表面修飾固体ナノポアによる過酸化水素検出の高感度化

概要

分子検出には多くの技術がありますが、溶液中の固体ナノポアを用いた検出は、有望で高スループット・低コストな技術の一つです。本研究では、過酸化水素（H₂O₂）検出のための固体ナノポアプラットフォームを作製しました。H₂O₂はラベルフリー生成物であると同時に、酸化還元反応の重要な参加者でもあります。集束Gaイオンビームで直径約50 nmの窒化シリコン（Si₃N₄）ナノポアを作製し、カルボジイミドカップリング化学によりナノポア内面をホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）で修飾しました。固定化HRP酵素は単一ナノポアチャネル内で酸化還元反応を誘起する能力を持ちます。さらに、リアルタイムで単一凝集ABTS^•+分子トランスロケーションイベントを監視・調査。設計された固体ナノポアバイオセンサーは可逆的で、H₂O₂を複数回検出可能です。

背景

ナノポア検出技術はコルターカウンター[1]と細胞イオンチャネル[2]に起源を持ちます。ナノポアは溶液中を通過する帯電分子を検出します。ナノポア内への分子出現はポアコンダクタンスを明確に変化させ、電流信号の変化として現れます。電流変化からポア内分子のサイズと濃度情報が得られ、分子トランスロケーション動力学プロセスが明らかになります[3]。ナノスケール物体として、ナノ粒子[4,5,6]、ウイルス[7,8,9]、タンパク質分子[10,11,12,13]、DNA配列[14,15,16,17]などが検出可能です。ナノポアは生物ナノポアと固体ナノポアの2タイプです。生物ナノポアは信号対雑音比（SNR）が低く、分解能が高いです。小さな未折りたたみタンパク質は生物ナノポアで検出可能[18,19,20,21,22,23]。固体ナノポアはサイズ調整可能で安定性が高いです。固体ナノポアは通常薄膜に穿孔され、この膜が流体セルを2つに分割します[24]。ナノポアを含む薄膜にバイアス電圧を印加し、一方のセルから他方へイオン電流を流します[25]。折りたたみ・未折りたたみ両構造のタンパク質分子が固体ナノポアで検出・解析可能[26,27,28,29]。タンパク質相互作用も固体ナノポアで検出可能[30, 31]。さらにタンパク質動力学検出能も有します[32, 33]。検出範囲の限界解決のため、化学修飾固体ナノポアが広く適用されています[34,35,36,37,38,39]。化学修飾固体ナノポアは一本鎖DNA[40]とタンパク質[41]検出に適用されています。

H₂O₂定量法は多数存在し、大半は分光光度法[42,43,44,45]、化学発光[46,47,48,49]、アンペロメトリー[50,51,52,53]、電気化学[54,55,56,57]ベースです。従来の分光光度法と化学発光法は一般に時間とコストがかかります。固体ナノポアセンサーは低消費・シンプル構造で小分子検出に適しています。

ここでは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）で修飾されたタイプの固体ナノポアを提示します。HRPが固体ナノポア内面に固定化され、H₂O₂存在下で単一ナノポアチャネル内で酸化還元反応において活性を保持します[58]。酸化還元反応で生成したABTS^•+が凝集し、凝集ABTS^•+がナノポアを通過。トランスロケーションイベントを検出可能です。過酸化水素検出では、固体ナノポア構造がシンプルで、低試薬消費で凝集ABTS^•+を検出可能。このHRP酵素修飾固体ナノポアは、凝集ABTS^•+検出を通じてH₂O₂センシングを間接的に達成。単一分子検出と固体ナノポア内分子アセンブリへの指示的意義を持ちます。

手法

化学薬品と材料

ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）分子（1 mg/mL、酵素委員会番号1.11.1.7、44 kDa）を西亜試薬（中国成都）から購入。サンプル（HRP）を0.02 µmろ過済み0.1 M PBSに溶解、4 ℃保存、調製後2日以内に使用。塩化カリウム（KCl）、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド（EDC）、N-ヒドロキシサクシニミド（NHS）、2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)（ABTS、98%）を迪博化学技術有限公司（中国上海）から購入。過酸化水素（H₂O₂、30%）をシンファーム化学試薬有限公司から購入。(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン（3-APTES）をシグマアルドリッチ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入。実験はミリQ水精製システム（抵抗率18.2 MΩ/cm、25 ℃、ミリポア社、米国マサチューセッツ州ビレリカ）からの超純水を用い、0.02 µmろ過、FEI Strata 201 FIBシステム（FEI社、米国オレゴン州ヒルズボロ）、ゼータサイザー（マルバーンZetasizer Nano ZS）、アクソパッチ700B（モレキュラーデバイス社、米国カリフォルニア州サニーベール）で実施。使用機器写真を補足資料に追加（Additional file 1: Figure S1参照）。

固体ナノポア作製と電気測定

まず、厚さ300 µmのSi基板上にSi₃N₄薄膜（100 nm厚）を堆積。フォトリソグラフィ（開口窓サイズ500×500 µm²）に続く。次に、膜表面をFEI Strata 201 FIBシステム（FEI社、米国オレゴン州ヒルズボロ）で30 kV加速電位、1 pA電流でGa⁺イオン照射。ミリング時間はスポットモードで1.5秒。最後に固体ナノポアチップを得て、80 ℃で30分間新調ピラニア溶液洗浄、超純水すすぎ。洗浄後、チップを2つのバイトンOリングでカスタム製テフロンセルに組み立て、チップ両面を分離し、イオン電流の唯一の経路としてナノポアを持つ2つの貯液槽を形成。使用装置写真を補足資料に追加（Additional file 1: Figure S2参照）。電極（Ag/AgCl）を流体セルとパッチクランプアンプ（Axopatch 700B、モレキュラーデバイス社、米国カリフォルニア州サニーベール）に接続し、定電圧下でイオン電流を測定可能にし、信号は100 kHzサンプリングレート。アンプ内部ローパス8極ベッセルフィルターを10 kHzに設定[3]。全装置を二重ファラデーケージ内に配置。

結果と考察

ナノポアへのHRP固定化

直径~50 nmの選択ナノポアを80 ℃で30分間ピラニア溶液浸漬。ピラニア溶液処理後、ナノポア内面がシリコン水酸基を取り込み可能に。続いて薄膜全体を(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン（3-APTES）で活性化。3-APTES処理結果、膜表面にアミノ（-NH₂）基が生成。

3-APTES活性化後、ナノポアチップをN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド（EDC、10 mM）とN-ヒドロキシサクシニミド（NHS、20 mM）の0.1 M PBS溶液に導入。その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP、10 ng/ml）にナノポアチップを導入。先行研究[3]によれば、0.1–2 M KCl、pH 7.0の異なる塩濃度でHRPは凝集しない。ホースラディッシュペルオキシダーゼのpI値が4.3±0.2であることから、0.1 M KCl pH 6.0とpH 7.0でもHRP非凝集を確認。EDC試薬がHRPのカルボキシル（-COOH）基を高反応性o-アシルイソウレア中間体へ活性化。さらに、NHS存在下で中間体がより安定なスクシンイミドアミン反応性エステルへ変換[58]。結果、ナノポアチップ内面に生成した（-NH₂）と中間体が共有結合し、安定アミド結合形成（図1）。

単一固体ナノポアチャネルでの修飾プロセス実行。a カルボジイミドカップリング化学によるホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）の単一ナノポアチャネルへの共有結合模式図。HRPのカルボキシル（-COOH）基がEDC溶液で活性化され、ナノポアチップ表面生成（-NH₂）と反応可能に。b 固定化HRP過酸化水素センサースキーム、センサー内面がHRPで修飾。H₂O₂とABTS存在時、ABTS^•+生成。HRP結晶構造は著者許可で使用[3]

これらプロセスにより、単一ナノポア内面へのHRP固定化へ至ります。機能化プロセス実現は、修飾前後の単一ナノポア電流-電圧（I-V）測定で確認（図2）。

0.1 M KCl、0.1 M PBSでpH 7.0緩衝の非修飾（オリジナル）と修飾ナノポアの典型的電流-電圧（I-V）曲線。黒線は非修飾ナノポアI-V曲線、赤線はHRP修飾ナノポアI-V曲線。インセットは単一ナノポア（直径~50 nm cis）とナノポアセンサーのSEM。100 nmスケール

HRP修飾固体ナノポアのキャラクタリゼーション

単一Si₃N₄ナノポアチャネル形状は円筒形。図2に0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0での非修飾と修飾ナノポアの典型的I-V曲線を示します。HRP酵素でナノポア内面修飾後、ポアサイズが小さくなりました。

Wanunuらによれば、ナノポア外部コンダクタンス考慮により、固体ナノポア直径は以下式で計算可能：

$$ d=\left(1+\sqrt{1+\frac{16\sigma l}{\pi G}}\right) G/2\sigma $$ (1)

ここで、dとlはポア直径と長さ、Gは開口ポアコンダクタンス、σはイオン溶液伝導度。

幾何学的効果考慮後、HRP酵素で固体ナノポア修飾後の実効サイズ計算可能。式(1)ベースで単一ナノポア直径計算。非修飾固体ナノポアI-V曲線からコンダクタンス（G_unmodified）~15 nS取得。イオン溶液0.1 M KCl（25 ℃）、0.1 M PBSでpH 7.0緩衝の伝導度（σ）~1.28 S/m。したがって非修飾ナノポア直径~51 nm、測定直径と類似。同方法で修飾ナノポアのコンダクタンス（G_modified）~7.5 nS取得、修飾ナノポア直径（~34 nm）計算可能。直径減少は2理由：第一に(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン（3-APTES）でナノポア内面処理し、表面が（-NH₂）アミノ基取り込み。第二にHRP酵素の流体動力学的直径（D_h）~8 nm[3]、固定化HRPがポア直径減少させる可能性。ここでは直径~34 nmのHRP修飾固体ナノポアを過酸化水素検出チャネルとして使用。

酸化還元反応の原理

酸化還元反応は単一修飾ナノポア内で実施、以下提示反応プロセスは提案酸化還元反応[58]とよく一致。H₂O₂（0.5 mM）存在下、ナノポア内面固定化HRP酵素が即座に化合物1へ変換。次に化合物1が還元基質分子ABTS（1.5 mM）から1電子受け取り化合物2生成。その後化合物2が別の基質分子ABTSから1電子移動で安静酵素へ還元。

酸化還元反応の陽イオン生成物（ABTS^•+）が単一ナノポア内に蓄積。ナノポアチャネルからの蓄積分子トランスロケーションはコンダクタンス（G）変化をもたらし、電流変化（ΔI_b）が検出可能。

$$ \mathrm{HRP}\left({\mathrm{Fe}}^{3+}\right)\mathrm{Porp} + {\mathrm{H}}_2{\mathrm{O}}_2\to \mathrm{HRP}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right){\mathrm{Porp}}^{\cdotp +}\left(\mathrm{Compound}\ 1\right) + {\mathrm{H}}_2\mathrm{O} $$

$$ \mathrm{HRP}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right){\mathrm{Porp}}^{\cdotp +} + \mathrm{ABTS}\to \mathrm{HRP}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right)\mathrm{Porp}\left(\mathrm{Compound}\ 2\right) + {\mathrm{ABTS}}^{\cdotp +} $$

$$ \mathrm{HRP}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right)\mathrm{Porp} + \mathrm{ABTS}\to \mathrm{HRP}\left({\mathrm{Fe}}^{3+}\right)\mathrm{Porp} + {\mathrm{ABTS}}^{\cdotp +} + {\mathrm{H}}_2\mathrm{O} $$

トランスロケーションイベント検出

修飾ポア直径（~34 nm）のHRP修飾ナノポアで、0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0を用いて実験。2,2'-アジノビス-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホネート)（ABTS）（1.5 mM）と過酸化水素（H₂O₂）（0.5 mM）をナノポアトランスコンパートメントに添加。ABTSとH₂O₂添加後、-100から-800 mVバイアス電圧で実験、100 kHzサンプリング。-400 mVまで電圧上昇までトランスロケーションイベントなし。図3に-400から-800 mV異なる電圧でのトランスロケーションイベント代表的イオン電流トレースを示す。長時間トランスロケーションイベント実験データを補足資料に追加（Additional file 1: Figure S3参照）。

a–e -400から-800 mV異なる電圧でのトランスロケーションイベント模式図。印加電圧-400 mVから-800 mV増加に伴いトランスロケーションイベント頻度増加。f 電流振幅が電圧に線形増加。h 指数関数的減衰関数（t_d ~ e^−v/v0）でドウェルタイムの電圧依存性をフィット

0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0でミリ秒電流ブロッケードイベント観測。トランスコンパートメントへH₂O₂とABTS添加、単一ナノポアチャネル内面固定化HRP酵素、酸化還元反応発生。大量ABTS^•+分子生成、単一小分子ABTS^•+はシステム分解能[3]で検出困難だが、生成後凝集するためABTS^•+分子検出可能。ここでは負電圧保持、凝集ABTS^•+分子がナノポア通過。負電圧印加時、電気泳動と電気浸透流発生。HRPは0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0で負帯電[3]、結果二重電気層形成、電気浸透は負電極方向。このため電気泳動と電気浸透が同方向。単一ナノポアチャネル内凝集ABTS^•+が固体ナノポア通過、負電極方向へ流動。

トランスロケーションイベント統計解析

バイアス電圧が凝集ABTS^•+トランスロケーションに鍵役割果たすため、HRP修飾ナノポア通過凝集ABTS^•+電流ブロッケードの印加電圧依存性を議論。トランスロケーションイベント発生頻度は電圧増加とともに大幅改善（図3f）。電圧増加で電流振幅も増加。しかし、バイアス電圧-300 mV以下維持でトランスロケーションイベント徐々に消失、HRP修飾ナノポア通過凝集ABTS^•+に-300 mV閾値電圧必要示唆。図4に異なる電圧での凝集ABTS^•+測定平均電流振幅ヒストグラム示す。フィッティング曲線ベースで、電流ブロッケード（ΔI_b）ピーク値は-400、-500、-600、-700、-800 mVでそれぞれ308.4±27.795 pA、419.1±20.354 pA、478.8±32.857 pA、528.1±36.98 pA、606.9±40.916 pA。電流振幅値を一次多項式関数でフィット、傾き-0.706、切片49.262。一方フィッティング曲線ベースでドウェルタイム値は-400、-500、-600、-700、-800 mVでそれぞれ54.5±21.374 ms、42.8±20.181 ms、10.3±3.05 ms、6.0±1.744 ms、4.0±1.441 ms。図3hに指数関数的減衰関数（t_d ~ e^−v/v0）でドウェルタイムの印加電圧依存性フィット示す。トランスロケーションイベントドウェルタイムヒストグラムを補足資料追加（Additional file 1: Figure S4参照）。

0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0で異なる電圧（-400、-500、-600、-700、-800 mV）での凝集ABTS^•+測定平均電流振幅ヒストグラム。全ヒストグラムをガウシアン分布でフィット

各電圧での単一トランスロケーションイベント解析し、電流ブロッケードは同サイズ・同電荷物質により誘起。したがって全トランスロケーションイベントが単一凝集ABTS^•+によるものと判断。実験での凝集ABTS^•+トランスロケーション時間解析のため、電流ブロッケード持続時間t_dを、生成場所からナノポア出口までの単一凝集ABTS^•+ドウェルタイムと見なす。ここで別条件考慮：ナノポア入口にHRP酵素固定化されており、酸化還元反応触媒可能性。したがって、酸化還元反応が単一ナノポア内面でなく入口で発生するか検証実験実施。HRP非修飾ナノポア適用解析。これらナノポアを3-APTESで活性化。同濃度HRP（10 ng/ml）、ABTS（1.5 mM）、H₂O₂（0.5 mM）をナノポアトランスコンパートメントに添加、0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0で負バイアス電圧印加、電気泳動力でHRPはナノポア通過不能。酸化還元反応で凝集ABTS^•+生成するが、トランスロケーションイベントなし。凝集ABTS^•+がHRPと静電効果生じ、ナノポア通過阻害可能性。

図6に各電圧での凝集ABTS^•+コンダクタンス変化（ΔG）対イベントドウェルタイム2次元散布図示す。コンダクタンス変化（ΔG）主に0.8 nSに集中。トランスロケーションイベント形状ほぼ同一。ΔG平均値は異なる電圧で~0.8 nS。全凝集ABTS^•+体積排除がほぼ同一と推測。凝集ABTS^•+分子の静電・立体効果がイオン電流変化可能性。解析後、正帯電凝集ABTS^•+トランスロケーションで2典型電流トレース形状観測（図7）。-700 mV代表例。2タイプイベント割合解析、タイプ1イベント割合は電圧増加とともに増加、タイプ2イベント割合は減少。高電圧がトランスロケーションを低電圧より高速化すること示唆。

各電圧での凝集ABTS^•+ΔG対イベントドウェルタイム2次元散布図模式図。対応フィット曲線を上部配置。インセットは異なる電圧（-400から-800 mV）トランスロケーションイベント

a -700 mV電圧での2タイプトランスロケーションイベント模式図。b 異なる電圧（-400、-500、-600、-700、-800 mV）での2タイプイベント割合

電流ブロッケード信号は、単一ナノポアチャネル通過凝集ABTS^•+のサイズ、コンフォメーション、相互作用を明らかに。電流形状変化についてプロセス推測。イベント1では、電流信号が深い強度の典型的変動部と短いドウェルタイムを持つ。凝集ABTS^•+が生成場所からナノポア通過可能性。凝集ABTS^•+ナノポア通過時、ナノポアイオン電流が元レベル（ベースライン）（I₀）へ回復。イベント2では、深い強度変動部後水平ステージ持つ。この信号形状は、ナノポア出口付近HRPと凝集ABTS^•+静電相互作用、電流が緩やかにベースライン回復に帰属。電流変化理解のため、塩濃度（0.1 M KCl）での開口ポアコンダクタンス変化（G_pore）から開始必要。先行研究議論通り、直径d、長さlの負帯電ナノポア開口ポアコンダクタンスは低塩濃度で以下式記述可能：

$$ {G}_{p ore}=\frac{\pi {d^2}_{p ore}}{4{l}_{p ore}}\left[\left({\mu}_{K^{+}}+{\mu}_{C{ l}^{-}}\right){n}_{K Cl}\cdot e+{\mu}_K\frac{4{\sigma}_p}{d_{p ore}}\right] $$ (2)

ここでμ_Kとμ_ClはK⁺とCl⁻電気泳動移動度、n_KClはK⁺とCl⁻数密度、素電荷e、σ_pはナノポア表面電荷密度。本実験では固体ナノポア化学修飾、ナノポア直径変化。ナノポア表面電荷密度（σ_p）正確取得不可。したがって開口ポアコンダクタンス（G_pore）を式(1)ベースで計算。式(1)より開口ポアコンダクタンス（G_pore）~7.5 nS。コンダクタンス変化は2理由に起因推測[15]。第一に、ナノポア内イオン体積排除が凝集ABTS^•+分子で占有されるため、固体ナノポアコンダクタンス減少（ΔG^-）。第二に、凝集ABTS^•+分子が一部イオンをナノポアから持ち去り、固体ナノポアコンダクタンス増加。本実験ではABTS^•+がナノポア内生成、イオン持込みなし。したがって固体ナノポアコンダクタンス変化（ΔG）は体積排除のみ誘起。総コンダクタンス変化は以下記述可能：

$$ \varDelta G=\varDelta {G}^{-} $$ (3)

固体ナノポアコンダクタンス減少は体積排除誘起、以下式で計算可能：

$$ \varDelta {G}^{-}=\sigma \frac{\gamma \varLambda}{{\left( l+0.8 d\right)}^2} $$ (4)

ここでγは粒子形状因子、同体積球体と粒子表面積比。本研究では凝集ABTS^•+分子を大域的物体に簡略化、γ = 1、Λは体積排除。バルク溶液伝導度σ = 1.28 S/m、0.1 M KCl（25 ℃）。

体積排除（Λ）は他分子トランスロケーションイベントから推論可能。固体ナノポアベース電解質溶液体積変化にオームの法則適用し、コンダクタンス変化（ΔG）を分子物理特性へ接続[59]。円筒形固体ナノポア内分子トランスロケーションイベントで電流瞬時減少。固体ナノポア抵抗が全回路抵抗の場合、コンダクタンス変化（ΔG）は以下式記述可能：

$$ \varDelta G(t)=-{G}_{p ore}\frac{\varLambda (t)}{H_{eff}{A}_p}\left[1+ f\left({d}_m/{D}_p,{l}_m/{H}_{eff}\right)\right] $$ (5)

この式でA_pH_eff = V_pは固体ナノポア体積、f(d_m/D_p, lm/H_eff)は補正因子（表面電荷効果無視）、本実験では凝集ABTS^•+分子を大域的物体に簡略化、補正因子=1。d_m/D_pは分子直径とナノポア直径比、lm/H_effは分子実効長とナノポア実効長比。式(5)簡略化可能：

$$ \varDelta G/{G}_{p ore}\approx \varLambda /{V}_p $$ (6)

トランスロケーションイベント解析から平均コンダクタンス（G_pore）取得。式(5)から異なる電圧（-400、-500、-600、-700、-800 mV）平均体積排除（Λ）取得。一方使用ナノポアサイズ既知、ナノポア体積（V_p）~90746 nm³。式(4)からコンダクタンス変化（ΔG^-）計算値~0.6 nS。異なる電圧（-400、-500、-600、-700、-800 mV）トランスロケーションイベント実験取得平均コンダクタンス変化~0.784 nS。計算値が実験値に近いこと確認。

先行研究で、異なる技術で過酸化水素分子検出達成。しかし、ナノチャネルによる過酸化水素検出は稀。Tanら[3]はHRPがナノポアスレッディング時、KCl溶液中ABTSとH₂O₂存在下で異型イベント信号分化、HRPトランスロケーション異型信号をABTS^•+ナノポア通過と見なし、酵素触媒基質生成物トランスロケーション6典型イベント分析、各タイプ推定プロセス推測。しかし十分証拠なし。Mubarak Aliらは単一円錐ナノチャネル内酸化還元反応生成物検出達成[58]。陽イオンラジカルABTS^•+がHRP-ナノチャネル内イオン電流低下、円錐ナノチャネル電圧依存イオン濃度と整合的電圧依存的。電流ブロッケード大きさが溶液H₂O₂濃度と相関。

結論

結論として、FIBでSi₃N₄ナノポア作製成功、共価結合HRP酵素で表面修飾した単一ナノポアシステム。基質H₂O₂とABTS存在下で酸化還元反応生成物（ABTS^•+)調査により、単一固体ナノポア内固定化HRP酵素効果がH₂O₂センサーとして肯定。固体ナノポア内生成凝集陽イオンラジカルABTS^•+がHRP修飾固体ナノポア内イオン電流低下、電圧依存性と整合。電流ブロッケード傾向は印加バイアス電圧に線形依存。ドウェルタイム対印加バイアス電圧関係は指数関数的減衰（t_d ~ e^−v/v0）。一方、HRP修飾ナノポア通過凝集ABTS^•+に-300 mV閾値電圧必要。コンダクタンス変化（ΔG）を解析的に計算し実測値と比較。トランスロケーションイベントは特定サイズ凝集陽イオンラジカルABTS^•+により生成。固体ナノポア使用で検出限界低下とシステム感度向上期待。本固体ナノポアシステムは構造シンプル、ファウリング感受性低く、複数回使用可能。

略語

3-APTES:

(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン

ABTS:

3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸

EDC:

N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド

FIB:

集束イオンビーム

HRP:

ホースラディッシュペルオキシダーゼ

KCl:

塩化カリウム

NHS:

N-ヒドロキシサクシニミド

SEM:

走査型電子顕微鏡

SNR:

信号対雑音比