活性酸素種の細胞内センシングのための西洋ワサビペルオキシダーゼカプセル化中空シリカナノスフェア

要約

活性酸素種（ROS）は、細胞のシグナル伝達と恒常性に重要な役割を果たします。 ROSの過剰産生は、さまざまな生体分子や細胞構造に酸化的損傷を引き起こす可能性があります。したがって、生細胞内のROSを監視および定量化できるアプローチを開発することは、生理学および臨床診断にとって重要です。開発されたいくつかの細胞透過性蛍光発生プローブは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）と組み合わせてROSの検出に役立ちます。しかし、それらの細胞内シナリオは、酵素の膜不透過性によって妨げられています。ここでは、十分な触媒活性、細胞膜透過性、および生体適合性を備えた、西洋ワサビペルオキシダーゼでカプセル化された中空シリカナノスフェア（HRP @ HSNと指定）を使用したROSの細胞内センシングの新しいアプローチをマイクロエマルジョン法で調製しました。

これらのHRP @ HSNは、選択的プローブまたはターゲティングリガンドと組み合わせて、特定の細胞小器官または細胞型におけるROS検出ツールとして予測できます。そのため、ジヒドロローダミン123結合HRP @ HSNは、生理学的H ₂の定性および半定量分析に使用されました。 O ₂ 活性化されたRAW264.7マクロファージのレベル。活性酵素をカプセル化するこのHSNは、選択的プローブおよびターゲティングリガンドと結合して、特定の細胞小器官または目的の細胞型のROSを検出できると考えています。

背景

スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素、ペルオキシ亜硝酸などのラジカル分子と非ラジカル分子からなる活性酸素種（ROS）は、好気性代謝中に継続的に生成されます。細胞のROSは主にミトコンドリアの電子伝達系（mETC）から生成され、通常は酵素（スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼなど）と非酵素（例：ビタミンA、C、E、尿酸、ビリルビン）によって相殺されます。）抗酸化防御[1]。ただし、ROS産生の不均衡は、酸化ストレスとそれに続くDNA、脂肪酸、タンパク質、およびその他の細胞成分への損傷を引き起こし、糖尿病[2]、癌[3]、心血管障害[4]、および神経変性障害の一因となる可能性があります。 [5]アルツハイマー病やパーキンソン病など。生細胞での直接イメージングとROS定量化は非常に望ましいですが、非常に困難です。

蛍光顕微鏡の進歩[6、7]により、単一細胞レベルでのROS進化の非侵襲的測定とイメージングの開発が可能になりました。 ROSを検出するために、ほとんどのプローブは、蛍光促進性芳香族分子の酸化またはマスクされた化合物の蛍光生成物への脱保護に続く蛍光強度の変化または発光波長のシフトを測定するように設計されています[8]。成功するプローブを設計する場合、特定のタイプのROSへの特異性が重要です。たとえば、ボロネート酸化は、生体系における過酸化水素の化学を研究するための生体直交反応アプローチとして利用されています[9]。 ROSの時空間ダイナミクスを調べるために、ミトコンドリアを標的とするために、正に帯電したホスホニウム部分と結合したいくつかのボロネートベースのプローブを生成しました[10、11]。ただし、生体内イメージングの可能性は、生物学的環境における不安定性、組織バリアの浸透性の低さ、および泌尿器系を介した体からの急速な排除によって制限されます[12、13、14]。このような問題を克服するために、プローブに追加の安定化構造を化学的にグラフトすること[15]（たとえば、トリエチレングリコール鎖）、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質ベースのインジケーター[16]を開発すること、または反応ベースを適用することによって、いくつかの戦略が開発されました。 ROSの分子イメージング用の生物発光レポーター[17]または陽電子放出断層撮影（PET）プローブ[18]。さらに、いくつかの包括的な研究は、重要な設計上の考慮事項としてナノ製剤を強調し、ナノ粒子ベースのプローブが、高い特異性と感度で生物のROSを画像化するための機構的洞察と革新的な戦略を提供できることを示しました[19、20、21、22]。高い触媒活性と明確な基質選択性を備えた酵素も、標的分析物を同定するための臨床診断ツールとして利用されてきました。しかし、持続的な安定性の欠如と遊離酵素の生体膜を透過することの難しさは、複雑な生物学的環境でのそれらの応用をしばしば制限してきました。電極の適用は細胞内アッセイやinvivoイメージングには適していませんが、H ₂を測定するための西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を組み込んだバイオセンサーの開発に多大な努力が注がれています。 O ₂ 電気化学的方法に基づく[23、24]。

この研究では、45 nmの中空シリカナノスフェアにカプセル化されたHRPで構成される酵素ナノリアクターを、油中水型（w / o）マイクロエマルジョンルートとそれに続く穏やかなエッチングプロセスによって合成しました[25]。以前、このような中空ナノ材料は、カプセル化された酵素とナノ触媒の安定した活性を維持しながら、それぞれタンパク質分解と焼結から保護できることを実証しました[26、27]。この作業では、HRP @ HSNの酵素捕捉効率、負荷容量、過酸化物の反応性と選択性、細胞取り込み、毒性、および増殖効果を研究することにより、細胞内バイオセンサーとしての潜在的な用途を評価しました。細胞内過酸化水素生成を検出するためにHRPと一般的に結合されている基質としてジヒドロローダミン123（DHR123）を使用して、水溶液中のHRP @HSNとさまざまなタイプのROSとの相互作用をフローサイトメトリーと蛍光顕微鏡で調べました。さらに、DHR123でHRP @ HSNを利用すると、生理学的H ₂の画像化と定量化を同時に行うことができることが実証されました。 O ₂ ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）で刺激されたRAW264.7マクロファージのレベル。まとめると、HRP @ HSNの酵素ナノリアクターは、ROS関連の炎症細胞をin vivoでイメージングする可能性があり、カプセル化されたコンポーネントは、複数の異なる酵素[28]、ナノ粒子[26]、および相乗的アプリケーション用の認識分子に拡張できます。

メソッド/実験

化学薬品および試薬

デカン、 n -ヘキサノール（98％）、水酸化アンモニウム（NH ₄ OH、35 wt％）、テトラエチルオルトシリケート（TEOS、98％）、3-アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS、95％）、およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC）異性体はACROSから購入しました。ポリオキシエチレン（5）イソオクチルフェニルエーテル（Igepal CA-520）、HRPタイプVI-A（HRP）、3,3'5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）、クエン酸、ジメチルスルホキシド（DMSO）、およびローダミンBイソチオシアネート（ RITC）はSigma-Aldrichから購入しました。 2-（4-ヨードフェニル）-3-（4-ニトロフェニル）-5-（2,4-ジスルホフェニル）-2H-テトラゾリウムはClontechから購入しました。 DHR123とPMAはCaymanChemicalから購入しました。過酸化水素（H ₂ O ₂ 、35％）昭和化学工業から購入。 tert-ブチルヒドロペルオキシド溶液（H ₂中70％ O）Aldrichから購入しました。過塩素酸鉄（II）（Fe（ClO ₄ ）₂ ）はAlfaAesarから購入しました。超高純度の脱イオン（D.I.）水は、Millipore Milli-QPlusシステムによって生成されました。すべての試薬はさらに精製することなく使用されました。

中空シリカナノスフェア（HSN）の合成

HSNは、以前の研究[25、29]で説明されているように、選択的エッチング法を伴う逆マイクロエマルジョンシステムによって合成されました。通常、油相として20 mLのデカン、界面活性剤として1.63 mLのCA-520、および550μLの n -共界面活性剤としてのヘキサノールを混合し、650rpmで2cmのPTFEコーティングされた攪拌棒で磁気的に攪拌しました。その後、350μLのD.I.室温で水を混合物に加え、油中水型（w / o）マイクロエマルジョンシステムを生成した。次に、25μLのAPTMSエタノール溶液（1.4mLの無水エタノール中の200μLのAPTMS）と100μLのTEOSを攪拌しながら添加しました。 10分間撹拌した後、250μLのアンモニア水（35 wt％）を20°Cで撹拌しながらシステムに導入しました。 10時間後、マイクロエマルジョンシステムを不安定にするために95％エタノールを添加し、11,000 rpmで20分間遠心分離することにより、固体シリカナノ粒子（SSN）を収集しました。 HSNを取得するために、SSNはD.Iで一時停止されました。 40°Cで40分間攪拌しながら水を加えます。次に、HSNを11,000 rpmで20分間遠心分離して収集し、95％エタノールで数回洗浄しました。最後に、HSNを一時停止し、99.5％エタノールに保存しました。

西洋ワサビペルオキシダーゼでカプセル化された中空シリカナノスフェア（HRP @ HSN）の合成

HRP @ HSNは、以前の研究[27、28]に基づく方法で合成されました。通常、合成は上記の手順と似ていますが、350μLのD.I.水を350μLのHRP水溶液（350μLのD.I.水中の10 mg / mLのHRP溶液90μL）に置き換えました。合成後、HRP @HSNはD.I.に保持されました。 4°Cの水。

FITC-HSNとHRP @ FITC-HSNの合成

緑色発光フルオレセイン色素を組み込んだHSNおよびHRP @ HSN（FITC-HSNおよびHRP @ FITC-HSNと指定）は、エタノール性APTMS溶液をFITC-APTMS溶液に置き換えたことを除いて、上記の手順と同様に合成しました。エタノール性FITC-APTMS溶液は、10mgのFITCと200μLのAPTMSを1.4mLの無水エタノールと暗所で18時間室温で混合することにより調製しました。

HRP @HSNのHRP捕捉効率と負荷容量

まず、HRP（500μLのD.I.水に6 mg）とRITC（350μLのDMSOに3 mg）を含む混合物を、暗所で4°Cで24時間撹拌しました。その後、混合物を、分子量カットオフが12〜14kDaの再生セルロースで構成される透析膜に移しました。次に、未反応のRITCを除去するために、透析バッグを1LのD.Iに対して透析しました。水を加え、3日間穏やかに攪拌します。最後に、RITCラベルの付いたHRP（RITC-HRPと指定）を使用して、RITC-HRP @HSNを合成しました。

HRPの負荷容量を決定するために、RITC-HRP @HSNを1mLのNaOH（1 M）に1時間溶解し、閉じ込められたRITC-HRPの量を、蛍光強度とRITC-HRPの濃度。蛍光は、日立F-4500装置を使用して、励起波長543 nm、発光波長550〜650nmで測定しました。 HRP @ HSNのHRP捕捉効率と負荷容量は、次のように定義されました。捕捉効率（％）=RITC-HRPのRITC-HRPの質量/ RITC-HRPの初期質量。および負荷容量=HRP-RITC @HSNsのRITC-HRPの質量/ RITC-HRP @HSNsの質量

HRPアクティビティアッセイ

ペルオキシダーゼ酵素の活性を検出するために、TMBの発色基質を使用しました。 TMBは、過酸化水素を酸化剤として使用してHRPで酸化すると、着色生成物に変換できます。まず、さまざまな濃度のネイティブHRPおよびHRP @ HSNを、リン酸およびクエン酸バッファー（pH 5.2）で調製しました。次に、各溶液に50μLのTMB溶液（DMSO中20μM）と50μLのH ₂を補充しました。 O ₂ （D.I.水中で20μM）。マイクロプレートリーダー（BioTek Synergy Hybrid Reader）を使用して655 nmでの吸光度を測定することにより、反応をモニターしました。 HSNにカプセル化されたHRPのアクティビティは、ネイティブHRPの検量線から計算されました。

さまざまなROSに対するHRP @ HSNの反応性アッセイ

DHR123（20μM）を単独で、またはHRP @ HSN（50μg/ mL）と混合して、100μLのDMEM溶液（pH 7.4）でさまざまなタイプのROS（100μM）とインキュベートしました。最初の120分間は、530 nm（λex=488 nm）での蛍光発光を5分ごとにモニターしました。調査したROSは次のように得られました：過酸化水素（H ₂ O ₂ ）およびtert-ブチルヒドロペルオキシド（TBHP）は、それぞれ市販の32％および70％水溶液から調製しました。スーパーオキシド（O ₂ ^•− ）は、10 mMの超酸化カリウムストック（KO ₂ ）DMEMで。ヒドロキシルラジカル（•OH）とtert-ブトキシラジカル（•OtBu）は、1 mM Fe（ClO ₄ ）₂ 100μMH₂ O ₂ またはそれぞれ100μMTBHP。

細胞培養および生存率アッセイ

RAW264.7マウスマクロファージ細胞株はATCCから入手しました。 RAW264.7細胞は、10％FBS、100 U / mLペニシリン、および100μg/ mLストレプトマイシン（Gibco）を含むDMEMで、37°C、5％CO ₂で維持されました。雰囲気。通常、2×10 ⁵ 生存率アッセイのために、ウェルあたりRAW264.7細胞を24ウェルプレートに播種しました。 24時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、無血清DMEM中のさまざまな量（0、50、100、および200μg/ mL）のナノ粒子懸濁液と2時間インキュベートしました。細胞毒性アッセイでは、ナノ粒子で処理した細胞を培地で2回洗浄した後、WST-1試薬（Clontech）と37°Cで2時間インキュベートしました。増殖アッセイでは、ナノ粒子で2時間処理した後の細胞を、通常の増殖培地で24時間増殖させた後、WST-1試薬とインキュベートしました。細胞生存率は、生細胞によって生成されたホルマザン色素によって決定され、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad、モデル680）を使用して、参照波長650nmで450nmでの吸光度が測定されました。

細胞取り込み分析

1×10 ⁶ のRAW264.7セルウェルごとに6ウェルプレートに一晩播種しました。次に、RAW264.7マクロファージを、無血清DMEM培地中のさまざまな量（0、50、100、および200μg/ mL）のナノ粒子懸濁液で2時間処理しました。その後、細胞をPBSで3回洗浄し、トリプシン-EDTA溶液で剥離した。 RAW264.7マクロファージによるナノ粒子の取り込みをフローサイトメトリーで調べた。トリパンブルーは、細胞の外膜に吸着されたナノ粒子の蛍光を消光するために利用されました。

PMAで刺激されたRAW264.7マクロファージにおけるROS産生のフローサイトメトリー分析

通常、RAW264.7マクロファージをナノ粒子で2時間処理した後、細胞をPBSで3回洗浄した後、無血清DMEMで20μMのDHR123と30分間インキュベートしました。次に、RAW264.7細胞をPBSで洗浄し、さまざまな濃度のPMAを含む培地で1時間インキュベートしました。洗浄後、RAW264.7マクロファージを回収し、FACS CantoIIフローサイトメーターで分析しました。

定量分析

3×10 ⁴ のRAW264.7セル半定量アッセイのために、ウェルあたり96ウェルプレートに播種しました。無血清DMEM中の100μg/ mLのナノ粒子懸濁液50μLと2時間インキュベートした後、ナノ粒子処理細胞を、さまざまな濃度のPMAを含む50μLの無血清DMEMで処理し、さらに20μMDHR123で処理しました。 37°Cで1時間。同時に、H ₂の外部標準 O ₂ 50μg/ mLのHRP @ HSNと混合して、H ₂の濃度に対する蛍光強度をプロットすることにより検量線を作成しました。 O ₂ 。蛍光強度は、マイクロプレートリーダー（BioTek Synergyハイブリッドリーダー）を使用して、励起を488 nm、発光を530nmで測定しました。確立された検量線を使用して、H ₂の量 O ₂ さまざまな量のPMAで刺激されたRAW264.7細胞で計算されました。

特性評価

透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、100kVで動作するJEOLJEM-1200 EXIIで撮影されました。画像はGatanOriusCCDカメラで記録されました。サンプルを95％エタノールに分散させ、カーボンコーティングされた銅グリッドに落とし、風乾して調べました。中空球のHRPを確認するために、ネガティブ染色サンプルを1％酢酸ウラニル水溶液（UA）で1時間攪拌し、遠心分離して残りのUAを除去しました。最後に、サンプルをエタノールに分散させ、イメージングのために銅グリッドに滴下しました。動的光散乱（DLS）およびゼータ電位測定は、Zetasizer Nano ZS（Malvern、UK）で実行されました。 RAW264.7細胞の光学画像は、Zeiss Axio ObserverZ1倒立顕微鏡で取得しました。

結果と考察

HSNとHRP @ HSNの設計と合成

通常、HSNおよびHRP @ HSNは、以前の方法[27、28]に従って、油中水型（w / o）マイクロエマルジョンシステムと組み合わせたアンモニア触媒ゾルゲルプロセスを介して合成されました。スキーム1は、HRP @HSNの合成を示しています。 TEM画像（図1）によると、カプセル化されたHRPがある場合とない場合のHSNの平均直径は45 nmでした（追加ファイル1：図S1）。 UA染色は、HRP @ HSNの内部で電子密度の増加を明確に示しましたが、HRP @ HSNの外部では染色は観察されませんでした（図1b）。これは、HRP酵素がHRP @HSNの内部空洞内に正常に取り込まれたことを示しています。

室温で実行されたDLS測定とゼータ電位分析を表1に示します。DLSデータは、HSNとHRP @ HSNの両方が、流体力学的直径が188±4および184±6 nmの水中（pH〜6.5）で正のゼータ電位を与えることを示しました。それぞれ水中で。ただし、ナノ粒子を無血清DMEMに分散させると、流体力学的直径はHSNでは1767±94 nm、HRP @HSNでは1598±127nmに増加しました。これらは、HSNのわずかな集約を示していますが、それでもメディアで十分に中断されていました。一方、媒体で測定された両方のナノ粒子の負のゼータ電位は、生物学的環境からのイオンと生体分子の一部がナノ粒子表面に吸着された可能性があることを意味しました[30、31]。この条件下で、ナノ粒子の正に帯電した表面は負に帯電した物質で覆われ、静電相互作用によってナノ粒子の凝集を急速に引き起こしました。非特異的凝集を減らし、ナノ粒子のコロイド安定性を促進するために、ウシ血清アルブミン（BSA）が生物学的媒体に導入されました[28]。その後、HSNとHRP @ HSNの流体力学的直径は、それぞれ197±43nmと195±19nmにかなり減少した流体力学的直径を示しました。

<図>

HRP @HSNのHRP捕捉効率と積載量

HRP捕捉の効率と負荷容量を調査するために、蛍光色素（RITC）で標識されたHRPを調製しました（RITC-HRPと指定）。 RITC-HRP @ HSNの蛍光強度は、ナノ粒子を1 M NaOHに懸濁することによって測定され、カプセル化されたRITC-HRPの量は、蛍光強度とネイティブRITC-HRPの濃度をプロットすることによって確立された検量線に従って決定されました。同じ条件下で（追加ファイル1：図S2）。酵素濃度が捕捉効率と負荷容量に及ぼす影響を調べるために、3つの異なる量のHRP（11.1、22.2、および33.3 nmol）を合成に導入しました。この濃度範囲では、導入された酵素の量に関係なく、3つのケースのそれぞれの酵素の捕捉効率は約6％であったことは注目に値します。この低効率は、マイクロエマルジョン液滴のごく一部のみが核形成してHSNに成長したという事実に起因する可能性があります。ほとんどのマイクロエマルジョン液滴は核形成されず、約8nmの小さなサイズのままでした[25]。積載効率を上げるために、今後の作業が必要になる場合があります。ただし、33.3 nmolのHRPを使用した場合、HRP @HSNのHRP負荷容量は徐々に12.5±1.2μgHRP/ mg HSNに増加しました（追加ファイル1：表S1）。これは、HRPの負荷容量が反応に存在する酵素の量によって制御できることを示しています。

HSNおよびHRP @ HSNの細胞毒性および細胞への取り込み

HSNおよびHRP @ HSNのinvitro細胞毒性を評価するために、細胞生存率をWST-1アッセイで調べました。追加ファイル1：図S3に示すように、ナノ粒子を2時間または2時間処理した後、さらに24時間培養した後、RAW264.7細胞増殖に有意な変化は観察されませんでした。 HSN内のHRPの有無に関係なく、示された時点で、シリカナノ粒子によって引き起こされる細胞ミトコンドリア機能への明らかな影響は見られませんでした。

次に、FITC結合HSNとHRP @ HSNをそれぞれ準備して、RAW264.7標識に対するナノ粒子の濃度効果を調査しました。フローサイトメトリーの結果（追加ファイル1：図S4）は、RAW264.7細胞が無血清培地で2時間、異なる濃度のFITC-HSNおよびHRP @ FITC-HSNで正常に標識されたことを示しています。どちらの場合も、用量依存的な標識効率の増加が見られ、RAW264.7細胞の80％以上が、50μg/ mLを超える濃度のナノ粒子に2時間曝露することで標識されました。短いインキュベーション時間での高効率の細胞内標識、比較的低用量のナノ粒子、非細胞毒性などの特性により、HRP @HSNはROSの細胞内検出に適しています。

さまざまなROSに対するHRP @ HSNの反応性

基質としてTMBを使用するHRP酵素活性アッセイによると、最初の酵素活性の約40％は、その後のHSNへのHRPのカプセル化時に残った。カプセル化された酵素の観察された比放射能（単位時間あたりの単位酵素あたりに変換された基質のモル）のこの減少は、基質がHRPに向かってシリカシェルを通過するときに発生する物質移動の制限に起因する可能性があります[32]。それにもかかわらず、カプセル化戦略は追加の機能を提供します。たとえば、多孔質シリカシェルは、反応物や生成物の小分子の輸送を可能にしながら、タンパク質分解からHRPを保護できます[26、27]。まとめると、蛍光プローブ（DHR123）を組み込むことによって評価された、ROSに対するHRP @ HSNの観察された反応性は、ナノ粒子の親和性とROSに対するHRPの固有の特性の組み合わせから生じる可能性があります。

無細胞システムを使用して、過酸化水素（H ₂）を含むさまざまな生物学的に関連するROSを生成しました。 O ₂ ）、TBHP、ヒドロキシルラジカル（•OH）、tert-ブトキシラジカル（•OtBu）、およびスーパーオキシド（O ₂ •⁻ ）。最初に、DHR123をHRPまたはHRP @ HSNの非存在下および存在下でROSのパネルとインキュベートし、続いて生成物ローダミン123（R123）の蛍光強度を測定しました。図2に示すように、使用したROSのタイプに関係なく、蛍光強度は時間依存的に測定されました（30、60、90、および120分）。ただし、さまざまなROS間の強度の明らかな違いは、DHR123の固有の特性に依存します。一方では、以前の研究[33]と一致して、図2aは、どちらもH ₂ではないことを示しています。 O ₂ また、O ₂ •⁻ DHR123をR123に酸化する可能性があります。さらに、DHR123は、他のROSよりも•OtBuおよび•OHラジカルに対して高い反応性を示しました。図2b、cに示すように、HRPの触媒活性により、ネイティブHRPおよびHRP @HSNの存在下で蛍光強度の顕著な増加が観察されました。同じ反応時間でHRP @ HSNと比較してネイティブHRPの場合に見られるより高い蛍光強度は、観察された酵素活性と正の相関があったことが注目されました。

さまざまなROSを直接比較できるように、60分間隔のデータが選択され、コントロールに対して正規化された相対蛍光強度として報告されました（追加ファイル1：図S5）。その後の増強された強度比の分析は、DHR123 + HRPまたはDHR123 + HRP @ HSNの相対蛍光強度をDHR123で割ることによって示されました（図2d）。 HRPを含む両方のケースで、さまざまなROSで強度比が向上するという同様の傾向と、H ₂に対するDHR123の反応性の大幅な増加が見られます。 O ₂ およびO ₂ •⁻ カプセル化されたHRPが高度な固有の酵素活性を示し、HRP @ HSNのシリカシェルが小分子の輸送を可能にして選択的な生体触媒作用を実行できることを示しています。

HRP @HSNによる細胞内ROS検出

細胞内のHRP @ HSNのROS検出機能を評価するために、RAW264.7マクロファージをHRP @ HSNと2時間インキュベートした後、洗浄し、DHR123（20μM）と30分間インキュベートしました。続いて、細胞を洗浄し、PMA（1μg/ mL）でさらに1時間処理しました。マクロファージをPMAで刺激すると、スーパーオキシドが生成され、スーパーオキシドジスムターゼまたは自発的不均化によって過酸化水素に不均化されることが知られています[34、35、36]。したがって、PMAはH ₂を生成する刺激剤として機能することができます O ₂ RAW264.7マクロファージで細胞内H ₂を評価する O ₂ -HRP @HSNの検知機能。図3aに示すように、単独で培養されたRAW264.7マクロファージとHSNとともに培養されたRAW264.7マクロファージの両方のケースは、フローサイトメトリー分析で弱い蛍光を示しました。 HSNの存在。さらに、HRP @ HSNで処理された細胞は、有意な強度の増加を示し（図3a）、送達されたHRP @HSNが細胞内で追加の触媒活性を示したことを示唆しています。

刺激実験の場合、PMA処理細胞は通常、刺激されていない細胞と比較して2倍以上高いレベルのR123蛍光を生成しました。さらに、HRP @ HSNで処理された細胞が最も高いレベルの蛍光を示し、次にHSN、次に細胞のみが続きました。刺激されたRAW264.7マクロファージをHSNで処理すると、コントロールと比較して蛍光強度がわずかに増加することに注意してください。この結果は、細胞ストレス応答が非常に迅速に引き起こされ、ナノ粒子への曝露を含む外部刺激に敏感であることを示唆しました[37]。さらに、PMA（0.1、0.25、0.5、1、および2μg/ mL）とHRP @ HSN（50、100、および200μg/ mL）の両方が、図に示すように、用量依存的にR123の発現を誘導しました。。3b、c。

フローサイトメトリー分析に従って、図3dは、ナノ粒子の存在下および非存在下でPMAを使用した場合と使用しない場合で刺激されたRAW264.7マクロファージの代表的な蛍光画像を示しています。このシステムは、内因性のH ₂を視覚化することができました。 O ₂ RAW264.7細胞で生成され、最も弱い蛍光強度は、HRP @HSNとそれに続くPMA刺激で処理された細胞で観察されました。図4aに示すように、刺激物PMAまたは外因性H ₂の存在下でのRAW264.7マクロファージの細胞生存率 O ₂ WST-1アッセイによって調べた。 ROSはアポトーシスに関与している[38]が、示された時点で細胞生存率への影響はごくわずかであり、以下の半定量分析は実用的で意味のあるものになっています。

H ₂の定量分析のためのinvitroでのHRP @ HSNの適用 O ₂

PMAで刺激されたRAW264.7細胞で生成された内因性過酸化水素を定量化するためのHRP @ HSNの能力を評価するために、外因性H ₂からの検量線 O ₂ 0.625〜15μMの検出範囲での実験は、マイクロプレート測定によって確立されました（図4b、挿入図）。標準の検量線は、予想どおり直線的であるように見えます。次に、RAW264.7細胞を100μg/ mLのHRP @ HSNで2時間処理した後、さまざまな濃度のPMAおよび20μMのDHR123と37°Cで1時間共培養しました。その後、H ₂の濃度 O ₂ PMAで刺激されたRAW264.7細胞によって内因的に生成されたものは、蛍光強度を測定し、確立された検量線を使用して変換することによって決定されました。特に、ほとんどのHRP @ HSNは細胞内に取り込まれたため、H ₂ O ₂ -R123のトリガーされた蛍光は、細胞外の寄与ではなく、細胞内の酵素触媒反応に起因する可能性があります。 H ₂ O ₂ 細胞内での拡散が制限され、酵素が急速に消費されるため、H ₂の濃度勾配により、生体膜全体に拡散することができます。 O ₂ 膜を横切って形成されます[39、40]。通常、通常の生理学的条件下では、H ₂ O ₂ 細胞外濃度は10 ^{− 7} と推定されます〜10 ^{− 6} Mは、細胞外液で観察されるものよりも約10倍高い[1、41、42]。病的状態では、H ₂の細胞外濃度 O ₂ 10〜50μMの範囲であり、さらに10 ^{− 4} まで上昇しますアポトーシスにおけるM [1]。図4bおよび追加ファイル1：表S2に示すように、PMAで刺激されたRAW264.7細胞によって引き起こされる内因性過酸化水素は、用量依存的に生成され、使用されるPMAの濃度が0.25を超えると約10μMのレベルで生成されました。 μg/ mL。まとめると、これらの結果は、HRP @HSNが酸化ストレス条件下でRAW264.7マクロファージの過酸化水素の濃度を半定量的に内因的に検出できたことを示しています。

結論

要約すると、HRPをカプセル化する中空シリカナノスフェアは、マイクロエマルジョンテンプレートシステムを介して合成でき、細胞内蛍光ROSセンサーとして機能することを実証しました。 HRP @ HSNのシェルは、酵素基質などの小分子に対して透過性があり、中空の空洞内の大きな酵素ペイロードと反応することができます。 HRP @ HSNの効果的な細胞内送達と満足のいく触媒活性の両方が、還元によって引き起こされる蛍光を大幅に増強し、内因性H ₂の半定量的測定の能力を構成します。 O ₂ 酸化ストレス条件下のRAW264.7マクロファージで。

H ₂の濃度と位置が O ₂ 真核細胞では、細胞の種類や細胞内コンパートメントに強く依存しており[1]、モノクローナル抗体またはペプチドによるHRP @ HSNの表面修飾により、腫瘍細胞または細胞小器官の特異的標的化をさらに達成できます。また、非酵素的H ₂ O ₂ 検出は、HRPの内部ナノリアクターをナノ粒子[43、44]またはボロネートベースの蛍光プローブ[42、45]に置き換えることで実現できます。今後の取り組みは、H ₂の感度と特異性を最大化することに専念する必要があります。 O ₂ 次世代のナノ材料のより有益な設計を可能にするだけでなく。このような中空カプセルは、治療用分子を同時に画像化し、感知し、欠陥のある細胞に特異的に送達することを目的とした、現代のナノメディシンにとって有望なプラットフォームとなる可能性があります。