キトサン修飾・酵素応答性中空メソポーラスシリカナノプラットフォームによる標的大腸薬物送達

概要

中空メソポーラスシリカ球（HMSS）に生分解性キトサン（CS）を切断可能なアゾ結合で固定化し（HMSS–N=N–CS）、酵素応答性大腸特異的薬物送達システムを開発しました。ドキソルビシン（DOX）をHMSSの中空腔およびメソポアに非結晶状態で封入し、35.2%という高い担持率を達成しました。in vitro薬物放出試験により、HMSS–N=N–CS/DOXが酵素応答性薬物放出を示すことを確認しました。グラフトされたCSはHMSSの生体適合性と安定性を向上させ、タンパク質吸着を低減します。消化管粘膜刺激性試験および細胞毒性試験により、HMSSおよびHMSS–N=N–CSの優れた生体適合性が示されました。細胞取り込み試験では、大腸酵素混合液で前処理したHMSS–N=N–CS/DOXにおいてDOXの取り込みが明確に増加しました。大腸酵素で処理したHMSS–N=N–CS/DOXは細胞毒性が増強され、そのIC₅₀値は酵素未処理群の約1/3となりました。本研究は、経口大腸特異的薬物送達用メソポーラスキャリアの後続研究の基盤を築くものです。

はじめに

近年、刺激応答性薬物送達システム（DDS）が、標的病変組織への効率的な薬物担持と選択的放出のために広く注目されています[1]。設計された刺激応答性システムは病変部位に到達し、オンデマンドで薬物を放出することで治療効果を高め、早期漏出による副作用を抑制できます。酸化還元電位[2]、pH[1]、酵素[3]、温度や光[4,5]など、内外部のあらゆる刺激が刺激応答性DDSの設計に利用されてきました。中でも酵素は内部刺激として、組織ごとに明確な濃度差を持つため幅広い注目を集めています[6]。

過去20年間、2–50 nmのメソポアを持つメソポーラスシリカ球（MSS）は、巨大な細孔容量と高い比表面積による高い薬物担持能、整然とした細孔構造、容易な表面修飾性、良好な生体適合性から、刺激応答性薬物キャリアとして確立されてきました[7–9]。さらに、メソポーラスシェル構造と中空腔を持つ中空メソポーラスシリカ球（HMSS）ナノ粒子は、中空構造がより多くの薬物を効率的に保持できるため、従来のMSSキャリアより優れています[10,11]。ポリマー[12]、無機ナノ粒子[13]、デンドリマー、生体高分子[14]、大環式化合物ペプチド[15]、脂質[16]など様々なゲートキーパーを用いたMSSベースの刺激応答性ナノキャリアが開発されてきました。機能性キャッピングを施した多数のMSSベースDDSが様々な外部・内部刺激応答性放出を実現していますが、大腸特異的標的薬物送達に応用された例は少数です。

経口薬物送達は投与経路として最も好まれ、シンプルな方法です。大腸特異的標的薬物送達は、クローン病、大腸癌、潰瘍性大腸炎などの大腸疾患治療に極めて魅力的です。しかし、大腸特異的送達には、消化管（GI）内の他部位より水分が少なく吸収表面積が小さいこと[17–19]、胃の強酸性環境が薬物分解を促進し大腸標的送達能を損なうこと[19]などの課題があります。そのため、胃の強酸性条件に耐え、GI管のほぼ中性pH（6–7）でpHトリガー放出を実現するpH依存性DDSがいくつか設計されてきました[20–23]。しかし、小腸（pH 6.8）と大腸（pH 7.4）の酸性度差はわずかであるため、pH応答性DDSで大腸特異的放出を実現するのは困難です。

キトサン（CS）は、β-(1-4)結合したグルコサミンとN-アセチル-D-グルコサミン単位で構成される陽イオン性の生分解性天然多糖類です[24]。生分解性、生体適合性、粘膜接着性、抗菌活性など魅力的な特性から、医療分野で大きな注目を集めています[25–29]。複雑な合成プロセスを経るポリマー、ポリ電解質、超分子と比較して、CSはキチンの完全脱アセチル化により比較的安価かつ容易に入手可能です[30–32]。さらに、CSは細胞間タイトジャンクションを開き薬物吸収を促進することが報告されています[33]。したがって、優れた生体適合性とHMSSのメソポアを塞ぐのに適したサイズを持つCSをキャッピング剤として選択しました。

本研究では、図1に示すように、HMSS材料ベースの大腸特異的酵素応答性DDS（HMSS–N=N–CS）を初めて設計しました。HMSSキャリアは選択的エッチング法で調製しました。ポリマーCSをアゾ結合でHMSS表面に固定化し、HMSSの開口部を塞ぐゲートキーパーとして機能させます。HMSSとCS間のアゾ結合は大腸部位の酵素で切断可能[34,35]であり、CSがHMSS開口部から離脱することで薬物放出が起こります。モデル薬物としてDOXをHMSS空腔に封入し、大腸酵素存在下でのin vitro薬物放出実験で酵素応答性放出を評価しました。共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）とフローサイトメトリー（FCM）でCaco-2細胞への細胞取り込みを調べ、HMSS–N=N–CS/DOXのCaco-2細胞に対する細胞毒性を測定しました。

材料と方法

材料

テトラエトキシシラン（TEOS）、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）、キトサン（DAC ≥ 95%）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）、アゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸、臭化カリウム（分光純度、≥ 99.5%）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、DOXはAladdin Chemical Inc.（上海、中国）から購入。アゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸はInno-chem Technology Co. Ltd.（北京、中国）から供給。細胞培養用培地DMEM、ペニシリン・ストレプトマイシン、胎児牛血清（FBS）はGIBCO, Invitrogen Co.（カールスバッド、米国）から供給。全ての分析試薬は精製せずそのまま使用。

HMSS–N=N–CSの調製

HMSS–NH₂の調製

HMSSナノ粒子は選択的エッチング法に基づき調製[36]。まず、改良ストバー法で固体シリカ球を合成。簡潔に述べると、TEOS 6 mLを脱イオン水10 mL、エタノール74 mL、濃アンモニア水3 mLの混合液に加え、室温で60分攪拌してコロイドシリカ懸濁液を得た。固体球を遠心分離、洗浄、乾燥し次工程用に保存。次に、メソポーラスシリカシェルを固体シリカ球上に形成。固体シリカ300 mgを脱イオン水50 mLに分散し、45分超音波処理。この懸濁液をエタノール60 mL、CTAB 450 mg、水90 mL、アンモニア水1.7 mLの混合液に加え、60分攪拌後、TEOS（0.75 mL）を添加。さらに6時間攪拌後、遠心分離してサンプルを回収し、水40 mLに再分散。Na₂CO₃約1.2 gを激しく攪拌しながら添加。55℃で12時間維持後、HMSSナノ粒子を回収し、無水エタノールで洗浄。HMSSとAPTESの比を4:1（m/v）とする後グラフト法で、N₂雰囲気下80℃で8時間反応させHMSS–NH₂を調製。CTABはリフラックスで除去[3]。

HMSS–N=N–COOHの調製

アゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸（50 mg）をpH 5.8 PBSに溶解。EDC（5 mg/mL）とNHS（3 mg/mL）を添加し、30℃で1時間活性化。HMSS–NH₂（15 mg/mL）を含むPBS 10 mLを加え、24時間攪拌。生成したHMSS–N=N–COOHを遠心分離し、エタノールで洗浄。

HMSS–N=N–CSの調製

CS 0.15 gと酢酸0.5 mLを水50 mLに溶解しCS溶液を調製。HMSS–N=N–COOH 100 mgをpH 5.0 PBS 25 mLに分散し、EDCとNHSで0.5時間活性化。CS溶液（10 mL）を注ぎ、1日間連続攪拌。最後に合成されたHMSS–N=N–CSを遠心分離・洗浄してサンプルを回収。

大腸酵素混合液の微生物叢からの抽出

大腸微生物叢を文献[37]に従って採取。37℃で培養し、大腸微生物叢が分泌する酵素混合液を得た。シミュレート大腸培地（酵素混合液含む）を0.22 μmフィルターで濾過し、培養液から全ての細胞デブリを除去。濾液を凍結乾燥し、粉末状の酵素混合液を得て今後の研究に使用。

薬物担持プロセスと酵素応答性放出

DOX 25 mgをpH 3.5塩酸溶液5 mLに溶解。HMSS–N=N–CS 100 mgをこのDOX溶液に加え、室温で12時間攪拌。その後、0.2 M NaOH溶液で混合液のpHを7.0に調整し、さらに12時間攪拌。DOX担持HMSS–N=N–CS（以下HMSS–N=N–CS/DOX）を遠心分離・洗浄し、表面吸着DOXを除去。各工程の上清を回収し、UV-Vis分光光度計で480 nmにおけるDOX担持効率（LE）を測定。HMSS–N=N–CSに担持されたDOX総量は、薬物担持工程後の未担持DOXを初期添加DOX量から差し引いて算出。対照としてHMSSを初期キャリアとしたHMSS/DOXを調製。DOXのLEは以下の式で計算：

$$ \mathrm{LE}\ \left(\%\right)=\frac{m_A-{m}_B}{m_A-{m}_B+{m}_C} \times 100 $$

ここで、m_Aは添加DOX質量、m_Bは上清中のDOX質量、m_CはHMSS–N=N–CSの総質量。

HMSS–N=N–CS/DOXからのin vitro酵素応答性DOX放出を以下のように評価。HMSS–N=N–CS/DOXおよびHMSS/DOXナノ粒子2 mgをpH 7.4 PBSに分散し、125 rpmで振盪、大腸酵素混合液を異なる濃度（0、0.3、1 mg/mL）で添加。決められた時間間隔で1 mL放出培地を採取し吸光度測定。DOX放出を480 nmで測定。HMSS/DOXを対照とした。

BSA吸着

BSA吸着量を文献[38,39]に基づき評価。BSAをpH 7.4 PBS（0.5 mg/mL）に溶解。HMSS、HMSS–NH₂、HMSS–N=N–CS各5 mgをpH 7.4 PBS 2.5 mLに添加。同量のBSA溶液を加え、100 rpmでシェイク。6時間後、遠心分離で上清を回収。クーマシーブリリアントブルー染色後、595 nmでBSA濃度を測定。

キャラクタリゼーション

HMSSナノ粒子のメソポーラス網目構造と形態をTEM（EM–208S, CSIS, USA）で観察。比表面積と細孔径分布を窒素吸着分析装置（V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, 中国）で測定。ζ電位と粒子径をナノサイザー（Nano-z90, Malvern Instruments Ltd., UK）で測定。TGA分析をTGA-50装置（島津製作所, 京都, 日本）で昇温速度10℃/分、窒素フロー下で実施。フーリエ変換赤外分光（FT-IR）スペクトルをFT-IR分光計（Bruker Tensor27, スイス）でKBrペレット法、400–4000 cm⁻¹の範囲で測定。粉末XRDをX線回折装置（Siemens D5005, カールスルーエ, ドイツ）でCu-Kα線（λ = 1.5418 Å）を用いて実施。

細胞培養と細胞取り込み実験

Caco-2細胞を10% FBS、1%非必須アミノ酸、1%（v/v）ピルビン酸ナトリウム、1%ストレプトマイシン添加培地で培養。NIH-3T3細胞を1%ストレプトマイシン、10% FBS含有DMEMで培養。ナノキャリアのCaco-2細胞取り込みをFCMとCLSMで評価。Caco-2細胞を24ウェルプレートに播種し、一晩培養後、フリーDOX、HMSS–N=N–CS/DOX、大腸酵素で前処理したHMSS–N=N–CS/DOX（DOX濃度5 μg/mL相当）を各ウェルに添加。さらに2時間インキュベート後、培地を除去しPBSで十分洗浄。4%ホルムアルデヒドで固定し、Hoechst 33258で染色してCLSM観察。FCMで定量的評価。Caco-2細胞を6ウェルプレートに播種し24時間培養。PBS洗浄後、フリーDOX、HMSS–N=N–CS/DOX、大腸酵素で前処理したHMSS–N=N–CS/DOX（DOX濃度5 μg/mL相当）を無血清DMEMで2時間インキュベート。冷PBSで洗浄、トリプシン化、0.5 mL PBSに再懸濁。FACS Cantoフローサイトメーター（Becton, Dickinson, USA）で細胞内DOX蛍光を測定。

in vitro細胞増殖アッセイ

MTTアッセイ[40,41]でHMSSとHMSS–N=N–CSブランクキャリアのNIH-3T3細胞とCaco-2細胞に対する細胞毒性を評価。Caco-2細胞とNIH-3T3細胞を別々に96ウェルプレートに播種し一晩培養。古い培地を、様々な濃度のナノ粒子を含む無血清培地に置換。2日間インキュベート後、MTT溶液（2 mg/mL）50 μLを添加し4時間インキュベートして生存細胞を測定。MTT溶液を除去し、DMSO 150 μLを添加してフォルマザンを溶解。マイクロプレートリーダー（Tecan, Männedorf, スイス）で570 nm吸光度を測定。フリーDOX、HMSS–N=N–CS/DOX、大腸微生物叢由来酵素混合液で前処理したHMSS–N=N–CS/DOXのCaco-2細胞に対する細胞毒性を、対応するDOX濃度（0.1, 1, 5, 10, 20 μg/mL）で測定。インキュベーション時間48時間、その他の実験手順は上記と同様。

毒性試験

消化管粘膜刺激性試験は、経口薬物送達のin vivo生体安全性評価に不可欠。雄スプラグ・ドーリー系ラット（180 ± 10 g）を3群（各群3匹）に無作為割付。生理食塩水、HMSS、HMSS–N=N–CSナノ粒子を1日1回、100 mg/kgの用量で経口投与。7日後、全ラットを安楽死させ、組織を採取し病理組織学的検査（H&E染色）を実施。HMSSとHMSS–N=N–CSナノ粒子の生体安全性を評価するため、BALB/cマウス（18–20 g）に隔日100 mg/kgで経口投与し、体重変化を記録。全実験手順は齊齊哈爾医科大学の実験動物飼育使用指針に従い、同大学倫理委員会の承認を得て実施。

統計解析

統計データをSPSSソフトウェアで両側Studentのt検定により解析。エラーバーは標準偏差（SD）を示す。p < 0.05を統計学的有意と判定。

結果と考察

HMSS–N=N–CSの調製とキャラクタリゼーション

HMSSは先行研究[36]に基づき微修正を加えて調製。まず固体SiO₂ナノ球を調製し、CTABテンプレートを含む固体シリカナノ球表面にメソポーラスシェルを被覆。次にNa₂CO₃で固体SiO₂ナノ球を選択的にエッチングし、CTABテンプレートで保護されたメソポーラスシェルを残留させた。CSをアゾ結合で「ゲートキーパー」として固定化したHMSS–N=N–CSの調製過程を図1aに示す。まず、HMSSナノ粒子表面をアルキルカップリング試薬APTESで修飾し、後修飾法でアミノ基修飾HMSS（HMSS–NH₂）とした。次に、HMSS–NH₂のアミノ基とアゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸のカルボキシル基とのアミド結合反応でHMSS–N=N–COOHを調製。さらに、HMSS–N=N–COOHのカルボキシル基とCSのアミノ基とのアミド結合反応で、CSをHMSSナノ粒子表面に共有結合固定化した。

図1aの透過型電子顕微鏡（TEM）像より、HMSSの平均直径は280 nm、均一な中空構造と高秩序メソポーラスシェルを持つことがわかる。メソポーラスシェルの平均厚さは約90 nm。HMSSの滑らかな表面に対し、グラフトポリマーHMSS–N=N–CS（図1b）の表面は粗く、CSがHMSSキャリアを覆っていることを示唆。

メソポーラス材料の比表面積と細孔分布は、担持分子のロードと制御放出に重要な役割を果たす。N₂吸着脱離分析で細孔径分布曲線と等温線を測定（図2）。詳細パラメータ（BET比表面積（S_BET）、全細孔容積（V_P）、細孔径分布（D_P））を表1に示す。純粋HMSSのS_BETとV_Pはそれぞれ810.7 m²/gと0.969 cm³/g、D_Pは約3.8 nm。アミノ基修飾後のHMSS–NH₂のD_PはHMSSとほぼ同一で、アミノ基修飾後もメソポアが塞がれていないことを示す。アゾ化合物修飾とCS被覆後、HMSS–N=N–CSのS_BETとV_Pが著しく減少し、CSがHMSS表面を被覆したことを示す[1]。

HMSS–N=N–CSのグラフト成功を複数の手法で検証。HMSS–NH₂のζ電位は官能基化により−27.9から+31.4 mVへ大きく変化（図3a）、表面へのアミノ基導入に起因。HMSS–NH₂がアゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸と反応しHMSS–N=N–COOHになると、表面のカルボキシル基によりζ電位が−2.0 mVまで低下。さらにCSポリマーをグラフトしてHMSS–N=N–CSとなると、アミノ基豊富な正電荷CS被覆によりζ電位が+32.4 mVに戻る[1]。HMSS、HMSS–NH₂、HMSS–N=N–COOH、HMSS–N=N–CSの熱重量分析（TGA）曲線を図3bに示す。HMSS–N=N–COOHと比較し、HMSS–N=N–CSは約19%の追加重量減少を示し、これはCS鎖の除去に対応。HMSS–N=N–COOH調製時の色変化（図3bインセット）もアゾ結合グラフトを裏付ける。反応物HMSS–NH₂は白色だが、生成物HMSS–N=N–COOHはアゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸がHMSS–NH₂のアミノ基と反応して黄褐色になる。HMSS、HMSS–NH₂、HMSS–N=N–CSの水中での動的水力学的直径（D_H）と多分散性指数（PDI）を図3cに示す。HMSSの直径309 nm、PDI 0.190。アミノ基導入でHMSS–NH₂はD_H 324 nmに増加。HMSS–N=N–CSは342 nmでHMSS–NH₂より大きく、グラフトCS鎖によるもの。HMSS–N=N–CSのPDI（0.177）はHMSS–NH₂より小さく、CSグラフト後により均一な粒子径分布になったことを示す。TEMから得られた乾燥粒子径と比較し、DLSで測定された水和層を含む水中での直径の方が大きいのは当然[3]。HMSS–NH₂、HMSS–N=N–COOH、HMSS–N=N–CS、CSのFT-IRスペクトルを図3dに示す。HMSN–NH₂と比較し、2853および2925 cm⁻¹の吸収ピーク増加は、カルボキシル末端アゾ結合グラフトにおける−CH₂振動に帰属。CS添加後、1660 cm⁻¹と3435 cm⁻¹の吸収ピーク増加は、アミド帯のυ_(C=O)とCS中のN–H振動に帰属。全結果がHMSS–N=N–CSの成功調製を証明。

DOX、HMSS–N=N–CS、HMSS–N=N–CS/DOX、物理混合物（PM）のXRDパターンを図4に示す。

薬物の状態と担持効率

DOXを用いてHMSS–N=N–CSのロードと放出挙動を調査。HMSS–N=N–CSナノ粒子懸濁液のpHを3.5に調整すると、CSのpK_aが6.3であるため酸性環境下でアミノ基がプロトン化し、CSバイオポリマーが正電荷を帯びて膨潤し、CS電荷間の反発相互作用によりHMSSのメソポアが開口[24]。これによりDOXが拡散によりHMSS–N=N–CSのメソポア内に取り込まれる。しかし、薬物担持混合液をpH 7.4に調整すると、CS鎖が脱プロトン化し収縮してDOXの早期放出を阻止。

HMSS–N=N–CS/DOXのLEは35.2%で、他のDOX担持メソポーラスシリカ送達システム[3,16]より遥かに高い。この高LEは、中空腔、巨大比表面積、メソポーラス網目構造が薬物貯蔵庫として機能するため。HMSS–N=N–CS/DOX中のDOX物理状態を粉末X線回折（XRD）で評価。XRDプロファイル（図4）より、生DOXは特徴的で強い結晶性回折ピークを示す。HMSS–N=N–CSとDOXの物理混合物（PM）も明確な結晶性回折ピークを示す。一方、HMSS–N=N–CS/DOXは明確な結晶ピークを示さず、HMSSのメソポーラス構造の制約によりDOXが非結晶状態で存在することを証明。

シミュレート大腸環境でのin vitro酵素応答性放出

HMSS–N=N–CSの酵素応答性放出を調べるため、HMSS–N=N–CS/DOXとHMSS/DOXナノ粒子を、異なる濃度の大腸酵素混合液を含むpH 7.4 PBSに添加。図5aに示すように、HMSS–N=N–CS/DOXはpH 7.4 PBS中でDOXを緩やかに放出し、24時間での累積放出率は約10%のみ、CSポリマーとアゾ結合の優れたキャッピング能力を示す。希薄酵素存在下では累積放出率が20%以上に向上。濃縮酵素存在下では劇的に増加し、約40%に達した。対照的に、HMSS/DOXからのDOX放出は酵素の有無で類似傾向を示した。比較的低い放出率は、負電荷HMSSと正電荷DOX間の静電相互作用によるもの[42]。以上より、HMSS–N=N–CS/DOXからのDOX放出は、大腸領域の微生物叢由来酵素により著しく加速される。酵素応答性放出メカニズムは、HMSS–N=N–CS中のアゾ結合が酵素で分解され、CSがHMSS表面から離脱し、HMSSからの速やかな放出が生じることによる。アゾ結合は大腸微生物叢分泌酵素で切断されることが報告されている[34,35]。

さらに、模擬消化管環境でのHMSS–N=N–CS/DOXの酵素応答性放出を評価するため、HMSS–N=N–CS/DOXナノプラットフォームを最初に模擬胃液（SGF）で2時間、次に模擬腸液（SIF）で6時間分散させ、最後に1 mg/mL抽出酵素を含むpH 7.4 PBSに添加。図5bに示すように、模擬胃液中ではDOX放出が比較的速く、2時間で累積量15%に達した。これは酸性条件下ではHMSS–N=N–CSとDOXの相互作用が中性条件より弱いため[1]。その後、SIF中で2–8時間はDOX放出が遅くなった。しかし、抽出酵素を含むpH 7.4 PBSでインキュベートすると、DOX放出が再び著しく増加し、24時間で累積放出量50%以上に達した。HMSS–N=N–CS/DOXからの不完全なDOX放出は、正電荷DOXと負電荷HMSS間の強い相互作用によるもの。

HMSS–N=N–CSのタンパク質吸着と安定性

経口投与では、ナノキャリアの表面特性が薬物放出挙動と生体吸着に必然的に影響する[43]。表面タンパク質吸着アッセイで、HMSS表面へのグラフトCSの効果を評価。図6aに示すように、ベアHMSSナノキャリアは最大16.5%の劇的なBSA吸着を示し、これはHMSSの巨大比表面積と中空腔、強い吸着能、シラノール基とBSAの非特異的相互作用に起因[38,39]。HMSS–NH₂も同様に10.2%の比較的高いBSA吸着を示した。しかし、ポリマーCSを被覆として添加後、表面吸着BSA率が2.5%まで著しく低下し、HMSS–N=N–CSのin vivo挙動への影響を大幅に低減。HMSS–N=N–CSとHMSSサンプルの安定性をさらに観察するため、各20 mgをpH 7.4 PBSと脱イオン水に添加。図6bに示すように、水中では両者とも比較的安定だが、pH 7.4 PBS中ではHMSSが速やかに凝集沈殿。対照的に、親水性CSポリマーをグラフトしたHMSS–N=N–CSの分散性は明確に向上。さらに、HMSS–N=N–CSキャリアはpH 7.4 PBS中で12時間以上沈殿なしで安定維持。これらの結果は、親水性CSポリマー被覆がHMSS–N=N–CSの分散性向上と表面タンパク質吸着低減をもたらすことを証明。

細胞取り込み

ヒト上皮性大腸腺癌細胞であるCaco-2細胞は、経口薬物送達のモデル細胞として広く使用される。図7aに示すように、フリーDOXでインキュベートしたCaco-2細胞は、正電荷DOXが細胞内に入り核に到達するため、DOX由来の比較的強い蛍光信号を示した。対照的に、HMSS–N=N–CS/DOX群はHMSS–N=N–CS/DOXからの不完全な薬物放出により、より弱い蛍光信号強度を示した。しかし、HMSS–N=N–CS/DOXを大腸酵素混合液で1時間前処理すると、著しく蛍光信号が増加した。これは酵素混合液によりアゾ結合が切断され、HMSS表面からCSが除去されたことで、HMSS–N=N–CS/DOXからのDOX放出が著しく加速されたため。HMSS–N=N–CS/DOXと酵素処理HMSS–N=N–CS/DOXの細胞取り込み差を定量評価するためFCMを実施。図7bに示すように、HMSS–N=N–CS/DOX群の平均蛍光強度（MFI）は124.7で、フリーDOX群より弱く（p < 0.001）。興味深いことに、大腸酵素混合液で1時間前処理したHMSS–N=N–CS/DOXではMFIが357まで著しく増加し、フリーDOX群を上回った。これはアゾ結合切断による薬物放出加速に起因。これら全ての結果は、HMSS–N=N–CS/DOX中のアゾ結合が大腸酵素存在下で切断され、HMSS表面からCSが脱離し、HMSSからのDOX放出が加速されることを示している。

in vitro細胞生存率評価

シミュレート大腸条件下でのHMSS–N=N–CS/DOXの酵素応答性放出効果を証明するため、Caco-2細胞を用いたin vitro細胞生存率アッセイを実施。古典的抗癌剤DOXを使用。このアッセイに先立ち、ブランクHMSSとHMSS–N=N–CSを異なる濃度（10–250 μg/mL）で用い、MTTアッセイ[44,45]によりCaco-2細胞と正常NIH-3T3（マウス胚線維芽細胞）に対するナノプラットフォームの生体適合性を確認。図8a,bに示すように、HMSSとHMSS–N=N–CSは様々な濃度でCaco-2細胞またはNIH-3T3細胞とインキュベート後、無視できる細胞毒性を示し、100 μg/mLの高濃度でもCaco-2細胞生存率はそれぞれ87.9%と88.3%で、HMSSの高い薬物担持能を考慮すれば臨床応用に十分なレベル。また、NIH-3T3細胞をHMSSとHMSS–N=N–CSで48時間インキュベートしても、100 μg/mLの比較的高濃度で細胞生存率80%以上を維持。これらの結果は、HMSSとHMSS–N=N–CSが細胞適合性を持ち、経口送達に利用可能であることを示す。

DOX担持ナノキャリアHMSS–N=N–CS/DOXのCaco-2細胞生存率への影響を図8cに示す。フリーDOXは4T1細胞に対し強い濃度依存性細胞毒性を示し、これは正電荷フリーDOXが4T1細胞膜を容易に通過するため。SPSS Statisticsソフトウェアで算出したフリーDOX群のIC₅₀値は10.18 μg/mL。対照的に、HMSS–N=N–CS/DOXは同DOX濃度でより高い細胞生存率を示し、これは負電荷HMSSキャリアと正電荷DOX間の強い静電相互作用によるDOXの不完全放出に起因。HMSS–N=N–CS/DOX群のIC₅₀値は32.22 μg/mLで、フリーDOXより遥かに高い。しかし、濃縮大腸酵素で前処理したHMSS–N=N–CS/DOXは明確な濃度依存性細胞毒性を示し、IC₅₀値は9.41 μg/mLと、HMSS–N=N–CS/DOX群より遥かに低い。これは大腸酵素がHMSS–N=N–CS中のアゾ結合を分解し、グラフトCSがHMSS表面から脱離し、HMSSキャリアからDOXが速やかに放出されるためと考えられる。

毒性試験

HMSS–N=N–CSの危険性評価は、将来の臨床応用前に考慮すべき重要な要素。H&E染色による消化管粘膜刺激性試験は、経口投与用送達システムのin vivo生体安全性評価に不可欠（図9a）。生理食塩水群と比較し、HMSS群とHMSS–N=N–CS群の両方で、100 mg/kg用量で1週間経口投与後、顕著な病理組織学的変化や充血は認められなかった。実験期間中、ラットの死亡や異常行動は観察されなかった。体重減少はin vivo全身毒性の重要かつシンプルな指標と広く見なされている[46]。図9bに示すように、HMSS群とHMSS–N=N–CS群のマウス体重は生理食塩水群と同様にわずかに増加。以上の結果は、HMSSとHMSS–N=N–CSが経口投与用薬物キャリアとして優れた生体適合性を示すことを証明。

結論

要約すると、生分解性CSをアゾ結合でHMSS開口部にゲート固定化し、酵素応答性大腸特異的薬物送達を実現しました。DOXはHMSSの中空腔とメソポアに非結晶状態で担持され、35.2%という高い担持効率を達成。安定性とBSA吸着結果は、CSゲートがHMSSの生体適合性と安定性を向上させることを示唆。in vitro放出結果は、HMSS–N=N–CS/DOXが大腸酵素存在下で酵素応答性薬物放出挙動を示すことを証明。CLSM取り込みとFCM結果は、大腸酵素混合液でインキュベート後、HMSS–N=N–CS/DOXのDOX細胞取り込みが明確に増加することを示唆。細胞生存率結果は、HMSS–N=N–CS/DOXを大腸酵素で処理すると細胞毒性が増強され、IC₅₀値がHMSS–N=N–CS/DOXの32.22 μg/mLから9.41 μg/mLへ明確に低下することを示しました。