ナノ粒子の生物医学応用における毒性：反応性酸素種（ROS）の影響

要旨

ナノ粒子の独自の物理化学的特性は、特に生物医学分野において多様な応用で注目を集めている。しかし、ナノ粒子が過剰な反応性酸素種（ROS）を生成しやしいことから、潜在的な毒性効果への懸念が残っている。強い酸化力を持つ過剰ROSは、生体分子と細胞小器官構造を損傷し、タンパク質酸化カルボニル化、脂質過酸化、DNA/RNA切断、膜構造破壊を引き起こし、さらに壊死、アポトーシス、さらには変異原性をもたらす。本レビューは、細胞レベルでのナノ粒子によるROS生成メカニズムと責任因子を総括し、ROS媒介生物毒性のメカニズムへの洞察を提供することを目的とする。ナノ粒子毒性に関する文献を総括し、生物医学応用に向けたナノ粒子最適化戦略を提案する。

序論

ナノ粒子（NPs）は寸法100 nm未満の新規合成粒子群である。形状とサイズに依存した独自の物理化学的特性により、NPsは多様な機能を発揮する。NPsは繊維、化粧品、浄水、食品包装など多くの消費者製品に広く使用されている[1, 2]。また、光触媒、エネルギー、オプトエレクトロニクスの工学にも用いられている[3-6]。

特に、NPsは生物医学材料として好まれ、バイオセンサー、siRNA送達、標的遺伝子ノックダウン、薬物送達、生体充填医療材料などに広く利用されている[7-11]。NPsの新たな用途は今も発見され続けている。例えば、Duanら[12]はFe₃O₄-ポリエチレングリコール-ポリアミドアミン-マトリックスメタロプロテアーゼ2@クロリンe6（Fe₃O₄-PEG-G5-MMP2@Ce6）ナノプローブが胃腫瘍増殖を有意に抑制することを示した。別の例では、pDNA-ポリエチレンイミンCeOナノ粒子（pDNA-PEI-CeO NPs）が線維肉腫細胞アポトーシスを誘導する[13]。さらに、中空シリカ-Fe-ポリエチレングリコール-ヒト表皮増殖因子受容体2ナノ粒子（HS-Fe-PEG-HER2 NPs）が腫瘍細胞に選択的に結合し、正常組織と癌組織の識別用イメージング剤として機能する[14]。最後に、銀ナノ粒子（Ag NPs）はナノ抗生物質として、耐性菌バイオフィルム関連感染症に効率的に対抗する[15]。

NPsの様々な分野でのポジティブな応用可能性にもかかわらず、増加する研究が生物[16, 17]および細胞[18, 19]への悪影響を示している。NPsの毒性ポテンシャルはサイズと形状に依存し、これが反応性酸素種（ROS）誘導傾向を決定する[20, 21]。過剰ROS生成は、遺伝毒性、アポトーシス、壊死、炎症、線維化、化生、肥大、発癌など多様な病理生理学的結果を誘導する[18, 22, 23]。NPs毒性はまた、プロ炎症性サイトカイン発現を増強し、マクロファージなどの炎症細胞を活性化し、さらなるROS生成を増加させる[23, 24]。NPs曝露後のROS生成増加は細胞機能の変調を誘導し、場合によっては致命的結果を招く[17, 23, 25]。本レビューでは、NPsによるROSバーストの主要メカニズムを論じ、NPs細胞毒性の主因を分析し、NPsの潜在的病原性効果を総括する。本レビューは、ROS過剰生成がNPs生物毒性の主要原因であることを示す圧倒的証拠を提供する。したがって、今後の研究はROS生成を低減するNPs設計により、NPs細胞毒性を低減することを目指すべきである。

生物医学分野におけるNPsの応用

NPsは多様な医療応用に用いられ、いくつかの新規NPsは新規生物医学材料としての有望な特性を示す。表1にまとめると、ナノC60はインビトロおよびインビボでがん細胞増殖を阻害する抗がん剤として使用可能[26]。ZnO NPsは整形外科および歯科インプラントの充填材として使用[38]。TiO₂は抗菌剤、空気・水浄化、歯科補綴に使用[52-54]。Davaeifarらはフィコシアニン-ZnOナノロッドが内因性ROS生成を減少させ細胞を保護することを報告[68]。PacurariらはSWCNTsが臨床診断薬および生体工学材料として応用可能と指摘[88]。さらに、多数のNPsがROSバースト誘導により細菌を殺菌する抗菌剤として使用可能（表1）。

細胞におけるNPs誘導ROS増加のメカニズム

ROSは酸素を含む化学的反応性粒子であり、過酸化水素（H₂O₂）、反応性スーパーオキシドアニオンラジカル（O²⁻）、ヒドロキシルラジカル（•OH）などを含む[92, 93]。ROSは主に小胞体（ER）、ペルオキシソーム、そして最も顕著にはミトコンドリアなどの細胞小器官で生成される[94]。酸化的リン酸化では、ミトコンドリア電子伝達系（ETC）を通じて電子が付加されることで酸素が水の合成に用いられる。これら電子の一部が分子酸素に受け取られO²⁻を形成し、さらにH₂O₂と•OHに変換される[93]。

生理学的文脈では、ROSは酸素正常代謝への自然な応答として生成され[95]、様々な細胞シグナル伝達経路で重要な役割を果たす[96, 97]。DrögeとHolmstromらは、ROSが上皮成長因子（EGF）受容体、Mitogen-activated protein kinase（MAPK）カスケード、転写因子アクチベーター蛋白-1（AP-1）、核因子-κB（NF-κB）など多数のシグナルカスケードを活性化し、哺乳類の成長、増殖、分化過程に関与することを報告[98, 99]。更なる研究で、ROSが創傷治癒[100]、低酸素後の生存[101]、細胞内pHホメオスタシス[102]、自然免疫[103]も制御することが判明した。

しかしながら、NPs曝露後、細胞内ROS生成がROSバースト誘導により急増することがある[20]（表1）。ROSバーストの主なメカニズムは、NPsから放出される金属イオンがミトコンドリア呼吸を障害しROS過剰発現を促進することである[30, 104]。

NPsから放出される金属イオンは、フェントン反応[H₂O₂ + Fe²⁺ → Fe³⁺ + HO⁻ + •OH]やフェントン様反応[Ag⁺ + H₂O₂ + H⁺ = Ag⁺ + •OH + H₂O]を介してレドックスサイクルとケモカタリシスに混入することが示されている[23, 105, 106]。解離金属イオン（例：Ag⁺）はまた、細胞酵素不活性化、膜構造破壊[31, 107]、電子シャトルプロセス撹乱[108]、レドックスポテンシャル枯渇、ミトコンドリア膜電位（MMP）低下[109]を引き起こし、細胞内ROS蓄積をさらに増強する。NPsはまた、電子伝達プロセス撹乱[32, 110]、NADP⁺/NADPH比増加[30]、ミトコンドリア機能阻害[18]により細胞内ROS蓄積を促進する。NPsはさらに、酸化ストレス関連遺伝子（soxS、soxR、oxyR、ahpC）[58]、抗酸化遺伝子（sod1、gpx 1）[111, 112]、NADPH生成関連遺伝子（met9）[30]の発現に干渉する。NPsによる酸化・抗酸化遺伝子発現の不安定化が細胞内ROS蓄積を加速する。

興味深いことに、ROS生成増加は特定のNPsサイズと形状と強く関連している[113, 114]。例えば、TiO₂ NPsは細胞内ROS生成に寄与し、核酸とタンパク質損傷を引き起こす[10]。Liaoらは、10 nm TiO₂ NPsがテストされた他サイズより高い遺伝毒性を持ち、より多くのROS生成を誘導することを発見[115]。別の例では、Se NPsが細胞内ROS生成を促進し、ROS収率がSe NPs直径と高度に関連し、81 nm径が他サイズより多くのROS生成を誘導した[113]。Choらはさらに、NPs形状がROS誘導能に強く影響することを示した。昼花模倣金属ナノ粒子（D-NP）が夜花模倣金属ナノ粒子（N-NP）より有意に高いROS生成を示し、細胞殺傷効果が増強された[114]（図1）。

NPsは極めて低濃度で細胞内ROSバーストを誘導可能（表1参照）、例えばナノC60は1 μg/mLで酸化ストレス誘導により細胞アポトーシスを有意に増加させる[26, 27]。注目すべきは、ほとんどのNPsが用量依存的効果を示すことで、VO₂ NPs[60, 61]やCuO NPs[74, 75]で報告されている。

NPsによるROS過剰生成が細胞にもたらす破滅的結果

細胞内に取り込まれたNPsはしばしば悪影響を及ぼす。NPs細胞毒性の最も支持される説明は、ROSバーストによる酸化ストレス誘導である。NPsによるROSバーストは、生体高分子の酸化的修飾、細胞構造損傷、薬剤耐性獲得、遺伝子変異、発癌をもたらす[116, 117]。さらに、ROSバーストは炎症誘発など正常生理機能を変容させ、最終的に細胞機能を阻害し生物体を損傷する[23, 118, 119]。一般に、NPsはまず細胞表面に吸着し、膜を通過して細胞内に入りROS生成を誘導する[36]。強い酸化力により、ROSは細胞に高ストレスを与え[46]、炭水化物、核酸、不飽和脂肪酸、タンパク質・アミノ酸、ビタミンなどほぼ全ての生体分子を攻撃する[36, 120, 121]（図2）。

ROSによる脂質過酸化と膜構造損傷

脂質、特に不飽和脂肪酸は細胞膜の構造と機能で鍵役割を果たす重要な細胞内高分子である。NPsは細胞膜に強く引き付けられ、そこでROSを生成し外膜脂質過酸化を引き起こす。細胞膜脂肪酸組成の変化は細胞透過性増加を招き、NPsの細胞外環境から細胞質への無制御な輸送をもたらし、細胞損傷がさらに進行する[76, 122]。

細胞内NPsは次のラウンドのROSバーストを誘導する。過剰ROSは細胞小器官膜の破綻、小器官内容物漏出[52, 123]、細胞受容体不活性化[124]、乳酸脱水素酵素（LDH）放出、更なる不可逆的細胞損傷を引き起こす[125]。

ROSによるタンパク質攻撃と機能不活性化

ROSはアミノ酸疎水性残基を攻撃し、ペプチド結合切断を促進しこれらタンパク質機能を阻害する[126-128]。カルボニル化は酸化的損傷を受けたタンパク質のもう一つの特徴である[129]。カルボニル化タンパク質は化学的に不可逆な凝集体を形成し、プロテアソームによる分解が不能となり、これらタンパク質の機能永久喪失を招く[130, 131]。Gurunathanら[132]は、PtNPsがROS生成を増強しカルボニル化タンパク質レベルを上昇させ、骨肉腫増殖を抑制しアポトーシスに寄与することを示した。あるケースでは、燃焼・摩擦由来ナノ粒子（CFDNPs）が若年アルツハイマー病患者の脳に蓄積し、ROS生成を促進しタンパク質誤折りたたみ、凝集、線維化を引き起こした可能性がある[133]。さらに、PelgriftらはMg NPsが遺伝子転写を阻害またはタンパク質を直接損傷する可能性を示唆[10]。

ROS誘導遺伝子変異

DNA、RNAを含む核酸は細胞機能、成長、発育に不可欠であり、その構成ヌクレオチドはROSの脆弱な標的である[134-136]。低レドックスポテンシャルにより、ROSはヌクレオベースと直接反応し修飾する[137]。例えば、ROSはグアニンを8-オキソ-7,8-ジヒドログアニン（8-oxoG）[138]、アデニンを1,2-ジヒドロ-2-オキソアデニン（2-oxoA）[139]に酸化する。これら塩基修飾はDNA損傷を引き起こす[140]。遺伝毒性ポテンシャルとROS生成誘導能により[141]、NPsは単鎖・二重鎖DNA切断[142, 143]、染色体損傷、異数性遺伝子事象を有意に誘導する[144]。

NPs曝露細胞でのROS過剰生成は、遺伝子ミスコーディング、異数性、多倍性、変異原性活性化の主因である[145-148]。ヌクレオチドプール中でグアニンが最も脆弱で、ROSにより容易に8-oxoGに酸化される[149]。DNA中の8-oxo-dGレベル上昇はDNA塩基ミスマッチを引き起こす[150]。同様に、A:8-oxoGの取り込みはG:C → T:A有害転換変異率を増加させる[151, 152]。G:C → T:A転換変異とG:C → A:T転移変異の比率も、酸化的DNA損傷定量の指標として用いられている[153]。

NPs誘導ROS生成によるDNA損傷蓄積は、変異原性[154]、発癌[155]、多剤耐性[156, 157]、老化、免疫逃避[158]の発展を駆動する。Jinらは、ROS過剰生成がDNA結合転写制御遺伝子の変異原性を劇的に増加させ、抗生物質流出を促進し[159]、結果として細菌の多剤耐性を促進することを示した[34]。Giannoniらは、ミトコンドリアDNA変異が細胞内ROS増加とともに発生し、ETC複合体I活性をさらに損傷しミトコンドリア機能不全を招くことを報告[160, 161]。

NPs誘導DNA損傷は、アミノ酸合成、複製[162]を阻害し、p53[163]とRab51タンパク質[82, 142]の異常蓄積を引き起こす。DNA損傷は細胞周期を遅延または完全停止させることもある[164]。DNA損傷細胞は成長増殖能を失い[165]、最終的に細胞死に至る可能性がある[166]（図3）。

ROS過剰生成による細胞損傷と疾患発症

NPs細胞毒性は酸化ストレス、内因性ROS生成、細胞内抗酸化プール枯渇と関連する。酸化ストレス増大は生体高分子への酸化的損傷をもたらし、細胞正常機能に影響を与え、様々な疾患の発症・進展に寄与する[167]。

NPsは膜損傷を誘導しNPsの細胞質への輸送を増強する。NPsはライソソーム、ミトコンドリア、核に集中し、細胞に破滅的結果をもたらす[168, 169]。NPsがアデノシン三リン酸（ATP）生成を減少[89]、グルタチオン枯渇、タンパク質誤翻訳誘導[170]、ライソソーム破綻[171]、リボソームサブユニットのtRNA結合阻害を引き起こすことが報告されている。これら細胞事象は細胞の基本的生物学的プロセスの崩壊を示し、細胞生存率の有意な低下を招く[47]。SinghとScherz-Shouvalらは、NPsがROS生成誘導により細胞骨格機能を撹乱し、細胞のオートファジーとアポトーシスプロセスを活性化することを報告[89]。

NPsは皮膚、肺、腸管など様々な経路で体内に侵入し（図4a）、多様な毒性効果を示し、炎症や免疫応答などの生物学的応答を誘導する[172-174]。あるケースでは、シリカNPs曝露によりマクロファージが大量のインターロイキン-1β（IL-1β）を分泌し、最終的に細胞死を招いた[175]。Gaoらは、カーボンナノチューブ曝露マウスで肺炎症が著しく高まり、肺胞マクロファージ活性化と強い炎症応答誘導を報告[176]。別研究では、ZnO NPs曝露モルモットで肺損傷が生じ、総肺活量と努力肺活量が低下した[177-179]。

ZnO NPsは肺胞上皮バリアに重度の損傷を与え、ヒト肺に炎症を引き起こす[180]。別ケースでは、腸管吸収NPsが腸粘膜の炎症と劣化を誘導[181]。Shubayevらは、Mg NPsがMMP依存的に血液脳関門と血液神経関門を分解し、マクロファージの神経系への遊走を増強することを指摘[182]。さらに、カーボンナノチューブ吸入マウスで免疫抑制とナイーブ脾細胞の抗体応答抑制が観察された[183]。最後に、Cd NPsが血液単球生存率を著しく低下させ、最終的に免疫不全を招いた[184]。

上記病理に加え、高度に変動するROSレベルが多数のヒト疾患発症の主因と同定されている。TretyakovaとLiouらは、酸化DNAがDNA-タンパク質共役体を形成し、心臓と脳に蓄積し、がん、加齢関連疾患、慢性炎症の発症に寄与することを示した[185, 186]。Andersenは、糖尿病、心血管疾患、神経変性疾患がROSアンバランスと高度に関連すると結論[187]。さらに、Pérez-Rosésらは、ROS増加がアルツハイマー病とパーキンソン病発症を促進することを示した[188]。

NPsが乳がん細胞アポトーシスを促進[35]し、ROS生成促進により悪性組織と病原体を破壊することも報告されている[189, 190]。しかし、ROSは正常・癌細胞両方の増殖を誘導し、変異を刺激し、正常細胞での発癌開始と癌細胞での多剤耐性を誘導することも見出されている[191, 192]。Handyらは、カーボンナノチューブ曝露魚で肺肉芽腫と長期曝露で肝腫瘍を観察[193]。一部NPsは心臓、肺、腎臓、肝臓を主標的とする多臓器不全を引き起こす。TiO₂ NPsは体重減少、脾臓病変、呼吸器系血液凝固、肝細胞壊死・線維化、肺胞中隔肥厚を促進する[194, 195]。ある研究では、NPsが幹細胞分化を阻害し臓器損傷を悪化させることも報告[196]。さらに、NPsが精子品質を低下[197]、カーボンNPs曝露精子が受精能と紫ウニ胚発育を阻害することも報告[198]。微生物、藻類、線虫、植物、動物、ヒトへのNPs毒性効果を示す証拠が蓄積している[22, 199, 200]（図4b）。

細胞毒性が低いまたは無い新タイプNPs

NPsは抗菌・抗がん剤など価値ある生物医学特性を持つ（例：[26-28]）。その主作用機序は細胞内ROS生成増加能力であるが、この特性が遺伝子変異、アポトーシス、さらには発癌を引き起こし毒性をもたらす[45, 49, 58]。したがって、必要な特性を保持しつつ過剰ROS生成を回避する新規NPs開発が急務である。最近の研究で、細胞内ROS除去可能な新タイプNPsが報告されている。これらは二クラスに分類される：（1）ROSスカベンジングNPs[77]、（2）追加材料でコーティングし細胞毒性を低減したNPs[87]。

Panikkanvalappilらは、Pt NPsがROS分解によりDNA二重鎖切断を阻害することを示した[201]。別ケースでは、Mn₃O₄ NPsが細胞レドックスを調節し、生体高分子を酸化ストレスから保護[77]。さらに、CeO₂ NPはフリーラジカルスカベンジング能により、細胞と組織を酸化的損傷から保護する新規エージェントである[79, 202]。

H₂O₂はNPs-細胞相互作用の主副産物である。H₂O₂はタンパク質、脂質、核酸など重要生体分子を破壊する。しかし、メルカプトプロピオン酸コートMNPs（MPA-NPs）やアミノ化シリカ（SiO₂-MNPs）で処理した細胞では、このような損傷は観察されなかった[203, 204]。同様に、ポリビニルピロリドン（PVP）コートGOは、非コートGOより樹状細胞（DCs）、Tリンパ球、マクロファージへの毒性が低い。PVP-GOはTリンパ球アポトーシスを減少させ、マクロファージ活性を増加させることが示されている[205]。PtコートAuNRs（PtAuNRs）は従来金ナノロッド（AuNR）の効力を保持し、標的細胞死を誘導しつつROSをスカベンジングし、ROS生成による間接的死から健全な未処理細胞を保護する[87]。

結論と展望

NPsは独自の物理化学的特性（超微小サイズ、大きな表面積対質量比、高反応性）を持つため、多様な応用で高い需要がある。商業目的のエンジニアリングNPsは急増しており、NPsの生物安全性が公衆の注目を集めている。本レビューでは、細胞レベルでのNPsによるROS生成メカニズムと責任因子、生物医学分野におけるROS関連NPs毒性の最近の進展、細胞フレンドリーNPsの新興分野を総括し強調した。NPs誘導ROS生成はサイズ、形態、表面積、組成に関連する。また、ROSは細胞生物学と生物医学で生物学的多機能性を持ち、細胞アポトーシス、生存、分化などの細胞シグナル伝達の主要メディエーターでもある。

しかし、NPs生物安全性を改善し生物医学分野での利用を加速するには、いくつかのボトルネックを克服し、まだ多くの作業が必要である。第一に、NPsのインビトロおよびインビボ生物毒性を効率的に検出するハイスループット法（HTMs）の設計が期待される。HTMsは時間とリソースを節約し、単一システムで複数パラメータを組み合わせ、方法論的・系統的誤差を最小化できる。また、NPs特性と細胞応答の関係を深く理解でき、最適条件特定に役立つ。

第二に、NPs誘導ROS生物毒性に関連する分子・細胞メカニズムはまだ不明確である。NPsによるROS生成メカニズムをさらに探求する需要があり、NPsの化学的・物理的特性を修飾しROS生成を制御するための更なる情報が得られる。これは研究者がエンジニアリングNPsのハザードを低減する新戦略を開発し、生物医学分野での臨床的・商業的翻訳を加速する助けとなる。

最後に、構造的特性によりNPsは複数経路で体内に自由に侵入し、体内蓄積が炎症と免疫応答を誘導し、細胞損傷や死、臓器機能不全を招き、最終的にアルツハイマー病、パーキンソン病、肝炎、異胚形成など多数の疾患発症を刺激する。これら問題はNPsの広範使用とともに差し迫ったものとなっている。