強化された細胞内在化のためのFe3O4磁性ナノ粒子の葉酸とgH625ペプチドベースの機能化の比較

背景

血液脳関門（BBB）は、中枢神経系（CNS）の恒常性の維持に重要な役割を果たす血液と脳の間の動的なインターフェースです。 BBBの主成分は内皮細胞（すなわち、星状細胞と周皮細胞）であり、脳の微小血管の内面を覆う連続したシートを形成します。それらは密着結合によって相互接続されており、BBB血管透過性の制御[1]と、さまざまな循環毒素やその他の有害な分子からの脳の保護[2、3]の両方に重要です。他の神経血管ユニットの構成要素であるニューロンとミクログリアは、BBBで異なる役割を果たします[4、5]。

内皮細胞の連続シートにより、98％の小分子薬と100％の高分子薬がBBBを通過せず、脳組織への薬物の送達に失敗します[6]。したがって、多くの脳疾患の治療のための効率的なデリバリーシステムを開発するためには、BBBを通過するキャリアの能力を調査することが重要です[7]。

過去10年間で、ナノ粒子ベースのシステムは、癌の標的化と治療のための効果的な治療薬として広く研究されてきました。これに関連して、有機官能化磁性鉄ナノ粒子（MNP）は、表面官能基化の多様性とそのコアの磁気特性および非毒性の生体適合性を組み合わせているため、多くの関心を集めています。 MNPは、タンパク質および細胞の選別と操作[8、9]、細胞標識[10、11]、磁気制御ドラッグデリバリー[12、13]、磁気共鳴画像法（MRI）などの治療用途（診断および治療）に広く採用されています。 [14、15]、および温熱療法[16、17、18、19]。生物医学的用途に効率的に使用されるためには、MNPは細胞膜を通過でき、特にさまざまな生物学的障壁を通過できる必要があります。機能性分子によるMNP表面の修飾は、細胞の内在化を改善するためによく使用されてきましたが、多くの場合、BBBの交差は依然として問題です。

これに関連して、細胞透過性ペプチド（CPP）の使用が見られます。これは、天然源または合成的に設計された構造物に由来する比較的短いペプチド（5〜40アミノ酸）のグループであり、膜二重層を容易に通過できます。有望なアプローチとして。利用可能な多数のCPPの中で、単純ヘルペスウイルス1の糖タンパク質H（gH）に由来する20残基のペプチドgH625が最近開発され、BBBを通過して、さまざまな貨物の取り込みを強化するために使用されています[20、 21]サイトゾルに。

本研究では、MNPは、3-アミノプロピルホスホン酸（NH ₂ ）のカップリング層に基づく2つの異なるクラスのターゲティングコーティングで機能化されています。 -PA）。 NH ₂ に接続することにより、2つのコーティングが得られました。 -PA修飾MNP（NH ₂ @MNPs）gH625（gH625 @ MNPs）細胞透過性ペプチドまたはPEGおよび葉酸（PEG、FA @ MNPs）分子のいずれか。特に、PEG化ナノ粒子への葉酸（FA）の導入は、FA受容体を介した内在化[22]による腫瘍細胞への細胞取り込みと、ナノシステム全体の生体適合性[23]の両方を改善することを目的としています。ヒトの脳（HBMEC）から一次微小血管内皮細胞へのMNP細胞内取り込みに対する2つの表面コーティングの効果は、共焦点レーザー走査顕微鏡によって評価されています。この目的のために、発光プローブが両方のシステムに組み込まれました。特に、gH625は4-クロロ-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール（NBD）プローブで標識され、一方、カルボキシ- X -ローダミン（rhod）プローブがPEG、FA @MNPのシェルに追加されました。

内皮細胞におけるgH625修飾MNPの細胞内取り込みの研究、およびFA修飾MNPとの比較は、私たちの知る限り、これまでに報告されたことはありません。

BBBを通過する能力に加えて、脳腫瘍細胞を標的にすることは、脳腫瘍治療薬のもう1つの重要な要件です。したがって、最も一般的なヒト悪性神経膠腫の1つであるA-172神経膠芽腫における2つの異なるコーティングされたMNPの細胞内在化も評価されました。

gH625で官能化された鉄ナノ粒子が最近Perilloらによって調製されたことに注意してください。 [24]、本研究では、非常に用途の広いホスホン酸プラットフォームに基づく異なる合成戦略を報告します。特に、ホスホン酸化学は、MNPと、シラン化されたMNPの安定性に匹敵する安定性を持つホスホン酸単分子層との間に強い結合を形成することを可能にします。さらに、P-O-Pの自己縮合はごくわずかであるため、ホスホン酸リンカーの使用は、シランを使用するときにしばしば遭遇するオリゴマー形成の欠点を克服します[25]。

メソッド

資料

MNPの合成と機能化に使用されるすべての試薬、FeCl ₂ ・4H ₂ O、FeCl ₃ ・6H ₂ O、3-アミノプロピルホスホン酸、メトキシポリエチレングリコール酢酸 N -分子量5000Daのスクシンイミジルエステル（PEG-NHS）、葉酸、 N -ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、およびカルボキシ- X -ローダミン N -スクシンイミジルエステル（Rhod-NHS）はSigma-Aldrichから購入し、さらに精製することなく使用しました。ペプチド合成に使用された9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）で保護されたアミノ酸は、Romil Del Chimica、Chemicalsによって購入され、さらに精製することなく使用されました。水はMilli-Qグレード（18.2 MO cm）で、0.22μmフィルターでろ過しました。

MNPの合成

裸の酸化鉄MNPは、Fe ³⁺ のアルカリ共沈によって合成されました。 およびFe ²⁺ 、文献[26]に記載されているプロトコルによる。簡単に説明すると、FeCl ₂ ・4H ₂ OおよびFeCl ₃ ・6H ₂ O（モル比1：2）をN ₂ の下で水（50 ml）に溶解しました。 激しくかき混ぜる雰囲気。 NH ₃ H ₂ で25％ O（5 ml）を80°Cで溶液に加え、反応を30分間続けました。得られた懸濁液を室温まで冷却し、超純水で洗浄した。得られた裸の磁性ナノ粒子（裸のMNP）は、磁気デカンテーションによって溶媒から分離されました。

gH625の合成

ペプチドは、標準的な固相9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）法を採用して以前に報告されたように[27]調製されました。簡単に説明すると、50μmolのペプチドをWangレジン（0.75 mmol / g）で、脱保護とカップリングの連続サイクルによって合成しました。次に、レジンに結合したペプチドを4-クロロ-7-ニトロベンゾフラザン（NBD-Cl）と反応させました。反応は、DIPEAの存在下で一晩実施した。ペプチドを樹脂から切断し、トリフルオロ酢酸（TFA）とスカベンジャーの混合物で処理し、氷冷したエチルエーテルで沈殿させた後、脱保護しました。ペプチドを水に溶解し、凍結乾燥させた。粗ペプチドの特性評価は、15分で20〜80％の水中（0.1％TFA）中のアセトニトリル（0.1％TFA）の線形勾配を採用したエレクトロスプレーイオン化（ESI）LC-MSによって実行されました。次に、分取逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）で精製しました。

N の合成 -葉酸のヒドロキシスクシンイミドエステル（FA-NHS）

FA-NHSは、以下の公開された方法[28]によって調製されました。 500ミリグラムの葉酸（FA）を、240mlのトリエチルアミンを含む10mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解しました。 NHS（260 mg）および N 、 N -ジシクロヘキシルカルボジイミド（470 mg）を加え、混合物を室温、暗所で一晩反応させた。副生成物であるジシクロヘキシル尿素を濾過により除去した。次に、DMSO溶液を減圧下で濃縮し、FA-NHSをジエチルエーテル中で沈殿させた。生成物を無水エーテルで数回洗浄し、空気中で乾燥させた。

機能化されたMNPの合成

NH _2の合成 @MNPs

MNP（200 mg）はH ₂ に分散されていました O（25 ml）超音波浴を30分間使用します。 NH ₂ -PA（100 mg）を添加し、懸濁液を室温で2時間撹拌しました。粒子を磁気的に分離し、H ₂ で4回洗浄した。 O、次にエタノールで乾燥させます。

gH625 @MNPの合成

NH ₂ @MNP（300 mg）とgH625（1.2 mg）をDMSO（20 ml）に分散させました。溶液を25℃で一晩混合した。得られた粒子を磁気的に分離した。 DMSO、H ₂ で洗浄 O、およびエタノール;空気中で乾燥させます。

PEG、FA @MNPの合成

NH ₂ @MNP（300 mg）、PEG-NHS（30 mg）、FA-NHS（3 mg）、およびRhod-NHS（3 mg）をDMSO（15 ml）に分散させ、溶液を25°Cで一晩混合しました。 。得られた粒子を磁気的に分離した。 DMSO、H ₂ で洗浄 O、およびエタノール;空気中で乾燥させます。

サンプルの特性評価

X線粉末回折（XRD）測定は、θを使用して実行されました。 – θ 5005 Bruker-AXS回折計（Zeiss、オーバーコッヘン、ドイツ）、40kVおよび30mAで動作するCuKα放射線を使用。 X線光電子分光法（XPS）は、標準のAl-KαX線源を備えたPHI5600マルチテクニックESCA-Auger分光計を使用して実行されました。分析は、光電子角45°（サンプル表面に対して）、受容角±7°で実行されました。 XPS結合エネルギー（B.E.）スケールは、炭化水素部分と偶発的な炭素によるC1sピークを285.0eVに集中させることによって較正されました。 UV / Vis測定は、JASCO V-560 UV / Vis分光光度計を使用して実行され、スペクトルは±0.2nmの分解能で記録されました。動的光散乱（DLS）およびMNPのゼータ電位測定は、He–Neレーザー（633 nm）と後方散乱検出器（173°）を備えたZetasizer Nano-ZS（Malvern Instruments、Malvern、UK）を使用して25°Cで実行されました。 ）。透過FT-IR測定は、KBrペレット技術を使用してJASCO FTIR 430分光計で記録され、スペクトルごとに100回のスキャンが収集されました（スキャン範囲560〜4000 cm ^{− 1} 、解像度4 cm ^{− 1} 。

細胞培養

報告された方法[29]に従って、ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC）およびヒト神経膠芽細胞腫細胞株A-172を、ラット尾コラーゲンI型コーティング組織培養フラスコでコンフルエントになるまで増殖させました。簡単に説明すると、HBMECは、5％ウシ胎児血清（FBS）と1％内皮細胞増殖サプリメントを添加した内皮細胞培地で増殖させました。 A-172細胞株は、前述のように2 mMグルタミンと10％FBSを含むDMEMで培養しました[30]。どちらの場合も、100 U / mlのペニシリンと100μg/ mlのストレプトマイシンも培養物に添加されました。

細胞生存率アッセイ

細胞生存率は、[3-（4,5-ジメチル-2-チアゾリル）-2,5-ジフェニル-2 H -臭化テトラゾリウム]（MTT）テスト[31]。すべての実験条件で、FBS濃度は1％（飢餓培地）に減少しました。細胞を96ウェルプレートに7000細胞/ウェルで播種し、実験全体を通して最適な細胞密度を得ました。すべてのアッセイで、細胞は最初にMTTとともに37°Cで3時間インキュベートされました。次に、0.04 M HClを含むイソプロパノールを添加し、570 nmのテスト波長でプレートリーダー（Synergy 2-BioTek）を使用して1時間で吸光度を測定しました[32]。

共焦点顕微鏡

共焦点顕微鏡検査は、24ウェルプレートに配置された顕微鏡カバーガラス上で増殖したHBMECおよびA-172神経膠芽腫細胞の両方で実施さ​​れました。 MNPの有無にかかわらずインキュベーションした後、細胞をPBS中の4％パラホルムアルデヒドを添加することによって固定し、初期に記載されたように免疫細胞化学のために処理しました[33]。共焦点顕微鏡分析は、次の励起源を備えたOlympus FV1000共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM）を使用して実行されました：ダイオードレーザー（405 nm）、マルチラインArレーザー（457、488、および515 nm）、HeNe（G）レーザー（ 543 nm）、およびHeNe（R）レーザー（633 nm）。油浸対物レンズ（60xO PLAPO）を使用し、スペクトルフィルタリングシステムを介して放出光をシーケンシャルモードで検出しました。検出器のゲインは一定値に固定され、ウェルの領域全体のランダムな位置ですべてのサンプルの画像が撮影されました。次の取得パラメータが使用されました：λ ex / em =405/425 − 475 nm（青色チャネル、DAPIによる核染色）; λ ex / em =488/500 − 530 nm（緑のチャネル、NBDによるgH625 @ MNPsラベリング）;およびλ ex / em =633/650 − 700 nm（赤チャンネル、PEG、FA @ MNP、rhodによるラベリング）。蛍光の定量分析は、ImageJソフトウェア（1.50iバージョン、NIH）を使用して実行されました。

結果と考察

MNPの合成と特性評価

Fe ₃ からgH625 @ MNPおよびPEG、FA @MNPを準備するために実装された全体的な戦略 O ₄ 共沈によって得られるナノ粒子には、図1に示すように2つのステップが含まれます。最初のステップは両方のクラスのナノ粒子で同じであり、アミノ基を持つホスホン酸によるMNP機能化に基づいています（NH ₂ -PA）。 2番目のステップでは、NH ₂ -PAで事前に機能化されたMNP（NH ₂ @MNPs）は、NHSカップリング反応を介して特定の機能性分子とさらに結合します。特に、 N -NBDで標識されたgH625のヒドロキシスクシンイミド活性化型は、gH625 @ MNP、および N の調製に使用されました。 -ヒドロキシスクシンイミド活性化型のPEG、FA、およびRhodを使用して、PEG、FA @MNPを取得しました。共焦点レーザー走査顕微鏡研究を実施するために、gH625 @ MNPとPEG、FA @ MNPの両方が発光プローブ（つまり、それぞれNBDとRhod）で標識されていることに注意してください。

反応スキーム。機能化されたMNPの調製のための反応ステップ

共沈ステップ後に得られた裸のMNPのX線回折（XRD）特性評価は、以前の論文[34、35]で報告されたものと同様です。簡単に説明すると、典型的なパターン（図2a）は、4つの回折ピーク（2 θ）を示しています。 =30.16°、35.48°、43.10°、および57.04°）。これは、マグネタイト、マグヘマイト、または2つの相の間の中間組成の存在と一致しています。格子定数 a 、バルクマグネタイトの格子定数（8.396Å）とよく一致する8.389（4）Åであることがわかり、Debye-Scherrerの式を適用して決定された11.2の平均結晶サイズは以前の値と同等です。報告された[34、35]。

MNPの典型的なXRDおよびXPSスペクトル。 a）裸のMNPと高分解能Fe 2p _3/2 のXRDパターン b）裸のMNPおよびc）NH ₂ のXPSスペクトル領域 @MNPs

Fe ₃ の結晶構造から O ₄ マグネタイトはγ-Fe ₂ と非常によく似ています。 O ₃ マグヘマイト、XRDで2つの相を区別することは非常に困難です。このため、X線光電子分光法（XPS）を使用してMNPをさらに分析しました。図2bは、Fe 2p _3/2 を示しています。 裸のMNPの高​​分解能XPSスペクトル。 710.9 eVで観測されたバンドの重心は、Fe 2p _3/2 に対応します。 ピーク。この値は、Fe ³⁺ で報告された値よりも低くなっています。 α-Fe ₂ の八面体の穴のいずれか O ₃ （711.6 eV）[36、37]またはγ-Fe ₂ の四面体と八面体の混合穴 O ₃ （711.4 eV）であり、Fe ₃ 中のFeの混合酸化状態と一致しています。 O ₄ [37、38]。

最後に、同様のMNPの詳細な磁気特性が、以前の論文[34、35]で報告されています。

機能化プロセスは、FT-IRおよびXPSによって評価されました。ホスホン酸単分子層で官能化した後、Fe 2p _3/2 バンド（図2c）は関連する変更を示していないため、Fe ₃ O ₄ フェーズは保持されます。ただし、Fe 2p _3/2 のわずかなシフト（0.4 eV） より低い結合エネルギー（B.E）に向かう重心が観察され、これはホスホン酸単分子層の固定に関連していました。実際、同様のシフトがさまざまな酸化第二鉄のリン酸塩吸着で観察され[39]、吸着質からFe原子への電荷移動に起因する可能性があります。 Fe 2p _3/2 PEGとFAを固定するためのすべての機能化手順の後、710.5eVの位置が維持されました。

図3は、NH ₂ のP2p、N1s、およびC1sスペクトル領域の比較を示しています。 それぞれ@ MNP、PEG、FA @ MNP、およびgH625 @MNP。 NH ₂ のP2pピーク位置（133.2 eV） @MNPは通常、二座の方法で表面に固定されたホスホン酸の存在に関連しています[40、41、42、43]。 gH625 @ MNPsおよびPEG、FA @ MNPsのスペクトルのP2pバンド位置は、NH ₂ で観察されたものと同じです。 @MNPsスペクトル。したがって、ペプチドと葉酸の固定化のカップリング反応中にホスホン酸分子が除去されないことがわかります。

機能化されたMNPのXPS特性評価。 a）NH ₂ の高分解能P2p、C 1s、およびN 1sXPSスペクトル領域 @ MNP、b）PEG、FA @ MNP、およびc）gH625 @ MNP

NH ₂ のN1sスペクトルの形状とピーク位置 @MNPは、アンカーされたNH ₂ の存在と一致しています。 -PA。バンドは2つの異なるコンポーネントで構成されています。399.9eVの最初のコンポーネントはアンカーされたアミノプロピルホスフェートの–NH基に関連付けられ、401.5eVを中心とする2番目のコンポーネントはFe _{3の表面と相互作用するアミノ基によるものです。} O ₄ プロトン化または–H結合の形成を介して。

gH625ペプチドまたはFA、PEG、Rhodのいずれかを固定した後、399.8 eVのN1s成分は、NH ₂ のプロトン化アミノ部分に関連する401.8eVの成分と比較して増加します。 @MNP。この増加は、固定されたアミノプロピルホスフェートと共役分子（gh625、FA、PEG、Rhodなど）の間のアミド結合（400.2 eV）に関与するN原子と、gh625のN原子の信号が重複しているためです。およびFA（399.1および400.6 eV）。

NH ₂ のC1sバンド @MNPsスペクトルは、以前に報告されたように[40]、脂肪族炭素に割り当てられた285.0eVの単一のピークで構成されています。

gH625 @ MNPsおよびPEG、FA @ MNPsのC1sスペクトルでは、288.3eVでのC1s成分の存在は、gh625、FA、およびRhod分子のカルボキシル基とアミド基によるものです。

NH ₂ のFT-IRスペクトル @ MNP、gH625 @ MNP、およびPEG、FA @ MNPが図4に報告されています。すべてのサンプルで、スペクトルは1250 cm ^{− 1} のバンドを示していません。 P =Oと900〜1050 cm ^{− 1} の鋭いピークによる P–O–H伸縮による範囲[44,45,46]ですが、1040 cm ^{− 1} の広くて強いバンド 、PO ₃ の振動に関連付けられています ^2- 鉄の表面に結合した基。 XPSの結果によると、このバンドは、以前に報告されたように、ホスホン酸が脱プロトン化され、P–O–Fe結合によって表面に固定されていることを示しています[34、40、41]。 1500〜1700 cm ^{− 1} のIRスペクトル領域 は、gH625およびFAのアミノ基およびアミド基に属するバンドを示しています。特に、NH ₂ のスペクトル @MNPsは、1650 cm ^{− 1} 付近に鋭いピークを示します NH ₂ に関連付けられています 曲げ[47]。 PEG、Rhod、およびFAアンカー後、1700〜1500 cm ^{− 1} PEG、FA @ MNPsの領域は、未反応のNH ₂ の振動の畳み込みにより、より広いバンドを示します。 、アミド基、およびFAとRhodのベンゼン環（1630–1600 cm ^{− 1} ）[35]。同様に、ペプチド固定後、約1650〜1600 cm ^{− 1} の広いバンド 未反応のNH ₂ によるいくつかの振動の寄与が原因である可能性があります ペプチド側鎖のアミン部分およびペプチドアミド結合のC =Oストレッチ[48]。さらに、約1540 cm ^{− 1} のコンポーネント 結合されたδによる ペプチドの（N–H）/ν（C–N）振動[48]も存在します。

機能化されたMNPのFT-IR特性評価。 850〜1900 cm ^-1 のFT-IRスペクトル領域 a）NH ₂ の範囲 @ MNPs、b）gH625 @ MNPs、およびc）PEG、FA @ MNPs

MNPへのFAの固定は、PEG、FA @MNPsコロイド溶液のUV / Visスペクトルによっても証明されています。図5は、NH ₂ のスペクトルを比較しています。 @ MNPsおよびPEG、FA @MNPsコロイド分散液。 FAソリューションのスペクトル（5μM）が参照として追加されました。 FAに典型的な274nmの明らかなバンドは、参照溶液とPEG、FA @ MNPコロイド溶液の両方ではっきりと見え、MNPにFAが存在することが確認されます。わずかなシフトは、280nmでのFA-NHS吸収からアンカー後の274nmの値へのシフトであり、遊離FA-NHSおよびナノ粒子アンカーFAからの環境の変化が原因である可能性が高いことに注意してください。 FA表面の固定または他の分子との結合後の280nmでの吸収帯の可変シフトの存在は、すでに文献で観察されています[49,50,51]。

機能化されたMNPのUV / Vis特性評価。 5μMFA-NHS溶液およびNH ₂ のUV / Visスペクトル @ MNPs、およびPEG、FA @MNPsコロイド分散液。 NH ₂ のスペクトルで観察された高いバックグラウンドに注意してください。 @ MNPsおよびPEG、FA @ MNPsは、ナノ粒子コロイド分散液の散乱によるものです

機能化されたMNPの平均流体力学的直径、多分散性指数（PDI）、およびゼータ電位は、調製されたMNP分散液および72時間のエージング後に、pH 7.4のPBSバッファー中のDLSによって決定されました（表1）。 NH ₂ の流体力学的直径 -PA @ MNPs、gH625 @ MNPs、およびPEG、FA @ MNPsは、それぞれ73.0±3.0 nm、104.0±4.0 nm、および51±2 nmであり、PDI値は粒子サイズの分布が十分に狭いことを示しています。予想通り、gH625との結合によりナノ粒子のサイズが増加しましたが、PEG、FA @ MNPのサイズの減少は、NH ₂ よりも優れた分散によるものです。 @ MNP、PEGチェーンの存在に関連します。

いずれの場合も、すべてのシステムで非常に負のゼータ電位（<− 30 mV）が観察されたことに注意してください。このような負のゼータ電位値は、長期的な安定性を保証し、広範な粒子の凝集を回避します[52、53]。実際、負の表面電荷はコーティングにわずかに依存していましたが、主にFe ₃ の負に帯電したコアの組み合わせに起因していました。 O ₄ ナノ粒子[54]および同様のシステムで観察されたホスホン酸基の効果[52、34]。したがって、MNPを機能化するために使用される他の合成戦略と比較して、リンカーとしてのホスホン酸単分子層の使用は、表面と官能基の間の安定した結合の形成を可能にするだけでなく、非常に負のゼータ電位を誘発します。 72時間のエージング後、NH ₂ のサイズとゼータ電位 -PA @ MNPs、gH625 @ MNPs、およびPEG、FA @ MNPsはほぼ同じままであり、装飾されたすべての表面が長期間安定していることを示しています。

細胞生存率

gH625 @ MNPおよびFA、PEG @ MNPとインキュベートしたHBMECおよびA-172細胞の生存率を、さまざまなインキュベーション時間で、さまざまな濃度のナノ粒子（10および20μg/ ml）の存在下でMTTアッセイを使用して評価しました。図6に示すように、HBMECおよびA-172細胞に対する装飾システムの濃度および/または時間依存性（24〜48〜72時間）の細胞毒性効果は観察されませんでした。

細胞生存率。 a の細胞生存率 HBMECと b GH625 @MNPs10μg/ ml（黒いバー）、gH625 @MNPs20μg/ ml（赤いバー）、PEG、FA @MNPs10μg/ ml（青いバー）で24、48、72時間インキュベートしたA-172細胞）、およびPEG、FA @MNPs20μg/ ml（マゼンタバー）

細胞内取り込み

gH625ペプチドの細胞透過能力がナノ粒子表面での固定化後に保持されているかどうかを判断し、BBBを通過するgH625とFAの能力を比較するために、NBD標識gH625 @MNPのヒト脳内皮細胞への内在化また、Rhod標識PEG、FA @ MNPは、共焦点レーザー走査顕微鏡で調査されています。

24時間のインキュベーション後、PEG-FA @ MNPの取り込みは明らかではありませんが、gH625 @ MNPの内部移行ははっきりと見えます（図7）。 gH625との結合により、細胞内蛍光の取り込みがより速くなり、強度が2倍近く高くなります（図8）。

HBMECのLSM蛍光顕微鏡写真。 24時間インキュベートしたHBMECのLSM蛍光顕微鏡写真（ b 、 f ）および72時間（ d 、 h ）NBDラベル付きgH625 @MNPs15μg/ ml（ b 、 d ）とそのコントロール（ a 、 c ）またはrhod-labeled PEG、FA @MNPs15μg/ ml（ f 、 h ）とそのコントロール（ e 、 g ）。スケールバー=20μm

細胞内蛍光の正規化された強度。 NBD標識gH625 @ MNPおよびRhod標識FA、PEG @MNPを使用した24時間および72時間のHBMECインキュベーション後の細胞内蛍光の定量分析

長時間のインキュベーション（72時間）では、2つのシステムの内部移行の違いが減少します。長いインキュベーション時間では、FA、PEG @ MNPの非特異的な内在化プロセスが発生する可能性があり、我々の結果は、官能化および非官能化ポリスチレンナノ粒子の取り込みについて以前に報告したことをさらに確認するため、この動作は予想外ではありません[55]。

脳腫瘍の治療薬としてgH625 @ MNPを使用する可能性をさらに調査するために、A-172神経膠芽腫細胞株を使用してgH625 @ MNPおよびFA、PEG @MNPの細胞取り込みを調査しました。膠芽腫は、最も一般的な原発性脳腫瘍の1つであり、最も致命的な癌の1つでもあります。

図9に示すように、24時間のインキュベーション後のgH625 @ MNPとFA、PEG @MNPの細胞取り込みは同等です。

膠芽腫細胞のLSM蛍光顕微鏡写真。膠芽腫細胞のLSM蛍光顕微鏡写真。マージされた青緑色の画像：コントロールセル（ a ）および15μg/ mlのNBD標識gH625 @ MNP（ b ）とインキュベートした細胞 ）。マージされた青赤画像：コントロールセル（ c ）および15μg/ mlのrhod標識PEG、FA @ MNP（ d ）とインキュベートした細胞 ）。 Scale bar = 20 μm

This behavior suggests that the gH625 is capable of targeting brain tumor with the same efficiency of the more often adopted FA targeting unit.

結論

Fe ₃ O ₄ nanoparticles have been functionalized with the gH625 viral cell penetrating peptide adopting a versatile route based on MNP prefunctionalization with a monolayer consisting of a bifunctional phosphonic linker, 3-aminopropylphosphonic acid. The cell internalization capabilities of this system have been evaluated by comparing them with those of a reference system based on MNPs functionalized with PEG, rhodamine, and folic acid, obtained adopting the same NH₂ -PA-based platform. The uptake of the two differently decorated MNPs was assessed in primary microvascular endothelial cells from human brain, which are the main components of the BBB and simulate an in vitro model of the BBB. These surface modifications influence the internalization of MNPs in HBMEC and, therefore, their capability to cross the BBB. In fact, conjugation with the gH625 peptide upgraded the delivery of nanoparticles across the in vitro BBB, leading to significant higher cell uptake in HBMEC after 24 h compared with that of FA bearing MNPs (FA,PEG@MNPs). Note that also other strategies have been used to enhance nanoparticle uptake across the BBB. A common approach is to attach targeting ligands in order to activate receptor-mediated endocytosis. As examples, transferrin-coupling nanoparticles can penetrate into the BBB through a transferrin receptor-mediated process [56]. Analogously, the linkage of the apolipoprotein E to the nanoparticles enhances the BBB penetration [57]. Besides, nanoparticles having a surface charges modified with polyethylenimine (PEI) has been reported to cross the BBB by absorptive-mediated transcytosis [58]. Finally, the ability of MNPs to pass through human brain microvascular endothelial cells, used as an in vitro BBB model, can be also facilitated by an external magnet [59]. In our work, we studied a different approach which use a cell penetrating peptide, the gh625, to improve internalization capabilities of Fe₃ O ₄ nanoparticles. These results are in accordance with those previously obtained by D. Guarnieri et al. using different kinds of MNPs [55, 60] confirming that the gH625-decorated magnetic nanoparticle has a relevant role in crossing the BBB and could be used as a safe and effective drug delivery system.

略語

A-172:

Human glioblastoma cell line

B.E.:

Binding energy

BBB:

Blood-brain barrier

CNS:

Central nervous system

CPPs:

Cell-penetrating peptides

DIPEA:

N ,N -Diisopropylethylamine

DLS:

Dynamic light scattering

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindole

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

FA:

Folic acid

FA-NHS:

Activated form of FA with NHS

FBS:

Fetal bovine serum

Fmoc:

9-Fluorenylmethoxycarbonyl

FT-IR:

Fourier transform infrared spectroscopy

gh625:

20-Residue peptide derived from the glycoprotein H (gH) of the Herpes simplex virus 1

gH625@MNPs:

NH₂ @MNPs functionalized with gh625

HBMECs:

Microvascular endothelial cells from human brain

MNPs:

Magnetic iron nanoparticles

MTT:

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H -tetrazolium bromide

NBD:

4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole

NH₂ @MNPs:

MNPs modified with NH₂ -PA

NH₂ -PA:

3-Aminopropylphosphonic acid

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

PBS:

Phosphate-buffered saline

PDI：

多分散度指数

PEG:

Polyethylene glycol

PEG,FA@MNPs:

NH₂ @MNPs functionalized with FA, Rhod and PEG

PEG-NHS:

Methoxypolyethylene glycol acetic acid N -succinimidyl ester

PEI:

Polyethylenimine

Rhod:

Carboxy-X -rhodamine

Rhod-NHS:

Carboxy-X -rhodamine N -succinimidyl ester

TFA:

Trifluoroacetic acid

XPS:

X-ray photoelectron spectroscopy

XRD：

X-ray powder diffraction