過酸化水素の選択的検出のためのデュアルモードナノセンサーとしてのカーボンナノドット
要約
過酸化水素（H 2 O 2 ）は、グルコース/グルコースオキシダーゼ（GOD）反応などのオキシダーゼベースの酵素反応の重要な生成物です。したがって、生成されたH 2 のプロービング O 2 さまざまな炭水化物とそのオキシダーゼの検出を達成するために非常に重要です。ここでは、H 2 の選択的検出のための蛍光および比色出力の両方を備えた新しいデュアルモードナノセンサーとして機能できる1種類のデュアルエミッションカーボンナノドット（CD）を報告します。 O 2 。デュアルモデルナノセンサーは、装飾されていないデュアルエミッションCDによってのみ確立され、さまざまな濃度のH 2 を追加すると、蛍光および比色の大幅な変化が観察されます。 O 2 CDソリューションでは、H 2 の肉眼検出の達成に役立ちます。 O 2 。ナノセンサーのメカニズムは、H 2 からのヒドロキシルラジカルのような外部の化学的刺激が原因である可能性があります。 O 2 CDの放出と吸収を支配するCDの表面特性と凝集の変化をもたらします。構築されたデュアルモードナノセンサーは、H 2 に対して優れた生体適合性と高い選択性を示します O 2 0.05〜0.5 Mの線形検出範囲で、H 2 の検出を可能にします O 2 最小14mM。
背景
蛍光カーボンナノドット（CD）は、優れた生体適合性、低毒性、調整可能なフォトルミネッセンス（PL）、高量子収率などの独自の物理化学的特性により、広範な研究の注目を集めています。上記の特徴により、CDは、バイオイメージング、バイオセンサー、発光デバイスなど、さまざまな分野での潜在的な用途が見出されています[1,2,3,4,5,6,7,8,9]。さらに、アップコンバージョンおよびダウンコンバージョン能力、光学的点滅の欠如、および有機色素または半導体量子ドット（QD）と比較した高い光安定性により、CDは蛍光増加または消光による蛍光ナノセンサーでのアプリケーションにより適しています[10 、11、12、13、14、15、16、17、18、19]。
過酸化水素（H 2 O 2 ）は一般的な酸化剤の一種であり、滅菌能力のための医療消毒剤として常に使用されています。その上、H 2 O 2 グルコース/グルコースオキシダーゼ（GOD）反応などのオキシダーゼベースの酵素反応の重要な生成物でもあります。したがって、H 2 のプロービングによるセンシング戦略 O 2 炭水化物とそのオキシダーゼを検出するための有望なアプローチとして使用できます。このため、H 2 の検知 O 2 糖尿病などの炭水化物代謝に関する病気を監視するために使用される場合があります。現在、H 2 の測定に基づくさまざまなグルコースセンサーが O 2 さまざまな分析方法を使用して開発されており、以前に報告されたセンサーシステムは、主に導電率測定、蛍光測定、または比色変化などの単一信号に基づいています[20、21、22]。最近、ナノテクノロジーの進歩、特に半導体量子ドットのような蛍光ナノ粒子や新しい炭素ベースのナノ粒子は、新しいH 2 をもたらしました。 O 2 ナノセンサー。 Lu etal。 H 2 の生成を監視することにより、グルコースのレシオメトリック蛍光センシングのためにCdTe QDとローダミンを組み合わせることにより、1種類のデュアルエミッションマイクロハイブリッド（DEMB）を開発しました。 O 2 [20]。張ら。 H 2 に対して選択的かつ高感度の応答を示した蛍光ナノセンサーを報告しました O 2 CDの蛍光消光を介して[21、22]。しかし、これらの作業は必然的に、高価な化学成分と重金属汚染を伴う半導体ベースの量子ドットの固有の欠陥をもたらしました。さらに、単一信号の読み取りに基づくナノセンサーは、蛍光消光または色の変化のいずれかであり、環境要因の変動および実験操作エラーのために、アッセイの安定性が低い可能性があります。上記の考察から、H 2 の濃度の変化に非常に敏感な蛍光と溶液の色を持つ新しいクラスの蛍光CDを開発したいと考えています。 O 2 。したがって、これらのCDに基づくデュアルモードナノセンサーは、H 2 を明確かつ高感度に検知するために実現できます。 O 2 CD溶液の蛍光光度と測色の変化を同時に検査することにより、H 2 の肉眼検出の実現に役立ちます。 O 2 。
この研究では、可視光下で暗赤色の溶液色を示し、365 nm UVランプ下で二重蛍光発光（青と緑の蛍光発光）を示す、新しいタイプのCDを合成するための簡単で便利な方法を開発しました。 CDは、クエン酸、尿素、および N を使用したソルボサーマル法によって簡単に合成されます。 、 N -炭素源、窒素源、および反応溶媒としてそれぞれジメチルホルムアミド（DMF）。蛍光と溶液の色は、H 2 の濃度の変化に非常に敏感です。 O 2 。したがって、これらのCDに基づくデュアルモードナノセンサーは、H 2 を明確かつ高感度に検知するために実現できます。 O 2 CDソリューションの蛍光光度と測色の変化を同時に検査することにより、H 2 の肉眼検出の実現に役立ちます。 O 2 。高価な機器を導入することなく、これらのCDに基づくデュアルモードナノセンサーが確立されました。この検知システムは、潜在的な動作エラーを効果的に回避し、測定の信頼性を大幅に向上させることができます。さらに、CDベースのナノセンサーは、優れた生体適合性と高い水溶性により、invivoとinvitroの両方で血糖検出のアプリケーションに有望です。
メソッド
CDの合成
CDは、炭素源としてクエン酸、窒素源として尿素、共反応物としてDMFを使用したソルボサーマル法を使用して調製しました。典型的な実験では、クエン酸（1 g）と尿素（2 g）を10 mLDMFに溶解しました。次に、溶液を25 mLのポリ（テトラフルオロエチレン）で裏打ちしたオートクレーブに移し、160°Cで4時間加熱しました。反応後、オートクレーブを自然に室温まで冷却した。暗赤色の溶液が得られた。 CDは、5mLの反応溶液を25mLの豊富なエタノールに加えて沈殿させ、7500rpmで30分間遠心分離しました。次に、沈殿物を透析して純粋なCDを得た。準備したままのCDを収集し、真空乾燥オーブンで60°C、1Pa未満で12時間乾燥させました。次に、CDを脱イオン水に再溶解して0.75 mg mL -1 を形成しました。 さらなる研究のためのCDソリューション。そしてそれに続くH 2 O 2 処理されたCDを収集し、同じ方法で乾燥させて、表面の形態と構造特性を特性評価しました。
測定値
CDの表面形態は、高分解能透過型電子顕微鏡（HRTEM、JEOL JSM-IT100）によって特徴づけられました。 CDの構造特性は、X線回折計（XRD、PA National X’Pert Pro）およびマイクロラマン分光計（Renishaw RM 2000）によって実行されました。 CDの吸収スペクトルは、Hitachi U-3900UV-Vis-NIR分光光度計で測定しました。 CDの蛍光スペクトルは分光光度計（HitachiF-7000）で測定した。 CDの蛍光量子収率は、キャリブレーションされた積分球を備えたHoribaFL-322分光計によって得られました。 CDの蛍光減衰曲線は、それぞれ450nmと500nmでの発光を監視する405nmNanoLEDを使用してHoribaFL-322によっても測定されました。 CDのフーリエ変換赤外スペクトル（FTIR）は、Bio-Rad Excalibur分光計（Bruker Vector 22）で記録されました。 X線光電子分光法（XPS）は、Mgを励起源として使用してESCALAB MK IIX線光電子分光計で記録されました。
CDナノセンサーの確立
H 2 の検出用 O 2 、H 2 の存在下でのCDの蛍光および吸収スペクトル O 2 PBSバッファー（pH =7.4、25°C）で調べました。典型的な実験では、異なる量のH 2 O 2 最初に蒸留水と混合し、次に20 µL 0.75 mg mL -1 CD溶液を4mL H 2 に注入しました O 2 さまざまな濃度（0、0.05、0.1、0.15、0.25、0.5、1.0、および2.0 M）の溶液。次に、CDをH 2 に追加した後、写真、蛍光、および吸収スペクトルを取得しました。 O 2 ソリューション。
CDベースのナノセンサーの選択性も評価されました。 CD溶液（20μL、3.75μgmL -1 ）をさまざまな種類の陽イオンおよび酸化剤（4 mL、0.1 M）と混合し、溶液を1分間振とうしました。最後に、CDをH 2 に追加した後、溶液のUV-Vis吸収および蛍光スペクトルを記録しました。 O 2 ソリューション。
結果と考察
CDの特性評価
調製されたままのCDの形態は、透過型電子顕微鏡（TEM）によって測定された。図1aに示すように、CDは、2.5〜6.5 nmの均一なサイズ範囲と約5nmの平均直径で十分に分散しています（追加ファイル1：図S1b）。さらに、HRTEM画像（図1aの挿入図）は、グラファイトの（100）と一致する0.21nm付近の回折縞を示しています。図1bに示すCDのXRDパターンは、約23.4°にブロードなピークを示します。これは、グラファイトのような炭素構造を持つ高度に無秩序な炭素原子に対応しています。 CDのラマンスペクトル（図1c）は、2つのバンドを示しています。Dバンド（約1347 cm -1 、これはsp 3 の振動によるものでした -不完全性と無秩序を伴う混成炭素）およびGバンド（約1577 cm -1 、E 2g に関連付けられていました sp 2 の振動モード -二次元の六角形の結晶構造の混成炭素）。 CDのFTIRスペクトル（図1d）は、3100〜3600 cm -1 でO–H / N–Hの幅広い振動吸収帯を示します。 、1690〜1610 cm -1 付近でのC =O / C =Cの伸縮振動 約1350〜1390 cm -1 でのN–Oの伸縮振動 。上記のデータは、CDの表面にいくつかの官能基が存在する可能性があり、これらの官能基が水溶液中のCDの高い親水性と安定性に重要な役割を果たす可能性があることを示しています。
a CDのTEM画像。 インセット CDのHRTEM画像を表示します。 b CDのXRDパターン。 c CDのラマン分光法。 d CDのFTIR分光法。 e 0.5 M H 2 を追加した後のCDの蛍光変化 O 2 。 インセット 前のCDの写真を表示する（左 ）および後（右 ）H 2 を追加する O 2 紫外線の下で。 f 0.5 M H 2 を追加した後のCDの比色変化 O 2 。 インセット 前のCDの写真を表示する（左 ）および後（右 ）H 2 を追加する O 2 日光の下で
H 2 に対するCDベースのナノセンサーの蛍光挙動 O 2 図1eに示すCD水溶液で測定されました。 365 nmでの単一波長励起下で、CDソリューションは非対称発光スペクトルを示します。これは、それぞれ青と緑の蛍光バンドに対応する、450nmと500nmを中心とする二重発光蛍光バンドに適合させることができます。 CDソリューションがH 2 と混合されている場合 O 2 、青色のバンドの強度は、緑色のバンドの強度よりも大幅に減少しています。したがって、CDの最も強い発光は、H 2 を追加した後のCDの励起-発光マトリックスの結果から、450nmから500nmにシフトします。 O 2 （追加ファイル1：図S2）。その結果、CDソリューションの蛍光色は365 nmのUVランプ照明の下で青から緑に変化します（図1eの挿入図）。さらに、CDソリューションでは、H 2 を追加した後、同時に濃い赤から緑への測色変化が発生します。 O 2 （図1fの挿入図）。この色の変化は、H 2 の添加によって引き起こされた555および595nm付近の吸収帯の強度の変化に起因する可能性があります。 O 2 CDソリューションで（図1f）。まとめると、これらの結果は、CDがH 2 の検出用のデュアルモードナノセンサーとして使用できることを確認しています。 O 2 。
センシングメカニズム
センシングメカニズム、H 2 を追加した後のCDの形態と蛍光特性を調査する O 2 も特徴づけられました。追加ファイル1：図S1aおよびS1cに示されているように、H 2 の追加 O 2 CDソリューションに組み込むと、サイズが30〜60nmの範囲のCDが集約される可能性があります。 H 2 O 2 CDの誘導凝集は、正規化された吸収スペクトルでも明らかになりました（追加ファイル1：図S3）。つまり、CDの吸収帯は可視領域で555nmから595nmに赤シフトします[15]。これに対応して、CD溶液の色は濃い赤から緑に変化し、CDの分散状態が凝集状態に変わります。 H 2 を追加する前後のCDのXRDスペクトル（図1bおよび追加ファイル1：図S4） O 2 CDの結晶構造に変化がないことを示す、ほとんど変化しません。
H 2 を添加した調製済みCDの蛍光進化 O 2 蛍光スペクトルによって調査された。励起-発光行列は、H 2 の追加が O 2 CDの発光中心を450nmから500nmに変更します（追加ファイル1：図S2）。図2aに示す450nmと500nmの発光を持つCDの蛍光減衰曲線は、平均寿命がそれぞれ7.96nsと7.12ns（365 nmの励起下）の単指数関数的減衰関数にうまく適合できます。対照的に、H 2 後のCDの蛍光減衰寿命 O 2 処理は4.53および4.83nsになりました（図2bおよび表1）。一方、PL量子収率（η int ）H 2 の場合、CDの5.5％から4.6％に変更されました O 2 CDソリューションに追加されました。蛍光寿命とPL量子収率の変化を考慮すると、CDとH 2 の間で電荷移動（CT）が発生する可能性があると結論付けることができます。 O 2 、これはCDのPLスペクトルを変更するトリガーになる可能性があります。
a 、 b 前のCDの蛍光減衰（ a ）およびその後（ b ）0.5 M H 2 を追加します O 2 。 c 、 d 前のCDのXPS（N1s）（ c ）およびその後（ d ）0.5 M H 2 を追加します O 2
CDのFTIRおよびXPSスペクトルを測定して、H 2 によって引き起こされる化学組成と環境変化についての洞察を得ました。 O 2 。 H 2 を追加する前後のCDのFTIRスペクトル O 2 追加ファイル1に示されています。図S7は、約1350〜1390 cm -1 でのN–Oの伸縮振動を示しています。 H 2 を追加すると増加します O 2 、これはXPSスペクトルの結果によっても確認されます。完全な調査XPSスペクトル（追加ファイル1：図S8）から、H 2 の前後のCDのO対N比が観察されます。 O 2 治療はそれぞれ1.57と3.85でした。 O / Nの比率が増加すると、CD内のNの結合状態がH 2 の追加によって変化する可能性があることがわかります。 O 2 、これは、図2c、dに示されている高解像度のN1sXPSスペクトルと一致しています。 N1s XPSスペクトルの結果から、CD内のグラファイトNの含有量は、H 2 の追加により増加しています。 O 2 。さらに、H 2 を追加した後、N1sスペクトルの407.3 eVにN–O状態の追加のピークがあります。 O 2 、これは明らかにH 2 のインポートを示しています O 2 CDの表面状態の変化をもたらします。すべての調査は、H 2 を追加することで表面のNフレームを変更できることを示しています。 O 2。
以前の報告では、CDの発光バンドはNドープラジカルや尿素基などの表面状態に関連していることが示唆されています[5、9、12、23、24、25]。一方、これらの表面状態は、外部の物理的または化学的刺激に敏感です。光物理的および表面環境分析に基づいて、H 2 の導入による蛍光進化のメカニズムを提案します。 O 2 （図3）。調製されたままのCDのエッジ状態は、共役ピロリックN基で構成されています。このタイプのN状態は、ほとんどが高エネルギーレベルに局在している可能性があります。したがって、励起された電子は非放射的に高レベルの表面N状態に緩和し、その後、450nm付近の蛍光発光バンドを伴って基底状態に放射的に移動する可能性があります。対照的に、CD溶液の蛍光強度は、H 2 間の動的消光のためにわずかに減少します。 O 2 CDとH 2 の間でCTが発生するCD O 2 以前のレポート[26、27、28、29]と同様です。そうでなければ、H 2 からのヒドロキシルラジカルの影響により、高エネルギーの蛍光ラジカル（関連するN状態）が低エネルギーのN–O状態に変換されると推定できます。 O 2 。そのため、励起された電子は、低エネルギーのN–O状態から基底状態への放射遷移でほとんど緩和され、500 nmに緑色の発光バンドが生じます。これにより、450nmの蛍光が静的に消光されます。したがって、CDの主要な発光バンドは、青色の発光から緑色の発光への変化を示す可能性があります。
前（左）のCDの可能な検知メカニズム ）および後（右 ）H 2 を追加する O 2
CDナノセンサーの評価
CDの上記の蛍光および比色挙動に基づいて、H 2 を検出するためのナノセンサーを開発しました。 O 2 CDによって。提案されているセンシングシステムは、水溶液中の適切な濃度（3.75μgmL -1 ）のCDで構成されています。 、追加ファイル1：図S9）、このシステムでは、CDが比色レポーターと蛍光レポーターの両方として機能します。
CDソリューションに基づいて提案されたナノセンシングシステムを図4に示します。H 2 によって引き起こされる蛍光および比色の変化 O 2 肉眼ではっきりと視覚化できます（図4c、f）。ここでは、UV光と日光の照明の下で、青から緑、濃い赤から緑への一連の顕著な色の変化を観察できます。その上、H 2 の追加 O 2 CD溶液への変換は、蛍光および吸収スペクトルを使用して定量的に表すこともできます（図4a、d）。図4aに示すように、450nmと500nmを中心とする蛍光バンドは、H 2 の増加とともに徐々に減少します。 O 2 0から2Mまでの濃度。ただし、H 2 の増加 O 2 濃度は、450 nmでの蛍光強度の異なる減少につながります（ I 450 ）および500 nm（ I 500 ）、これはCD溶液の蛍光色の変化とよく一致します（図4c）。したがって、H 2 を監視するために、450nmでの蛍光強度に対する500nmでの蛍光強度の比率が選択されます。 O 2 濃度（図4a、b）。低い比率は青色の発光に関連し、緑色の蛍光は高い比率の I で肉眼で観察できます。 500 私へ 450 。これらの手段による線形検出範囲は、線形相関 R で0.05〜0.5Mに及びます。 2 =0.987。同様に、555nmと595nmでの吸収帯の不均一な減少により、CDソリューションで比色変化が発生します。図4dに示すように、吸収強度は可視領域で減少しますが、H 2 が増加します。 O 2 濃度が高くなると、595nm付近の吸収は555nm付近よりもゆっくりと減少します。したがって、595 nmでの吸光度の比率（ A 595 ）555 nm（ A 555 ）H 2 の測定にも使用できます O 2 集中。 A の比率 595 A へ 555 指数関数的に0.05から2Mに増加し、指数相関 R 2 =0.999、そして比色変化はH 2 とよく相関します O 2 濃度範囲は0.05〜0.25 Mで、線形検出限界（LOD）は14 mMです（追加ファイル1：図S11および表S1）。デュアルモードナノセンサーは、H 2 の濃度により、臨床的および医学的要件を満たすこのメソッドの適切な感度を備えています。 O 2 血漿中の約ミリモル（〜10 mM）の範囲のGOD反応を介して[20]。さらに、デュアルモードナノセンサーには固有のキャリブレーションリファレンスが組み込まれているため、強度の変動やその他の外部から発生する要因を排除でき、テスト精度の向上に貢献します。
a 異なるH 2 の存在下でのCDの蛍光スペクトル O 2 濃度。 b I の検量線 500 / 私 450 CDの数とH 2 O 2 集中。 インセット I の線形検出範囲を表示します 500 / 私 450 CDの数とH 2 O 2 集中。 c さまざまな濃度のH 2 下での蛍光CD溶液の写真画像 O 2 。 d 異なるH 2 の存在下でのCDのUV-Visスペクトル O 2 濃度。 e A の検量線 595 / A 555 CDの数とH 2 O 2 集中。 f さまざまな濃度のH 2 でのCD溶液の写真画像 O 2
H 2 に対するナノセンサーの選択性を評価するには O 2 、干渉アッセイは、Na + などのいくつかの一般的な陽イオンを使用して同じ条件下で実行されました 、K + 、NH 4+ 、Ca 2+ 、Zn 2+ 、およびFe 2+ 。図5a、bに示すように、CDの蛍光および比色の変化は、さまざまな陽イオンの存在下で調査されています。 Na + の存在下 、K + 、NH 4 + 、Ca 2+ 、Zn 2+ 、およびFe 2+ 、 I の蛍光比 500 私へ 450 と A の吸収率 595 A へ 555 ブランクサンプルと比較してわずかな変動としてのみ表示されます。つまり、これらの陽イオンはH 2 の検出にほとんど干渉しません。 O 2 。さらに、CDへの影響をHNO 3 などの他の酸化剤と比較しました。 、KClO 3 、FeCl 3 、NaClO、K 2 Cr 2 O 7 、およびKMnO 4 （図5c、dおよび追加ファイル1：図S12およびS13）、K 2 を除くこれらの酸化剤を添加すると、蛍光色が青から緑に変化することがわかりました。 Cr 2 O 7 およびKMnO 4 。したがって、K 2 からの干渉を除外できます。 Cr 2 O 7 およびKMnO 4 蛍光変化を通して。さらに、HNO 3 のような他の酸化剤からの影響を簡単に排除できます。 、KClO 3 、FeCl 3 、および A の吸収率の結果からのNaClO 595 A へ 555 。したがって、この論文で実証されたデュアルモードナノセンサーは、2つの独立した検出方法の相乗効果により、測定の高い選択性において非常に有望である可能性があります[30、31、32、33]。さらに、H 2 を添加したときの蛍光変化の応答時間を測定しました。 O 2 そして、H 2 を注入した後に蛍光が減少することを発見しました O 2 約3.3秒で安定します（追加ファイル1：図S14）。
a 、 c 蛍光比 I 500 / 私 450 CDとさまざまな干渉カチオンを含む溶液の分析（ a ）および酸化剤（ c ）。 b 、 d 吸収率 A 595 / A 555 CDとさまざまな干渉カチオンを含む溶液の分析（ b ）および酸化剤（ d ）
CDの細胞毒性を評価するための標準的なCCK-8アッセイを使用して、A549細胞の生存率を調べました。図6に示すように、500μgmL -1 のような高濃度のCDでも、A549細胞をCDと48時間インキュベートすると、80％近くの生存率が得られることがわかります。 。 CDの50％阻害濃度（IC50）は約1106μgmL -1 であると計算されます。 GraphPad Prism 5.0によると、CDは生体適合性が高く、高濃度での細胞毒性が非常に低いと推定されます。さらに、以前に報告されたH 2 のナノセンサーの分析性能を比較しました。 O 2 追加ファイル1：表S2に示されている決定。検出の生体適合性、単純さ、および視覚化は、これらの報告されたH 2 のほとんどに匹敵するか、それよりも優れています。 O 2 アッセイ。 CDベースのデュアルモードナノセンサーがH 2 に対して優れた選択性を持っていることを考えると O 2 検出、血糖と同じオーダーの適切な検出限界（LOD =14 mM）、および高濃度のCDでの細胞毒性が非常に低いナノセンサーは、血糖およびその他の臨床要件のテストでの使用が期待されています。
異なる濃度のCDで48時間培養した後のA549細胞の細胞生存率
結論
結論として、H 2 の定量的検出のために、測色出力と蛍光出力の両方を備えたCDに基づくデュアルモードナノセンサーを提案します。 O 2 H 2 の導入時のCD溶液の蛍光および比色変化に基づく O 2 。ナノセンサーは、H 2 の肉眼検出を実現するためのシンプルで簡単です。 O 2 。ナノセンサーのメカニズムは、H 2 からのヒドロキシルラジカルのような外部の化学的刺激が原因である可能性があります。 O 2 CDの放出と吸収を支配するCDの表面特性と凝集の変化をもたらします。提案されたナノセンサーは、優れた生体適合性、H 2 に対する高い選択性を示します O 2 線形検出範囲は0.05〜0.5 Mで、検出限界は約14 mMで、これはH 2 のレベルに相当します。 O 2 神の反応によって生成されます。この論文で報告された戦略は、血糖値の新しいセンサーを開発するための有望なアプローチを提供する可能性があると考えられています。これは、病気の診断や環境検査に役立つ可能性があります。
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