きいことがわかりました。 TCP、TCP CuI、TCP CuIIの粗さは類似しており、違いは重要ではありません。これは、マイクロアーク酸化によってTiの粗さが増加することを示していますが、銅のドーピングはサンプルの粗さに影響しません。

さまざまなサンプルのプロフィロメーターの形態

細胞接着と増殖

図6aは、DAPIで染色してから1、2、6時間後の細胞付着画像を示しています。図6bは、さまざまな時間にさまざまなサンプルの表面に付着したMC3T3-E1細胞の数です。さまざまな時点でのさまざまなサンプルグループの付着細胞の数は、TCP Cu II> TCP Cu I> TCP> Tiの順序で並べられています。 TiおよびTCPグループと比較して、TCP CuIおよびTCPCuIIグループの付着細胞の数は大幅に増加しました。したがって、ミクロポーラスCu–TiO ₂ コーティングは細胞接着を大幅に促進することができます。

異なるサンプルの表面でのMC3T3-E1細胞の接着と増殖。 a DAPIで染色してから1、2、6時間後の細胞付着画像、 b 付着細胞と c の棒グラフ 細胞増殖の棒グラフ（データは平均±SD、 n として表されます =5。** p <グループTCPと比較して0.01）

図6cは、さまざまな時間におけるさまざまなサンプルの表面でのMC3T3-E1細胞の増殖を示しています。上記の細胞の接着傾向と同様に、TCP CuIおよびTCPCu IIグループの細胞増殖は、TiおよびTCPグループの細胞増殖よりも有意に高かった。ミクロポーラスCu–TiO ₂ の表面形態 コーティングと銅イオンが一緒になって細胞増殖を促進しました。

図7は、EdU染色の結果を示しています。 EdU陽性核の比率は、TCP CuII> TCP CuI> TCP> Tiの順でした。 Tiグループと比較して、TCPCuIIグループの細胞の増殖は大幅に異なっていました。

培養3日後に測定されたEdU染色（データは平均±SD、 n として表されます =5。** p <グループTCPと比較して0.01）

ライブ/デッド染色

細胞適合性は、インプラント材料の基本的な要件です。生/死蛍光染色は、材料の細胞毒性と生体適合性を評価できます。図8は、細胞をさまざまなサンプルの表面で3日間培養した後の、生/死細胞の染色結果を示しています。サンプルの各グループの表面にはわずかな死細胞（赤）しかなく、明らかな細胞毒性がないことを示しています。ミクロポーラスCu–TiO ₂ への銅のドーピング コーティングは明らかに細胞毒性を増加させることはなく、細胞との適合性も良好です。

さまざまなサンプルの表面での生/死細胞の染色（データは平均±SD、 n として表されます =5。** p <グループTCPと比較して0.01）

骨形成分化遺伝子の発現

図9は、骨形成分化遺伝子（ BMP ）のmRNA発現レベルを示しています。 、 OCN 、 ALP および COL-I ）異なる時点でのサンプルの各グループの表面セル。時間の経過とともに、サンプルの各グループの表面での骨形成分化遺伝子の発現は徐々に増加した。同時に、遺伝子の各グループの発現は次の傾向を示しました：TCP Cu II> TCP Cu I> TCP> Ti。 TiおよびTCPグループと比較して、TCP CuIおよびTCPCu IIで構成される骨関連分化遺伝子の発現が大幅に増強され、ミクロポーラスCu–TiO ₂ コーティングは骨形成分化を促進することができます。

BMP のmRNA発現 、 OCN 、 ALP および COL-I インキュベーションの1、3、および10日後（データは平均±SD、 n として表示されます =5. * p グループTCPと比較して<0.05、** p <グループTCPと比較して0.01）

全体的な観察とマイクロCT分析

図10は、大腿骨顆の肉眼的観察とマイクロCT再構成の結果を示しています。肉眼的観察では、2つのグループのインプラントは、4週間と8週間で大腿骨顆の真ん中にあり、良好な位置にあり、明らかな感染やインプラントの緩みはありませんでした。 Micro-CTの3次元再構成では、時間の経過とともに、2つのグループのサンプルの表面にある8週間の新しい骨組織が4週間のそれよりも大きく、異なる時点で新しい骨組織が表面に形成されたことが示されています。微孔性Cu–TiO ₂ コーティングされたチタンインプラントであり、その量は対照群よりも多かった。 2つのグループの骨体積分率を比較することにより、ミクロポーラスCu–TiO ₂ の骨体積分率（BV / TV） コーティングされたチタンは、ブランクの対照群よりも有意に高かった。ミクロポーラスCu–TiO ₂ コーティングされたチタンは、チタンインプラントのオッセオインテグレーションを促進することができます。

大腿骨顆の肉眼的観察とマイクロCT再建は、移植後4週間と8週間で観察されました

組織学的評価

図11は、トルイジンブルーおよびフクシン-メチレンブルー染色の結果を示しています。骨とインプラントの界面に繊維エンベロープは見られず、チタンインプラントが骨との界面に炎症反応を起こさなかったことを示しています。 2つのグループのチタンインプラントと骨の境界面のギャップに白いギャップが見られます。対照群の白いギャップの幅は、ミクロポーラスCu–TiO ₂ の幅よりも大きかった。 コーティングされたチタン。ギャップが広いほど、インプラントによる新しい骨組織の誘導は弱くなります。トルイジンブルー染色は、新しい骨であるインプラントと骨の境界面のギャップにある青いバンドを示しています。ミクロポーラスCu–TiO ₂ コーティングされたチタンは、対照群よりも骨組織が多く、ミクロポーラスCu–TiO ₂ コーティングは骨形成をより促進し、より優れた骨統合効果をもたらします。ミクロポーラスCu–TiO ₂ 周辺の骨基質 コーティングされたチタンはより厚く連続しており、骨組織は大幅に増加しました。対照的に、対照群は骨が少なかった。この結果は、ミクロポーラスCu–TiO ₂ コーティングされたチタンは、骨形成をより促進し、より優れた骨統合効果をもたらします。

移植後4週間および8週間での新しい骨形成のトルイジンブルーおよびフクシン-メチレンブルー染色

ディスカッション

金属チタンとその合金は、その優れた機械的特性と生体適合性により、歯科、形成外科、その他の分野で広く使用されています。ただし、インプラントとしてのチタンは、骨組織と受動的にしか結合できません。この組み合わせは、多くの場合、機械的な組み合わせであり、インプラントが緩んだり沈んだりして、インプラントの故障につながる傾向があります。現在、インプラント表面改質法は、主にオッセオインテグレーション能力を向上させるために使用されています[19]。理想的なインプラントの表面は、骨伝導性と骨誘導性の両方、良好な生体適合性を持ち、インプラントと骨組織の間のオッセオインテグレーションの形成を促進する必要があります[20]。この研究では、革新的なミクロポーラスCu–TiO ₂ を準備しました。 チタンの生物学的活性と生体適合性を改善し、現在の臨床応用におけるチタンインプラントの欠点を克服することを期待して、チタンの表面にコーティングします。

銅イオンと二酸化チタンは優れた生物活性を持っていることが証明されています[21]。この研究では、ミクロポーラスCu–TiO ₂ チタン表面のマイクロアーク酸化によって調製されたコーティングは、コーティングとチタン基板の間の緊密な結合の最大の利点を示しました。これは、文献[22]で確認されています。マイクロアーク酸化コーティングの良好な結合力は、形成プロセスと密接に関連しています。マイクロアーク酸化の過程で、化学的酸化、電気化学的酸化、プラズマ酸化が共存します。アーク放電によって発生する瞬間的な高温高圧の作用下で、チタン表面は、主に基板酸化物である「成長」様式で基板の表面上に成長する。セラミックコーティング、コーティング、および基板の犬歯は千鳥状になっており、優れた接着力を備えています[23]。

生物学的材料の表面特性は、材料の生物学的特性に直接影響します。マイクロアーク酸化コーティングは、電子顕微鏡下で粗くて多孔質の表面形態を示します。形態は主に、互いに浸透するさまざまなサイズの微細孔で構成されています。これらの小さな細孔はマイクロアーク酸化の過程で形成され、金属表面は高電圧下で破壊され、マイクロアークゾーンでの瞬間高温焼結はチタンマトリックスを直接酸化して焼結し、結晶性セラミック相構造を持つセラミック膜にします、絶縁破壊が発生する場所。電子顕微鏡で観察した微細孔が形成されます。これらの粗くて多孔質の構造は、組織細胞の付着面積を増やすだけでなく、これらの相互貫入する微細孔は、骨組織を孔に成長させ、細胞の接着と伸長を促進することができる三次元足場構造と同等です。パンら。 [24]準備されたマイクロ/ナノ階層構造のTiO ₂ マイクロアーク酸化による研磨チタン上のコーティングは、コーティングがMG63セルの接着と伸長に有利であることを発見しました。張ら。 [25] Si–TiO ₂ を準備しました マイクロアーク酸化によるコーティング、およびさらなる研究により、このシリコン含有TiO ₂ へのMC3T3-E1細胞の接着が示された コーティングは、Siを含まないTiO ₂ よりも大幅に高かった。 コーティングと純粋なTi。

マイクロアーク酸化コーティングの最大の利点は、電解質溶液中のイオンがマイクロアーク酸化プロセス中にコーティングに導入される可能性があることです。この研究では、コーティング表面のEDS分析結果は、ミクロポーラスCu–TiO ₂ コーティングは主にCu、Ca、P、O、Ti元素で構成されており、チタンはマトリックスに由来し、カルシウムとリンは塩基性電解質溶液に由来し、電解質中の銅イオンは形成とともにコーティングに堆積します。セラミックフィルムの。インプラントの表面にあるカルシウムとリンの成分は、材料の表面特性を改善するだけでなく、骨の形成を誘発することもできます。カルシウムとリンに加えて、ミクロポーラスCu–TiO ₂ の銅イオン コーティングは、優れた生体適合性と生物学的活性を持っています。インプラントの表面に銅をドープしたコーティングも文献で報告されています。 Astasov-Frauenhoffer etal。 [26]火花支援陽極酸化法によりTi上に銅を堆積させ、細菌細胞の生存率が強く阻害されることを確認しました。 Zong etal。 [27]陽極酸化とマグネトロンスパッタリングを組み合わせて銅をTiO ₂ に結合 ナノチューブと銅（Cu）をTiO ₂ に準備します NTA（Cu–Ti–O NTA）、およびさらなる研究により、Cu–Ti–ONTAは優れた長期抗菌能力と良好な血管新生活性を持っていることが示されました。

生体適合性は、インプラントを測定するための最小要件であり、インプラントの安全性の基本的な保証でもあります。この研究では、生物学的に活性な銅がマイクロアーク酸化によってチタンインプラントの表面に導入されました。ただし、重金属イオンとしての銅イオンには潜在的な毒性があります。したがって、ミクロポーラスCu–TiO ₂ コーティングは細胞毒性があります。この研究では、生/死細胞染色を使用して、ミクロポーラスCu–TiO ₂ を評価しました。 コーティング。結果は、ミクロポーラスCu–TiO ₂ の表面に明らかな細胞毒性を示さなかった チタン表面にコーティングされており、良好なセル適合性が観察されました。この発見は、コーティングの銅含有量が少ないことに関連しているのではないかと推測しています。 Huang etal。 [28] Ti上にさまざまな量の銅（Cu; Cu I、II、III、およびIVグループに対してそれぞれ0.01、0.1、1、および10 mM）を組み込んだギャップブリッジキトサン-ゼラチンナノコンポジットコーティングを製造し、骨髄間質細胞の活動は、CuIVグループを除いてCuドープコーティングで損なわれませんでした。

細胞接着と増殖は、後の段階でのインプラントのオッセオインテグレーションの基礎です。インプラントの表面に付着して増殖する細胞が多いほど、インプラントと骨の界面のオッセオインテグレーションの効果が高くなります。この研究の結果は、材料表面に接種した初日、各グループのサンプルの表面への細胞接着量が異なり、ミクロポーラスCu–TiO 2 コーティンググループが大幅に増加しました。サンプル表面に付着した細胞の数は徐々に増加しましたが、ミクロポーラスCu–TiO ₂ でグループに付着した細胞の数 コーティングは他の2つのグループよりも大幅に大きかった。差は統計的に有意であり、ミクロポーラスCu–TiO ₂ コーティングは銅イオンでドープされました。多孔質で粗い表面は、細胞接着を最も助長します。細胞接着と同様に、材料の各グループの表面での細胞増殖も同様の結果を示しました。私たちの調査結果は以前の報告[29]と同様です。

接着と増殖に加えて、材料の表面での細胞分化の程度は、インプラントのオッセオインテグレーションの性能をさらに反映する可能性があります。骨形成分化マーカー遺伝子 ALP 、 BMP 、 RUNX2 、 OCN および COL-I 細胞分化を反映することができます。この研究では、時間が経つにつれて、 BMP、OCN、ALP の表現が および COL-I サンプルの各グループの表面で増加しましたが、ミクロポーラスCu–TiO ₂ の発現 コーティング群は対照群よりも有意に高かった。この発見は、銅イオンによる骨形成分化の促進と密接に関連しています。 Komarova etal。 [30] Ti上でのマイクロアーク酸化によってZnおよびCu含有CaPベースのコーティングを調製し、コーティング中の少量のCuおよびZnが、ヒト脂肪由来の多能性間葉系間質細胞の高い運動性およびその後の骨芽細胞への分化能力を促進することを示した。

オッセオインテグレーションは、インプラントの成功または失敗の鍵です。これは、インプラントと骨組織の間に線維組織がないことを意味します。インプラントと骨組織の間には直接接触があり、インプラントと骨組織の間の関係を実現するために直接応力に耐えることができ、機能的な接続を確立します。整形外科インプラントと骨組織の間のオッセオインテグレーションは、インプラントの初期安定性とインプラント材料の機械的特性、インプラント表面特性、生体適合性、生物学的活性、周囲の骨組織の状態など、多くの要因の影響を受けます[31]。 。

理想的なインプラントの位置と安定した生体力学的環境は、インプラントと骨の界面のオッセオインテグレーションの前提条件と基礎です。この研究では、大腿顆での豊富な血液供給と十分な骨量がインプラントに良好な解剖学的基礎と比較的安定した機械的環境を提供できるため、銅ドープミクロポーラスコーティングを移植するために大腿顆を選択しました。さらに、大腿骨顆は主に海綿骨です。インプラント後、骨の形成とインプラントと骨の界面のオッセオインテグレーションの効果をより直感的に評価できます。

マイクロCTは現在、インプラントの骨形成性能を観察するための一般的な方法であり、インプラントと骨組織の間の骨統合を評価するための効果的な方法でもあります。骨の微細構造は、新しい骨組織の関連するパラメータを取得するために、関連するソフトウェアの助けを借りて、3次元再構成と関心領域（ROI）分析によって視覚化されます。すべてのパラメーターの中で、BV / TVは骨形成の総量を表し、インプラントのオッセオインテグレーションを反映する重要な指標です。この研究では、検出指標としてBV / TVを選択しました。移植から4週間後、ミクロポーラスCu–TiO ₂ のBV / TV コーティング群は対照群よりも高かった。移植から8週間後、ミクロポーラスCu–TiO ₂ のBV / TV値 コーティング群と対照群は4週間の群よりも高く、ミクロポーラスCu–TiO ₂ のBV / TV コーティング群は対照群よりも高かった。マイクロCT検出に基づいて、硬組織スライスを介してインプラント周囲の骨組織の組織学的観察と定量分析を行いました。 VG染色の結果は、ミクロポーラスCu–TiO ₂ コーティング群は対照群よりも多くの新しい骨を形成し、その周りに形成された新しい骨は、線維性組織の浸潤なしに内部インプラントと直接接触していた。これらの結果は、ミクロポーラスCu–TiO ₂ チタン表面のコーティングは、チタンインプラントのオッセオインテグレーションを促進する可能性があります。この発見は、以前のinvitro研究と同様です。マイクロアーク酸化によって生成された粗い多孔質構造は、正常な骨組織のマイクロ/ナノ構造を模倣しています。さらに重要なことに、生物学的に活性な銅イオンは骨組織の再生を促進します。これらの一般的な要因の作用の下で、インプラントの表面の骨組織の再生が促進されます。私たちの研究結果は、文献の報告と一致しています。ミラノ他[32]は、マグネトロンスパッタリングによってTi–6Al–4 V合金（TC4）上に堆積された多機能Cu / aC：H薄いコーティングを設計し、コーティング組成物が血管新生と骨形成を刺激し、宿主の応答を制御し、それによって成功率を高めることができることを発見しましたインプラントの。

結論

要約すると、ミクロポーラスCu–TiO ₂ を準備しました。 マイクロアーク酸化によるチタン表面のコーティング。コーティングの表面は、異なるサイズの細孔と相互接続された細孔を備えた多孔質構造を持っています。コーティングはTiの表面粗さを増加させ、銅はコーティングの表面に均一に分布します。インビトロ研究は、コーティングが明らかな細胞毒性を持たず、MC3T3-E1細胞の接着、増殖および分化を促進できることを明らかにした。インビボ実験はさらに、コーティングが新しい骨組織の形成を誘発し、チタンインプラント-骨界面でのオッセオインテグレーションを促進できることを確認した。 invivoおよびinvitroでの生物活性を考慮すると、ミクロポーラスCu–TiO ₂ チタンインプラントの表面へのコーティングは、整形外科における潜在的な臨床応用価値があります。

データと資料の可用性

該当なし。

略語

MAO：

マイクロアーク酸化

Cu：

銅

Zn：

亜鉛

Cu–TiO ₂ コーティング：

銅-二酸化チタンコーティング

ROI：

関心領域

ALP：

アルカリホスファターゼ