Fe(III)-ヘミン修飾SBA-15：染料分解、薬物送達、H₂O₂検出のための先進触媒

概要

ポルフィリン鉄分子（ヘミン）がSBA-15のチャネル状メソポーラスシリカ上にグラフト化（FeIX-SBA-15）され、結合ヘミン分子が酸化反応触媒酵素模倣として機能しました。H₂O₂存在下で、調製FeIX-SBA-15コンポジットは工業用染料Orange IIを効果的に分解し、テトラメチルベンジジン塩酸塩（TMB）を溶液中と膜上で触媒し、比色H₂O₂検出を達成しました。さらに、ヘミングラフトコンポジットは抗がん剤ドキソルビシン塩酸塩（DOX）の高含有量ロードを示し、リアルタイム細胞解析で監視された持続放出挙動を示し、DOX/SBA-15と比較してがん細胞増殖抑制効果が向上しました。ヘミン修飾メソポーラスシリカナノコンポジットは、有望な医療応用を持つ統合ナノプラットフォームを提供します。

はじめに

過酷環境条件下での変性感受性など天然酵素の欠点克服のため、グラフェン酸化物、ヘミン、金属ナノ粒子など高安定性酵素模倣開発に多大な努力が投資されてきました[1, 2]。これら人工酵素の中で、ヘミンはヘムタンパク質ファミリーの活性中心であり、よく知られた天然メタロポルフィリンです[3]。触媒として、メタロポルフィリン錯体は多環芳香族炭化水素（PAHs）やアゾ染料など環境汚染物質酸化を効果的に触媒し、基質分子を機能性含酸素有機化合物に変換または無害化合物に分解します[4,5,6]。しかしながら、ヘミン触媒活性は酸化的自己分解、非活性ジマー生成分子凝集、水性緩衝液中低溶解性で損なわれる可能性があります[7]。高比表面積固体担体へのヘミン固定化は、実用使用時の不満足な活性損失を最小限に抑えながら高触媒性能達成のための経済的かつ効率的戦略を提供します。

外表面と内表面への構造適応可能性により[8]、メタロポルフィリンを含む様々なタイプのメソポーラスシリカナノ材料（MSNs）が多様応用で注目されています。例えば、Huangらは顕著ペルオキシダーゼ様活性持つヘミンベースメソポーラスシリカナノリアクターを報告[9]。Barbosaらは炭化水素酸化用再利用可能生物模倣触媒としてメタロポルフィリン固定化Fe₃O₄@SiO₂メソポーラスサブミクロスフィアを開発[10]。非常に最近、Sunらはトロンビン検出のためのデュアルアプタマー生物認識とヘミンカプセル化メソポーラスシリカベース新規ケミルミネッセンスセンサーを報告[11]。様々なMSNsの中で、SBA-15（Santa Barbara Amorphous-15）は六方最密充填細孔構造と化学グラフト機能分子に適した3-10nm調整可能細孔サイズを示します[8, 12]。シリコン材料として、SBA-15は低生物学的毒性を持ち、SBA-15表面の大量不安定Si-OH基が他機能分子グラフト化に使用され、SBA-15に更多機能性を付与できます[13]。SBA-15が酵素固定化、抗体ロード、薬物送達キャリアとして使用可能と報告されています[14,15,16]。

DOXは広範囲がん第一選択治療効果的化学療法抗生物質ですが、臨床での副作用は深刻な問題です[17]。治療効率改善とDOX全身毒性低減のため、分子設計と様々な薬物送達システム処方開発に多大な努力が払われてきました。メソポーラスMCM-41（Mobil Composition of Matter No. 41）が2001年に薬物キャリアとして初めて使用されて以来[18]、SBA-15を含むMSNsは固有細孔構造により薬物ロードと放出に望ましいため有利特徴を持ちます[19, 20]。しかしながら、MSNs上の複雑化学修飾が実用応用を制限する可能性があります。

本研究では、ヘミンをSBA-15上にグラフト化しコンポジット材料（FeIX-SBA-15）を構築しました（スキーム1）。これによりヘミン酵素様活性保持だけでなく、リアルタイム細胞解析装置（RTCA）技術[21,22,23]で培養がん細胞増殖曲線で反映されるように、ドキソルビシン塩酸塩（DOX）効率的カプセル化と持続放出達成しました。特筆すべきは、DOX/FeIX-SBA-15で比較的高DOX含有量ロードが得られ、これは以前のフェロセンカルボン酸修飾SBA-15（FCA-SBA-15）使用研究[24]と比較しても高く、担体内グラフトFeIXとDOX間の洗練されたπ-πスタッキングによる可能性があります。さらに、FeIX-SBA-15固体形が市販フィルタ膜上に固定化されたことで、効果的染料分解と過酸化水素比色検出のためのフロー触媒フォーマットを開発しました。

抗がん剤DOXロードのためのFeIXグラフト化SBA-15

材料と方法

材料

全試薬は分析級（A.R.）で、さらなる精製なしで使用しました。三ブロックコポリマーPluronic P123（EO₂₀PO₂₀EO₂₀、MW=5800）をSigma-Aldrich（ドイツ）から購入。3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）、テトラエチルオルトシリケート（TEOS）、アシッドオレンジII、テトラメチルベンジジン塩酸塩を上海アラジン生物技術有限公司（中国）から入手。ヘミンとドキソルビシン塩酸塩を上海マックリン生化学有限公司（中国）から購入。トリプシン-EDTA溶液を北京バイオタイムバイオテクノロジー有限公司（中国）から入手。細胞培養培地（RPMI-1640）をGEヘルスケアライフサイエンス有限公司（中国）から。胎児牛血清（FBS）をGibco有限公司（米国）から。ペニシリンとストレプトマイシンをサーモフィッシャーサイエンティフィック有限公司から。A549細胞株を米国型培養コレクション（ATCC）から入手。

薬物ロード用SBA-15化学グラフト化

SBA-15は先行報告[12]に従って調製しました。その後、0.40g SBA-15を80°Cで140mlメチルベンジルに分散し、APTES（1.2ml）を添加。さらに8時間攪拌し、5000rpm、5分遠心分離で分離。エタノールと水で洗浄後、得られたAPTES-SBA-15を80°Cで乾燥。ヘミン（0.15g）をまず30ml DMSOに分散し、APTES-SBA-15（0.60g）添加後、70°Cでさらに7時間攪拌。生成物を遠心分離、洗浄、最終的に乾燥し、FeIX-SBA-15としました。

FeIXがSBA-15上に成功裏にグラフト化されたと検証後、FeIX-SBA-15（0.50g）をDOX·HCl（2mg/ml）含む20ml脱イオン水に懸濁し、37°Cで24時間攪拌してDOXロード。その後、生成物を5000rpm、5分遠心分離。洗浄、乾燥、粉砕後、最終生成物回収（DOX/FeIX-SBA-15）。

キャラクタリゼーション

試料形態的特徴を走査型電子顕微鏡（SEM、Hitachi SU-1510）でエネルギー分散型分光法（EDS）X線検出器を用いて15kV加速電圧で調査。調製材料の小角X線回折（SAXRD）パターンをCu Kα放射線（λ=0.154nm）で2θ=0.2°-8°範囲でSmartlab TM 9KW X線回折計で測定。X線蛍光（XRF）分析をX線蛍光分光計（Thermo Scientific、米国）で測定。窒素吸着等温線を相対圧力範囲P/P₀=0.01-0.99で体積吸着分析装置（BELSORP-MINI、日本）で測定。比表面積と細孔径分布をそれぞれBrunauer-Emmett-Teller（BET）とBarrett-Joyner-Halenda（BJH）法で計算。固体UV-visスペクトルを固体UV-vis分光光度計（Thermo Scientific、米国）で記録。試料吸収スペクトルを紫外可視分光光度計（UV-vis 7300、中国）で測定し、以下式でDOX薬物含有量（DLC）計算：DLC（wt.%）=（ロード薬物重量/（メソポーラス材料とロード薬物総重量））×100%。DOX/FeIX-SBA-15鉄含有量を誘導結合プラズマ発光分光計（ICP、PE Optima 2000DV、米国）で測定。分析前、DOX/FeIX-SBA-15をフッ化水素酸で完全溶解、フッ化水素酸揮発後、濃硝酸で再溶解。

FeIX-SBA-15触媒活性と分解挙動

FeIX酵素様活性を利用し、H₂O₂存在下でTMB触媒反応と酸性オレンジII分解挙動をモデル反応として調査[29]。20mM NaOHと1.5mM Triton X-100含有混合溶液調製後、PB溶液で4倍希釈しFeIX-SBA-15溶解用としました。TMB触媒反応では、FeIX-SBA-15（600μg/ml）500μlとH₂O₂（2mM）500μlを基質として混合し、TMB（500μl、3mg/ml）分解用としました。スペクトル測定を特定時間間隔で実施し反応度評価。合成コンポジット分解挙動研究のため、FeIX-SBA-15（600μg/ml）溶液500μlと10mM H₂O₂溶液500μl混合物を基質としました。次に、オレンジII（0.25mM）500μlを上記溶液に添加。吸光度測定を485nmで記録。

さらに、コンポジットを市販フィルタ膜上に固定化し、フロー触媒方式で酸性オレンジII分解を実施。FeIX-SBA-15（600μg/ml）懸濁液5mlを市販フィルタ（0.22μm、Millipore）通過させ、材料をフィルタトラップし室温乾燥。オレンジII（0.25mM）溶液500μl、H₂O₂（10mM）500μl、H₂O 500μl混合物をFeIX-SBA-15ロード市販フィルタ膜通過。混合物スペクトル測定を記録。

H₂O₂比色検出

溶液中H₂O₂検出では、FeIX-SBA-15（600μg/ml）500μlとTMB（3mg/ml）500μl混合物調製。次に、様々濃度（25-500μM）H₂O₂ 500μlを上記溶液に添加し、30°Cで10分間インキュベート。最後に、651nmでスペクトル測定記録。

同時に、コンポジット固定化市販フィルタ膜上でのH₂O₂測定もフロー触媒方式で実施。修飾膜は上記方法で取得。次に、H₂O₂（0.293〜8.8mM）500μl、TMB（2mg/ml）500μl、H₂O 500μl混合物を修飾市販フィルタ膜個別に通過、混合物スペクトル測定を651nmで記録。

吸光度をH₂O₂濃度に対してプロットし、検出限界（LOD）を式：LOD=3RSD/傾斜で評価。（RSD：相対標準偏差）。

細胞培養とRTCA検出

ヒト非小細胞肺がん細胞A549を、10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン溶液含むRPMI-1640培地で、5% CO₂、37°Cインキュベーターで培養（Thermo Scientific）。リアルタイム細胞解析装置（RTCA）技術（xCELLigenceシステム、ACEA Biosciences Inc.）とCell Counting Kit-8（CCK-8、DOJINDO研究所）法で材料細胞毒性評価。RTCA検出では、ウェルあたり5000-8000細胞をE-プレート播種。細胞インキュベーションと増殖をアナライザーでリアルタイム監視、信号変化を細胞指数（CI）と定義される任意単位で表現。細胞をFeIX-SBA-15とDOX/FeIX-SBA-15、濃度12.6μg/mlで曝露。DOX濃度は0.50μg/ml。さらに、DOX/FeIX-SBA-15 IC₅₀取得のため、1.6-50.4μg/ml異なる用量DOX/FeIX-SBA-15処理細胞を検出。また、エンドポイント法としてCCK-8キットアッセイで材料細胞毒性検出。CCK-8試薬を細胞と2時間インキュベート、吸光度をマイクロプレートリーダーで450nm波長測定。

結果と考察

材料キャラクタリゼーション

DOX/FeIX-SBA-15コンポジットはスキーム1示すように合成されました。APTES-SBA-15はまずアミノ化反応[13]で調製。次に、FeIX分子がメソポア内カルボキシル基とアミノ基間アミド反応と静電相互作用でAPTES-SBA-15表面にグラフト化。最後に、抗がん剤DOXがFeIX-SBA-15コンポジットにロードされ、FeIX共役平面大環式分子[25]とDOXアントラサイクリンクロモフォア[24]間強い分子相互作用π-πスタッキングが関与。

コンポジット表面微細構造をSEM評価。図1a示すように、SBA-15は0.4-1μmサイズ一定均一性チューブ構造形成し、グラフトFeIXとDOX分子は明らかな形態変化なし。TEM画像（図S1）でDOX/FeIX-SBA-15とSBA-15比較、化学修飾後メソ構造保持検証。DOX/FeIX-SBA-15化学組成をX線蛍光分光法で推定。表S1示すように、Si、O、C、Fe、微量他吸収元素がDOX/FeIX-SBA-15で検出。FeIX-SBA-15比較で、DOX/FeIX-SBA-15計算原子% Si（〜24.3%）とFe（〜2.5%）わずかに低下、C量（11.3%）相対的高くDOX成功カプセル化示唆。表面成分さらに評価のため固体UV-visスペクトル記録。図S2示すように、FeIX分子類似でFeIX-SBA-15は250-350nm、450-550nm、600-700nm吸収帯表示、SBA-15は実質的観察帯なし[26]。比較で、DOX/FeIX-SBA-15はDOX由来450-550nm広吸収帯示す。

a SBA-15とDOX/FeIX-SBA-15SEM画像。 b 材料小角X線回折パターン。窒素吸着等温線（c）と細孔径（d）： I SBA-15、 II DOX/SBA-15、 III FeIX-SBA-15、 IV DOX/FeIX-SBA-15

コンポジット小角X線回折分析実施。図1b示すように、SBA-15 SAXRDパターンは0.94°メイン回折ピークと、1.6°と1.8°観察可能2ピーク表示、それぞれ(100)、(110)、(200)結晶面反映、明確メソ構造指摘[27]。SBA-15比較で、DOX/SBA-15 SAXRDパターンはピーク強度減少表示、DOXロードが細孔構造損傷なし示す。しかし、SBA-15へのFeIXグラフト化で(110)と(200)結晶面ピーク強度減少と大角側ピークシフト観察、材料メソ構造規則性部分的損失示唆[28]。特筆すべきは、FeIX-SBA-15へのDOXさらなるロードで(110)と(200)結晶面消失。

試料メソ構造パラメータ取得のため窒素吸着等温線記録。図1C示すように、全試料が高相対圧力で鋭い毛細管凝縮ステップ持つ典型IV型等温線表示、化学修飾後メソ構造保持示す[24]。図1Dと表S2示すように、SBA-15 〜6nm比較で、FeIX/DOX結合後細孔径減少観察、SAXRD結果裏付け。DOX/SBA-15とDOX/FeIX-SBA-15 DOX含有量はそれぞれ1.14%と4.27%計算。結果、FeIXグラフトSBA-15がメソポア内DOXロード能力向上、DOX/SBA-15比〜3.7倍、以前研究DOX/FCA-SBA-15比〜1.6倍[24]。薬物分子ロード能力向上はFeIXとDOX間洗練分子相互作用に帰属可能。

メソポア上グラフトヘミン触媒活性と分解挙動

FeIX-SBA-15触媒活性を、H₂O₂存在下TMBモデル反応で評価[29]。図2a示すように、アッセイ溶液（TMB+H₂O₂+FeIX-SBA-15）吸光度強度が触媒反応時間とともに増加。対応して溶液が青色変化し、時間経過とともに濃くなる（図2b）。しかし、H₂O₂またはFeIX-SBA-15いずれか欠如時反応起こらず、FeIX-SBA-15ペルオキシダーゼ活性示す。一方、図S3A示すように、FeIX-SBA-15はH₂O₂存在下でオレンジII分解可能、UV-vis吸光度で3時間反応時間内監視。

a FeIX-SBA-15とTMB、H₂O₂混合UV-vis吸光度変化。 b TMB、H₂O₂、FeIX-SBA-15含有溶液経時写真。溶液中H₂O₂線形較正プロット（c）とFeIX-SBA-15修飾膜上（d）

ヘミングラフトメソポーラスコンポジット固体形利用し、FeIX-SBA-15固定化市販フィルタ膜ベースフロー触媒フォーマットを有機変換でテスト[30, 31]。図S3B示すように、H₂O₂とオレンジII混合物が修飾膜通過時、SBA-15のみコントロール膜（図S3C）比較で溶液吸光度強度同時減少、再利用後FeIX-SBA-15固定化膜高触媒活性示し、廃水染料分解応用可能[32, 33]。

さらに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ比較で、ヘミン含有コンポジットが十分安定性により広pH範囲で顕著触媒活性示し、酸性溶液含む比較的過酷条件下でも実用重要性[29, 34]。

H₂O₂比色検出

FeIX-SBA-15 TMB触媒反応モデルベースで、溶液中H₂O₂定量分析比色戦略確立、較正プロット図2c示す。H₂O₂濃度範囲25-500μM、検出限界（LOD）2.1μM。

順次、FeIX-SBA-15修飾市販膜直接ろ過による様々濃度H₂O₂簡易発色検出も開発。図2d示すように、線形検出範囲0.293-8.80mM推定、検出限界0.067mM。以前報告との分析パラメータ比較を表1にまとめ、反応条件（触媒濃度、pH、アッセイ温度）関連検出性能示唆[35]。提案法が以前報告上回らなかったが、広較正濃度範囲での分析性能が発色法と比較可能。

細胞毒性アッセイとDOXロードコンプレックス細胞影響動的監視

図3示すように、A549細胞へのサンプル増殖抑制効果をCCK-8キットでまず評価、測定24時間半阻害濃度（IC₅₀)を表S3要約。150μg/ml SBA-15処理細胞が依然80%以上細胞生存率保持、材料低細胞毒性反映。DOX/FeIX-SBA-15 IC₅₀（12.6μg/ml）はDOX/SBA-15（58.8μg/ml）比〜4倍低く、FeIX-SBA-15（35.4μg/ml）比〜3倍低く、FeIX SBA-15グラフト化がDOXロード効率的で細胞毒性効果改善示唆。

SBA-15、FeIX-SBA-15、DOX、DOX/SBA-15、DOX/FeIX-SBA-15それぞれインキュベートA549細胞生存率

異なるコンポジット処理A549細胞成長状態がRTCA監視で持続薬物放出示す（図4a、b）。RTCAはラベルフリーインピーダンス検出原理ベースで細胞生理状態反映[41]。図4a示すように、テスト用量でDOX処理細胞細胞指数値最初増加後急速減少、DNA損傷プロセス関与で正規化細胞指数（NCI）値急減観察[42]。FeIX-SBA-15（12.6μg/ml）とDOX/FeIX-SBA-15（12.6μg/ml）NCI値はコントロールより低いが、インキュベーション時間とともに増加観察。FeIX-SBA-15比較で、DOX/FeIX-SBA-15処理細胞NCI値処理最初数時間増加。しかし、薬物送達持続放出挙動とDOX/FeIX-SBA-15メソポアから放出DOX有効濃度蓄積が大半細胞殺傷十分でないため、DOX/FeIX-SBA-15処理A549細胞増殖は比較的安定した抑制状態示し、FeIX-SBA-15処理細胞細胞指数値以降プロセスで著しく増加。CCK-8でIC₅₀濃度12.6μg/mlで、DOX/FeIX-SBA-15 NCI値24時間でコントロール群50%以上高い値。したがって、DOX/FeIX-SBA-15細胞多用量効果記録（図4B）、記録NCIからRTCAソフトウェアで用量反応曲線導出（図4c、d）。DOX/FeIX-SBA-15処理細胞IC₅₀値15.0（24時間）決定、CCK-8テストと一致。48時間インキュベーション後、IC₅₀計算値6.7（48時間）μg/ml。

異なる材料処理A549細胞増殖（a）と（b）DOX/FeIX-SBA-15異なる濃度（a-f: 1.6、3.2、6.3、12.6、25.2、50.4μg/ml）用量反応曲線（c、d）。図a&b黒線は材料添加時点示唆

結論

本研究では、ヘミン分子をSBA-15上にグラフト化し多用途化に成功。構築FeIX-SBA-15は抗がん剤ロード望ましく、H₂O₂存在下でTMB触媒と酸性オレンジII分解を溶液中と膜上で効果的実施。TMB触媒モデル反応ベースで、H₂O₂定量分析比色戦略確立。さらに、FeIXグラフトSBA-15は比較的高DOX含有量ロード有利で、DOX/SBA-15比較でがん細胞増殖抑制効果改善。一方、DOX/FeIX-SBA-15 A549細胞毒性をRTCAで動的監視、メソポアからDOX薬物分子持続放出挙動明確示唆。この基盤で、薬物送達システムはDOX細胞毒性低減したが、腫瘍細胞増殖抑制に依然効果的。総括すると、我々が作製した固体触媒と薬物送達システムとしてのヘミングラフトメソポーラスシリカナノコンポジットは、莫大な医療潜在力持つ汎用ナノプラットフォーム提供可能。