6-メルカプトプリンとニューロン透過性ペプチドで修飾された金ナノ粒子によるSH-SY5Y細胞増殖の促進

背景

神経細胞の増殖と神経突起の成長の促進は神経再生において重要であり[1、2]、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、脳卒中などの神経変性疾患の治療に多大な努力が払われてきました[3 、4]。多くの研究で、材料の表面特性が細胞の形態に影響を及ぼし、細胞の複製と分化を妨害/促進する可能性があることが実証されました。 、6]。

既存の生体材料の中で、金ナノ材料は、合成の容易さ、表面機能化の利便性、低毒性、優れた安定化、および生体適合性により、センシング、ラベリング、ドラッグデリバリー、イメージングなどの幅広い生物学的アプリケーションで使用されています[7、 8]。たとえば、以前の研究では、低出力レーザー照射に関連する金ナノロッドが、対照と比較して、NG108-15神経細胞の神経突起長の最大25μmの増加を刺激したことが報告されています[9]。

抗炎症薬である6-メルカプトプリン（6MP;図1a）は、金ナノ粒子（AuNP）の表面を機能化して、Au-硫黄結合を介して6MP修飾AuNP（6MP-AuNP）を形成するために使用されています[10]。 。 6MP-AuNPを使用して、ターンオン/オフメカニズムを通じて溶媒中の6MP濃度を定量的に分析したことが報告されています[11]。ただし、細胞に対する6MP-AuNPの効果を示すデータはありません。

実験手順のスキーム。 a 6-メルカプトプリン構造。 b 実験手順。粒子はpH9.0で合成され、pH7.4で凝集しているように見えました。粒子がSH-SY5Y細胞培地に添加されると、それらは細胞に内在化され、細胞増殖を刺激しました

ここでは、神経細胞が培養基質の特性に強く影響されることがよく知られているため、神経細胞株を使用して6MP-AuNPと細胞の相互作用を調査しました。神経細胞株の中で、ヒト神経芽細胞腫（SH-SY5Y）細胞は、環境刺激に対する感度が高く、神経研究における機能性生体物質の重要性から、広く使用されているモデルシステムと見なされています。さらに、6MP-AuNPの神経細胞取り込み効率を高めるために、ニューロン標的ペプチド（RDP）を粒子表面に結合させて、6MP-AuNPs-RDPコンジュゲートを形成しました。結果は、コンジュゲートが明らかな神経突起活性を示したが、6MPの抗増殖効果は示さず、細胞増殖と神経突起成長の有意な増加につながることを示唆しました。

メソッド/実験

6MP-AuNPs-RDPコンジュゲートの合成

サイズが20nmのクエン酸塩でコーティングされたAuNPは、還元法によって合成されました。簡単に説明すると、HAuCl ₄ の水溶液 ・3H ₂ O（100 mL、0.01％）を激しく攪拌しながら30分間加熱した後、クエン酸ナトリウム溶液（10 mL、38.8 mM）をHAuCl ₄ にすばやく加えました。 解決。濃い赤色の溶液が得られるまで、混合物をさらに30分間還流し、自然に室温まで冷却しました。

6MP-AuNPは、以前のレポート[12]に従って、AuNP（0.33 mM）と6MP溶液（最終濃度0.046 nM）を室温で5時間混合することによって調製されました。次に、混合物を17,000 g で遠心分離しました。 30分間。その後、上清を捨て、ペレット（6MP-AuNPs）を再懸濁し、脱イオン水で3回洗浄しました。

RDPで変更された6MP-AuNPを取得するために、RDP（FAM w / CKSVRTWNEI IPSKGCLRVG GRCHPHVNGG GRRRRRRRRC、Shanghai Ji'erBiotech。Co。、中国で合成）と6MPをそれぞれ最終濃度0.023nMでAuNP溶液に同時に添加しました。 （0.33 mM）5時間後、17,000 g で遠心分離します 30分間。コントロールとして、FAM標識スクランブルペプチド（FAM-SP; GRNECRIPRV GCVSRWRIGR KGRCHRLRPG GRVNRSHT GC）を合成し（Shanghai Ji’erBiotech。Co。、China）、6MP-AuNPs-SP-FAMを並行して調製しました。その後、粒子の上澄みを廃棄し、粒子をそれぞれ脱イオン水で洗浄した。粒子溶液はそれぞれ0.1MNaOHでpH9.0に調整され、0.22μmシリンジフィルターを通過し、使用するために4°Cで保存されました。

パーティクルの特性

吸光度スペクトルは、粒子の光吸収を検出するために、ＵＶ ／ ｖｉｓ分光光度計（ＵＶ－２４５０、島津製作所、京都、日本）を用いて室温で測定された。粒子の粒子サイズとゼータ電位は、脱イオン水で希釈した後、動的光散乱（DLS）装置（Zetasizer Nano ZS; Malvern）を使用してそれぞれ測定しました。透過型電子顕微鏡（TEM;島津製作所）を使用して粒子構造を観察しました。

細胞培養

SH-SY5Y細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）とF-12培地で1：1の比率で培養されました。培地には、それぞれ10％ウシ胎児血清（FCS）、100ユニット/ mLペニシリン、100μg/ mLストレプトマイシンを添加しました。セルは、5％CO ₂ で37°Cに維持されました。 加湿インキュベーター（Thermo Fisher Scientific、米国）で。細胞培養用の試薬はすべてHyClone（USA）から購入しました。

細胞の取り込み

SH-SY5Y細胞を5×10 ⁴ の密度で24ウェルプレートに播種しました 細胞/ウェル。細胞のコンフルエンスが60％に達したときに、最終濃度0.25μg/ mLのFAM標識6MP-AuNPs-RDPおよび6MP-AuNPs-SPをそれぞれ細胞培地に添加して2時間インキュベートしました。その後、細胞培地を廃棄し、新しい培地と交換した。細胞は、蛍光顕微鏡（オリンパス、日本）を使用して観察および写真撮影されました。

6MP-AuNPs-RDPがニューロンの成長に与える影響

SH-SY5Y細胞を5×10 ⁵ の密度で24ウェルプレートに播種しました 細胞/ウェル一晩。次に、さまざまな濃度（0、0.125、0.25、0.5、1.0μg / mL）のRDP-6MP-AuNPをそれぞれ培地に添加して、24時間培養しました。自動セルカウンター（Bio-Rad、USA）を使用して細胞数をカウントしました。

また、細胞代謝活性は、以前の報告[13]に従って、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイによって測定されました。簡単に説明すると、SH-SY5Y細胞を5×10 ⁴ の密度で96ウェルプレートに播種しました。 細胞/ウェルおよび10％FBSを含む培地で一晩インキュベートした。次に、粒子をそれぞれメディアに24時間追加しました。細胞をPBSで3回洗浄した後、100μLの新鮮な培地と10μLのMTT（PBSバッファー中5 mg / mL）を各ウェルに添加しました。 4時間のインキュベーション後、培地を除去し、200μLのジメチルスルホキシド（DMSO）を添加して、生成されたホルマザンを溶解しました。マイクロプレートリーダー（Bio-Rad、USA）を使用して、490nmで上清の吸光度を測定しました。添加物のないセルをブランクとして使用し、溶媒（0.1 M NaOH（pH 9.0））のみを含むセルをコントロールとしてpH7.4に調整しました。相対的な細胞代謝活性は、代謝活性（％）=OD ₄₉₀ として計算されました。 （サンプルブランク）/ OD ₄₉₀ （コントロールブランク）。各値は、4つの独立した実験から平均されました。

神経突起の成長に対する6MP-AuNPs-RDPの効果を決定するために、SH-SY5Y細胞を6ウェルプレートに移植し、30％のコンフルエンスまで成長させました。次に、細胞を6MP-AuNPs-RDP（0.25μg/ mL）で1日1回3日間処理しました。神経突起の長さは、光学顕微鏡（オリンパス、日本）で観察され、ImageJソフトウェアを使用して計算されました[14]。

6MP-AuNPs-RDPでコーティングされた表面での細胞増殖

6MP-AuNPs-RDPを直径3.5cmの培養皿の底に均一にプレーティングし、細胞を粒子コーティングした皿に移植しました。インキュベーション後、細胞を光学顕微鏡で観察し、神経突起の長さを数えた。溶媒のみを含むセルをコントロールとして使用しました。各実験は4回独立して繰り返され、神経突起の長さを計算するために200個の神経突起が平均化されました。

統計分析

データは平均±SEMとして表されました。データは、一元配置分散分析（ANOVA）によるコンピュータープログラムで分析され、続いてSPSS13.0ソフトウェアを使用したDunnettの複数範囲テストが行​​われました。 p との違い <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果

ナノ粒子の外観と特性

AuNPsの水溶液は、可視光下で緋色を示しました（図2a、0秒）。 6MPを添加した後、6MPをAuNPに結合させると色が徐々に暗くなり、最後に5時間の反応後に6MP-AuNPの青黒色の沈殿が現れました。 pHを9.0に調整することで沈殿を解消することができ、その時点で6MP-AuNPsの水溶液はバラ色を示していました。 pHをpH7.4に調整すると、沈殿物が再形成されます。

ナノ粒子の反応プロセスと特性。 a 6MP-AuNPを調製するための反応プロセス。 6MPをAuNP溶液に加えた後、溶液の色が変化し、5時間で徐々に沈殿が形成されました。 b 6MP-AuNPs-RDP沈殿物は、0.1 MNaOHでpHを9.0に調整すると溶解しました。 c 粒子のサイズ分布のDLS測定。 d AuNPs、6MP-AuNPs、および6MP-AuNPs-RDPのゼータ電位。 e TEM下の粒子構造

6MP-AuNPs-RDPは、AuNPsを6MPのチオール基またはpH9.0のRDPと結合させることによって調製しました。 6MP-AuNPs-RDPの水溶液は、6MP-AuNP溶液と同じバラ色を示しました（図2b）。 6MP-AuNPs-RDP溶液のpHを7.4に調整すると、粒子が溶液の底に沈殿しました。

6MP-AuNPsと6MP-AuNPs-RDP溶液（pH 9.0）のサイズとゼータ電位をそれぞれDLSで調べました（図2c）。データによると、6MP-AuNPs-RDPの平均サイズは6MP-AuNPsの平均サイズよりもわずかに大きく（24.6 vs 20.5 nm）、前者のゼータ電位は後者よりも大幅に高かった（− 25.8 vs − 37.2 mV）。カチオン性RDPが粒子の表面電位を増加させたことを示唆している。 TEM画像は、これらのナノ粒子の両方が球形であることを示しました（図2d）。

ナノ粒子の細胞取り込み

粒子溶液をpH7.4に調整し、細胞培地に加えると、粒子は凝集を開始し、ウェルの底に徐々に沈みました。ただし、30分後、細胞の周囲に明らかな空白のプラークが現れ、6MP-AuNPs-RDPで処理した細胞のギャップは6MP-AuNPsよりも粒子の凝集が少なかった（図3a）。また、6MP-AuNPsで処理された細胞と比較して、6MP-AuNPs-RDPで処理された細胞内でより多くのナノ粒子が観察されました。

ナノ粒子の細胞取り込み。 a 0.25μg/ mLの6MP-AuNPsおよび6MP-AuNPs-RDP溶液をそれぞれpH7.4に調整し、細胞培地に添加して30分間インキュベートしました。粒子はSH-SY5Y細胞に内在化されるか、ウェルの底に沈殿しました。 b 6MPおよび蛍光標識ペプチド修飾AuNPの概略図。 SH-SY5Y細胞を粒子と2時間インキュベートした後、画像を撮影しました（ c ）および蛍光強度（ d ）を測定しました。データは平均±SEMとして表されます。値は、4つの独立した実験で平均化されました。 ^** p <6MP-AuNPs-SP処理細胞と比較して0.01

粒子が神経細胞に侵入する可能性があることをさらに特定するために、蛍光標識ペプチドを粒子と結合させました（図3b）。細胞をこれらのナノ粒子と2時間インキュベートした後、6MP-AuNPs-RDP処理細胞では強い蛍光が観察されましたが、6MP-AuNPs-SP処理細胞では比較的弱い緑色の蛍光が観察されました。 （図3c）。蛍光分光計（日立製作所東京、日本）を用いた蛍光強度測定の結果、6MP-AuNPs-RDP処理細胞は6MP-AuNPs-SP処理細胞よりも有意に高い蛍光強度を示しました（図3d）。 ）、細胞透過性ペプチド（CPP）の一種であるRDPが、粒子の細胞取り込み効率を高める可能性があることを示唆しています。

ニューロンの成長に対するナノ粒子の影響

粒子がニューロンの成長に影響を与えたかどうかを調べるために、MTTアッセイと細胞カウントの両方を使用して、細胞を粒子と24時間インキュベートした後の細胞代謝活性と数を測定しました。結果は、RDP単独では細胞増殖に影響を与えなかったが、0.125および0.5μg/ mLを超えるそれぞれの濃度の6MP-AuNPs-RDPおよび6MP-AuNPsは、用量依存的に細胞代謝活性および細胞数を増加させたことを示しました（図。 4a、b）。また、6MP-AuNPs-RDP処理細胞は、6MP-AuNPs処理細胞よりも高い代謝活性を示しました。これは、6MP-AuNPs-RDPの6MP-AuNPsよりも高い細胞透過効率に関連していると考えられます。

粒子は細胞の代謝活性を高めました（ a ）と数字（ b ）、および6MP-AuNPsと6MP-AuNPs-RDPの濃度は0から1.0μg/ mLまで変化しました。データは平均±SEMとして表されます。溶媒{0.1M NaOH（pH 9.0）を0.1 MHClでpH7.4に調整}のみのセルをコントロールとして使用しました。値は、4つの独立した実験で平均化されました。 ^* p <0.05、 ^** p RDP処理細胞と比較して<0.01、 ^＃ p <0.05、および ^## p <6MP-AuNPs処理細胞と比較して0.01

神経突起の長さに対するナノ粒子の影響

粒子が細胞の代謝活性を高める可能性があることに加えて、神経突起の長さに対する粒子の影響も、粒子の高濃度（1μg/ mL）で観察されました。画像（図5a）は、凝集したナノ粒子がウェルの底に定着し、6MP-AuNPs-RDP処理細胞の周囲に大きなブランクプラーク領域が現れたことを示しています。

ナノ粒子は神経突起の成長を促進しました。画像（ a ）および神経突起の長さ（ b ）細胞をそれぞれRDP、6MP-AuNPs、および6MP-AuNPs-RDPで24時間処理した後。溶媒のみを含むセルをコントロールとして使用しました。値は200個の神経突起について平均されました。 ^* p <0.05および ^** p <コントロールと比較して0.01

24時間のインキュベーション後、結果は、粒子で処理された細胞が対照細胞よりも長い神経突起を有することを示したが、RDP処理された細胞と対照との間に有意差はなかった。さらに、6MP-AuNPs-RDP処理細胞の神経炎は、6MP-AuNPs処理細胞の神経炎よりも著しく長かった（図5b）。

図5の結果から、6MPはその細胞毒性のためにすべてのSH-SY5Y細胞を殺しました。したがって、プレートのコーティングには6MPを使用しませんでした。また、図1および2に表示されているように。 3、4、および5では、比較的少量の6MP-AuNPが細胞に入り、神経突起の長さと細胞数の両方が6MP-AuNPs-RDPよりも明らかに低かった。したがって、6MP-AuNPs-RDPは、細胞増殖への影響を調べるためのさらなる研究のために選択されました。

6MP-AuNPs-RDPの反復投与後の細胞増殖と神経突起成長

細胞増殖および神経突起成長に対する6MP-AuNPs-RDPの結果をさらに特定するために、6ウェルプレートで細胞を培養した後、1、2、および3日目に6MP-AuNPs-RDPを細胞培地に3回添加しました（1日目）。 0）。その結果、粒子処理した細胞の神経突起の長さは対照よりも明らかに長くなり（図6a、b）、細胞を粒子で処理すると細胞の代謝活性が増加した（図6c）。

ナノ粒子は細胞増殖と神経突起成長を誘発しました。 a 1、2、3、4日目の細胞画像。 b 6MP-AuNPs-RDP処理細胞とコントロールの神経突起の長さ。値は200個の神経突起について平均されました。 ^** p コントロールと比較して<0.01。 c 6MP-AuNPs-RDP処理細胞の代謝活性。細胞は、1日1回3日間、3回処理されました。細胞移植から24時間培養した後、初めて6MP-AuNPs-RDPを細胞培地に添加しました。粒子の各濃度は0.25μg/ mLでした。 d 6MP-AuNPs-RDPで表面コーティングされた細胞の神経突起成長の画像。 6MP-AuNPs-RDPを直径3.5cmの培養皿の底にプレーティングし、細胞を皿に移植しました。 e 神経突起の長さは0〜3日で測定されました。溶媒のみを含むセルをコントロールとして使用しました。値は200個の神経突起について平均されました。 ^** p コントロールと比較して<0.01、 ^* p <0.05、 ^** p <1日目の細胞と比較して0.01。青い矢印は代表的な神経突起を指しています

粒子を表面コーティング材料として使用した場合の神経突起成長に対する6MP-AuNPs-RDPの影響を調べるために、培養皿の底を6MP-AuNPs-RDPでコーティングし、次に細胞をコーティングに移植しました。画像は、粒子が細胞膜にすばやく付着し（図6d）、その後、粒子が細胞質、核膜、細胞核を含む細胞全体に内在化して分布していることを示しています。結果はまた、粒子処理された細胞が対照よりも有意に長い神経突起を持っていたことを示しました（図6e）。

凍結保存後の細胞増殖に対するナノ粒子の影響

粒子の細胞耐性を調べ、細胞が分離した成長状態の後に増殖能力を維持したかどうかを確認するために、6MP-AuNPs-RDP処理細胞を凍結し、指数増殖期に達したときに数日間保存しました。次に、細胞を回収し、24ウェルプレートで培養しました（図7a）。その結果、粒子処理細胞の数が大幅に増加し、神経突起がコントロールよりも長くなったことがわかりました（図7b、c）。これは、粒子処理細胞の成長が凍結および回復プロセスの影響を受けないことを示唆しています。 。

ナノ粒子は、凍結保存後に神経突起の長さと細胞数を増加させました。 （ a ）保存前に細胞を6MP-AuNPs-RDP（1.0μg/ mL）で処理し、細胞を回収して3日間培養を続けました。神経突起の長さ（ b ）およびセル番号（ c ）6MP-AuNPs-RDP処理細胞のうち、保存後に有意に増加しました。溶媒のみを含むセルをコントロールとして使用しました。データは平均±SEMとして表されます。 ^** p コントロールと比較して<0.01。青い矢印は代表的な神経突起を指しています

ディスカッション

AuNPは、化学、物理学、材料、生物学、医学、および関連する学際的な分野のさまざまな分野で大きな潜在的なアプリケーションを示しています。 AuNPの構造を安定化するために、Au-S結合の形成によってAuNPの表面に結合できる安定剤として、最も頻繁にチオール修飾リガンドが使用されました。この研究では、6MPとRDPのチオール基がAuNPの表面と結合しており、粒子構造は安定しており、さらなる研究に使用できました。

結果からわかるように、粒子は明らかな酸塩基特性を持っていました。これは、溶液中で10.4〜11.2のpH範囲で起こった6MP分子のN（9）-H基の解離に関連していました。 6MP-AuNP溶液のpH値が6未満の場合に凝集が発生しました。6MP分子のN9のプロトン化により、pH値が6未満の6MP-AuNPが中和され、分子間相互作用（塩基スタッキング相互作用）が非常に強くなり、補償されました。静電反発。 RDP修飾後、チオール-RDPのpIは6MP-AuNPの酸塩基特性に加えて、約11.5であったため、粒子はより複雑な酸塩基挙動を示しました。滴定から、6MP-AuNPs-RDPのpI値は7.8であり、生理学的条件（pH 7.4）に近かった。したがって、6MP-AuNPs-RDPおよび6MP-AuNPsは細胞培地から沈殿する可能性があります。

この研究では、RDPが6MP-AuNPの細胞取り込みを改善することを確認しました。これは、以前の研究と一致していました。 RDPは39アミノ酸からなる長いペプチドであり、外来高分子を神経細胞に輸送する能力を持つ狂犬病ウイルス糖タンパク質に由来することが一般的に知られています[15、16]。以前の研究では、金ナノクラスターの細胞取り込み効率は、ナノクラスターがRDPと結合したときに大幅に向上しました[17]。細胞へのRDP浸透のメカニズムは、神経細胞膜γ-アミノ酪酸（GABA）受容体またはニコチン性アセチルコリン受容体を介したエンドサイトーシスに関連している可能性があります[18、19]。

この研究はまた、6MP-AuNPs-RDPが細胞増殖と神経突起成長を促進し、明らかな神経突起活性を示すという、6MPと比較した6MP-AuNPs-RDPの反対の効果を示唆しました。 6MP-AuNPs-RDPと6MPのこの明確な違いのメカニズムは、6MP（C6チオール基のプリン誘導体）の化学構造に関連している可能性があります[20]。 6MP-AuNPs-RDPの表面では、6MPのチオール基がAuNPsとの結合に関与しており、ブロックされていました。したがって、プリン基は粒子表面に露出していた。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ/細胞外シグナル調節タンパク質を含む細胞内プリン作動性シグナル伝達経路[21、22]を介して、プリンがニューロンの成長（細胞分化、神経突起の形成と伸長、シナプス形成など）を促進する上で重要な役割を果たすことは広く認められています。キナーゼ（MAPK / ERK）およびホスファチジルイノシトール3-キナーゼ/セリン-スレオニンキナーゼAkt（PI3K / Akt）経路（ニューロトロフィンおよびサイトカインによって誘導される同じ経路）[23]。したがって、6MP-AuNPs-RDPのプリンは、細胞増殖と神経突起成長の影響に寄与している可能性があります。

SH-SY5Y細胞は6MP-AuNPs-RDPに対して優れた耐性を示したことを指摘しておく必要があります。粒子処理された細胞が粒子の繰り返し投与または凍結保存からの回復を受けた場合、細胞が粒子でコーティングされた表面で成長した場合でも、それらは依然として増殖活性を維持し、6MP-AuNPs-RDPがアプリケーション。

結論

ここでは、6MPとRDPで修飾されたAuNPが細胞増殖と神経突起成長を効果的に促進できることを示唆しました。ナノ粒子の優れた生体適合性と生物学的安全性により、それらは神経細胞の成長のための神経細胞ナノ材料として使用できる有望な生体材料です。

略語

6MP：

6-メルカプトプリン

AD：

アルツハイマー病

AuNPs：

金ナノ粒子

DLS：

動的光散乱

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

DMSO：

ジメチルスルホキシド

FCS：

ウシ胎児血清

MTT：

3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド

PD：

パーキンソン病

RDP：

狂犬病ウイルス由来ペプチド

TEM：

透過型電子顕微鏡