丸い形の金ナノ粒子：シロイヌナズナの根の成長に対する粒子サイズと濃度の影響

背景

今日、現代の化学と工学は、特別な用途だけでなく、ますます日常消費の製品において物質の有用性を改善するために、大量のナノオブジェクトを生み出しています。ナノ構造材料、すなわち、ナノ粒子[1、2]、ナノロッド[3]、ナノチューブ[4]、不織布ナノテキスタイル[5]は、さまざまな種類の支持体に立っているか取り付けられているため、さまざまな産業用途のほぼすべての分野で歩留まりが大幅に向上します。化粧品[6]やヘルスケア[7]、バイオエンジニアリング[8、9]、エネルギー変換アプリケーション[10]、触媒[3]まで。これらの製品にナノマテリアルを含めることで性能を向上させることができますが、耐用年数の終わりに分解すると、合成NPが環境に侵入するためのいくつかの重要なポイントが提供されます。触媒、UV保護染料安定剤、繊維産業の抗菌剤、またはヘルスケア製品や化粧品（特にAu、Ag、Pt、Pdなどの化学的に不活性の高いもの）で広く使用されている特に設計されたNPは、それらは何年もほとんど変わらずに環境に蓄積する可能性があり、植物の取り込み時にこれまで知られていなかったプロセスを引き起こす可能性があるため、特別な注意が必要です。貴金属ナノ粒子（NMNP）に関しては、シロイヌナズナ（ Arabidopsisthaliana ）の実生に対する銀ナノ粒子（AgNP）の影響に関する先駆的な研究がいくつか発表されています。 ）、非常に低濃度のAgNP（<1 ppm）が実生に有毒である可能性があることを示しています[11]。 20〜80 nmのAgNPは明らかに成長を阻害し、その植物毒性は濃度と粒子サイズに依存します。一次根がAgNPに曝露されると、根端（キャップ​​とコルメラ）が薄茶色に変わることが観察されました。茶色の先端は、AgNP自体の吸着、または細胞壁材料または根の先端によって生成される二次代謝産物との組み合わせによるものでした。ただし、正確なメカニズムはまだ解明されていません。

環境におけるNPの役割に取り組むいくつかの研究がありますが[12]、金ナノ粒子（AuNP）を標的とする研究はまだまれです[13]。利用可能な場合、ナノ毒性に関する公開データの大部分は、哺乳類の細胞毒性[14,15,16]または動物や細菌への影響[17,18,19,20]に焦点を当てており、工学的毒性を考慮した研究はごくわずかです。植物へのNP。さらに、NMNPと植物および藻類などの植物細胞と類似性を共有する他の生物との相互作用は、これまで十分に研究されておらず、植物細胞に対するNMNP曝露の一般的な結果は依然として不明である[11]。これらのデータが不足していると、NMNPがさまざまな食物連鎖レベルでどのように転送および蓄積されるかについての理解が不十分になります。

この作業では、植物の成長、特に Aの一次および側根の発達に対する金ナノ粒子の影響について報告します。タリアナ 異なるサイズの粒子の存在下で。 AuNPは、安定剤を使用せずに生物学的に優しいプロトコルの下で湿式法によって合成され、サイズとサイズ分布を正確に制御する球状ナノ粒子を生成しました。植物処理の前に、AuNPは広範囲の分析方法（AAS、ICP-MS、DLS、およびTEM）によって徹底的に特徴付けられました。

実験的

材料、装置、および手順

金ナノ粒子は、Batúsらによって公開されたわずかに適合した手順によって合成されました。 [20]。簡単に説明すると、149mLの水を250mLの2つ口丸底フラスコで、還流が始まるまで加熱しました。次に、1mLの0.33Mクエン酸ナトリウムと0.945mLの10mg / mLのテトラクロロ金酸カリウム（III）水溶液を加えました。 30分後、加熱を停止し、反応混合物を冷ましました。すべての準備実験で、Milli-Q水（25°Cで18.2MΩ）を使用しました。

Aの根のアッセイ用。タリアナ 、3つの異なるサイズ（10、14、および18 nm）の合成AuNPを5000 g で遠心分離しました。 粒子濃度を2000mg / Lの制限値まで上げるために1時間。

A。タリアナ コロンビア（Col-0）シード（米国のLehleシードから入手）を30％（ v ）で表面滅菌しました。 / v ）溶液を10分間漂白し、滅菌水で5回すすいだ。滅菌種子は、1/2ムラシゲスクーグ（MS）培地と1％植物寒天培地（pH 5.8）を含む寒天プレートに播種されました。種子の発芽を同期させるために、寒天プレートを4°Cで2日間維持しました。 A。タリアナ 植物は、22°C、100μmolm ^{− 2} の成長チャンバー内で、垂直に向けられたプレートで5日間成長しました。 s ^{− 1} 長い日中の光の強さ（16時間/ 8時間の明暗サイクル）。

同様のサイズの5日齢の苗木を、1/16 MS培地、異なる濃度のAuNP（0、1、10、および100 mg / L）および1％植物寒天（1％植物寒天）を含む寒天プレート（プレートあたり20植物）に移しました。 pH 5.8）。オートクレーブ後、AuNPを培地に添加しました。対照として、クエン酸ナトリウム緩衝液の効果も調べた。根の長さをマークし、次の5日間苗を育てました。一次根と側根の両方の長さの増分は、JMicroVision1.2.7ソフトウェアを使用して測定されました。

分析メソッド

AuNPの調製溶液は、原子吸光分析（AAS）、質量分析を備えた誘導結合プラズマ（ICP-MS）、動的光散乱（DLS）、および透過電子顕微鏡（TEM）によって特徴づけられました。

調製されたNPの濃度は、242.8 nmの波長のフレームアトマイザーを使用したVarianAA880デバイス（Varian Inc.、USA）によるAASによって決定されました。この方法で測定される濃度の一般的な不確かさは3％未満です。

誘導結合プラズマと質量分析検出器（ICP-MS）を使用して、オートサンプラに接続されたAgilent 8800トリプル四重極分光計（Agilent Technologies、日本）を使用して、未反応のAuソース化学物質に由来するAuイオンの濃度を測定しました。 AuNPsコロイド溶液を1.5mLの疎水性マイクロチューブにピペットで移し、30000 g で遠心分離しました。 エッペンドルフ5430遠心分離機で1時間。遠心分離後、0.3 mLの上清をピペットを使用して注意深く除去し、ICP-MSで分析しました。サンプル噴霧は、蠕動ポンプを備えたMicroMistデバイスを使用して実行されました。ブランクサンプルとして、純粋な緩衝液（2.2 mMクエン酸ナトリウム）を使用しました。測定の不確かさは3％未満でした。

TEM画像は、400kVで動作するJEOLJEM-1010（JEOL Ltd.、日本）を使用して測定されました。コロイド溶液の液滴を、濾紙上の薄いアモルファスカーボンフィルムでコーティングされた銅グリッド上に置いた。過剰の溶媒を除去した。サンプルを風乾し、デシケーター内で真空下に置いてから、試料ホルダーに置きました。粒子サイズはTEM顕微鏡写真から測定され、少なくとも500個の粒子を考慮して計算されました。

粒子サイズ分布は、信号検出用のアバランシェフォトダイオードを備えた粒子サイズ分布のDLSレジームでZetasizer ZS90（Malvern Instruments Ltd.、England）によって決定されました。光源には、ダイオード励起固体レーザー（50 mW、532 nm）を使用しました。測定は、ポリスチレンキュベットで室温で実行されました。

結果と考察

ナノ粒子の特性評価

AuNPのサイズとサイズ分布は、TEMおよびDLS分析によって決定されました。結果は、NP合成直後にAASによって決定されたAuNP濃度、およびICP-MSによって決定された残留Auイオンの濃度とともに表1にまとめられています。これらのデータから、私たちの合成プロトコルは、かなり狭いサイズ分布で十分にサイズ制御されたAuナノ粒子を提供することは明らかです。ここでは、Batúsらによって公開された修正された方法を使用しました。 [20]サイズおよび形状が制御されたクエン酸塩で安定化されたAuNPの合成用。開発されたプロトコルにより、Au ³⁺ の表面触媒還元による、事前合成されたAuNPの拡大に基づくターゲットサイズの拡張が可能になります。 二次核形成の効果的な同時抑制とともに。

王ら。 [21]は、 Aの3日間の水耕栽培中にそれを発見しました。タリアナ Ag ⁺ のいずれかに 同じ濃度のAgNP（5 nm）の場合、Ag濃度はAg ⁺ でより速く減少しました。 AgNPよりも処理された溶液。Ag ⁺ の取り込みが速いことを示しています。 イオン。したがって、結果の歪みにおけるAuイオンの影響を最小限に抑えるように特別な注意を払いました。合成されたままのAuNPは、2000 mg / Lの濃度に制限されるまで遠心分離され、MS培地で必要な濃度（1、10、および100 mg / L）に希釈されました。この手順の後、100 mg / LのAuNPを含む溶液中の残留Auイオンの濃度を、ICP-MSで測定しました（表1を参照）。明らかに、遠心分離は、合成されたままの溶液（表1、AAS）と比較して濃度が2桁減少した残留Auイオンの存在と、クエン酸緩衝液自体の含有量の両方にプラスの効果をもたらしました。

NPの多分散性を定量化するために、DLS測定を実行しました。これは、最終的に形成される粒子の集合体の存在に非常に敏感です（図1）。この測定では、少量の凝集したNPでも、特に強度加重サイズ分布において、かなり大きな直径で対応するピークが優勢になります（図1の挿入図を参照）。幸い、粒子の凝集は検出されなかったため、サイズ評価の信頼性は球面近似によってのみ影響を受ける可能性があります[22]。この欠点にもかかわらず、DLS測定は、サンプルボリューム全体を一度に評価するため、TEMと比較して統計的に重要な粒子サイズ分布の全体像を提供します。調製されたNPは主に丸い形状であるため（図2を参照）、DLSから得られたサイズはTEMで得られたサイズとよく一致していました（表1）。 TEM画像（図2、10 nm）に表示される見かけの粒子凝集体は、コロイド溶液自体の個々の粒子の相互接続ではなく、TEM測定での溶媒除去の必要性が原因である可能性が高くなりました。

異なるサイズのAuNPの水溶液の動的光散乱分析（数加重サイズ分布）。挿入図は、「生の」強度加重データを示しています。数値はnm単位の平均粒子径を示します

準備されたAuNPのセットのTEM画像。画像の倍率は特定のNPサイズによって異なることに注意してください

植物の生物学的条件を満たすためのナノ粒子溶液の適応

invitroでの植物成長に一般的に使用される植物成長培地（MS培地）でのAuNPの強い凝集傾向のため[23]、植物成長の許容条件を維持しながらNP凝集を回避するためにこれら2つの成分の相互比率を最適化する必要がありました。 MSのさまざまな希釈がテストされました。 AuNPの凝集は、色の変化（赤から紫への変化）によって簡単に確認できました。合成されたままのAuNPの初期濃度が低く（約30 mg / L、表1を参照）、生物学的実験には不十分であるため、遠心分離によってNP濃度を上げる必要がありました。この手順により、粒子濃度を限界値の2000 mg / Lまで増加させました。次に、このようなNP溶液を最終濃度に希釈しました。これにより、実験でのクエン酸緩衝液の濃度も低下しました。 Aの成長実験用。タリアナ 、AuNPを1 / 16MS培地で希釈しました。最小限のNP凝集がこの培地で検出可能であり、NPは、1/2 MS、1/4 MS、および1/8 MSと比較してはるかに安定しており、植物の成長はほとんど変化していませんでした。最終溶液中のAuNPの濃度は、AASによって決定されました。植物成長実験はinvitro（滅菌条件）で行われたため、NPに対する滅菌手順の影響も研究されました。調製した増殖培地の一般的に使用されるオートクレーブ（121°C、20分）により、調査したNPが完全に凝集しました。したがって、この手順は私たちの実験には適していませんでした。 NPの凝集が検出されず、滅菌プロセスが依然として有効である代替手順として、約60°Cのオートクレーブ寒天培地へのNPの添加が最終的に使用されました。

シロイヌナズナの根の成長に対するNPの影響 invitro

双子葉植物 Aなどのモデル植物。タリアナ ストレス条件下での生存率を改善できる遺伝子を特定することを目的として、世界の作物収量を減少させるストレス要因を理解するのに役立つ可能性があります[24]。テストされたすべてのAuNPは、側根（LR）に大きな影響を及ぼしました。 LRの長さ（図3a）と数（図3b）の両方が、AuNP処理された植物で減少しました。調査したすべての粒子サイズの中で最も高い濃度のAuNP（100 mg / L）により、LRの長さが約50％に減少しました。 18 nmのAuNPと最高濃度（100 mg / L）の場合、LRの数は約70％に減少します。より小さなAuNP（14および10 nm）の最高濃度を使用した場合、LRの数のわずかに少ない減少が観察されました（図3b）。一次根の長さは、AuNP処理後も減少しました（図3c）。 10 nm AuNPの悪影響は、特に粒子濃度が高い場合に顕著でした。より大きな粒子（14、18 nm）の効果ははるかに小さく、コントロールとして使用されたクエン酸ナトリウムバッファーの効果と同様でした。人工NPを用いたほとんどの公表された研究は、特に高NP濃度で、ある程度の植物毒性を示しました。例えば、クエン酸塩でコーティングされたAgNPは Aを阻害した。タリアナ 2週間後の67から535μg/ Lまでの線形用量反応を伴う実生の根の伸長[25]。根の伸長および種子の発芽アッセイを使用した他のいくつかの研究は、植物毒性がNPのサイズによって影響を受けることを示しました。多くの研究は、NPが小さいほど植物毒性が高いと結論付けています。しかし、人工ナノ材料のサイズ依存毒性に関するこの一般化は、植物とNPタイプのすべての組み合わせに常に当てはまるとは限りません[21、25]。それとは対照的に、単層カーボンナノチューブは、トマト、キャベツ、ニンジン、レタスの根の伸長に24〜48時間でプラスの影響を及ぼしました[26]。種子の発芽率と栄養成長に対する24nm AuNPの正の効果は、Kumar etal。によって報告されました。 [13]。

a に対するAuNPの影響 長さと b 側根の数と c Aの一次根の伸長。タリアナ 苗。植物は、さまざまな濃度（0.1、10、および100 mg / L）の10、14、および18nmのAuNPに曝露されました。データは、19〜20の植物の平均値+ SDです。 * P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001; t テスト

根毛の成長に対する10nm AuNPの実質的な正の効果は、根の成長実験中に観察されました（図4）。この効果は強い濃度依存性を示した。 NP濃度を上げると、根毛の成長がより顕著になります（図4e）。この振る舞いは、リンが少ない土壌で育てられた根でしばしば観察されています[27]。 14nmと18nmのAuNPの場合、同様の効果は観察されませんでした。それとは反対に、García-Sánchezetal。 [28] Aの間に観察された。タリアナ 市販のAgNPによる処理、1cmの植物の根に関連する多くの根毛の抑制。 200 mg / Lの均一濃度の処理溶液を使用すると、特定のサイズ（10、20、40、および80 nm）に関係なく、テストしたすべての粒子の場合に毛根の減少が観察されました。根毛は土壌と接触する根の表面積を大幅に増加させ、植物に入る水と栄養素のほとんどはそれらを通して吸収されます。したがって、それらの発達は、環境刺激およびストレス信号によって大きく影響されます[29]。

Aの根毛の成長に対する10nmAuNPのさまざまな濃度の影響。タリアナ 苗。 a コントロール、 b – d それぞれ1、10、100 mg / LのAuNPで処理された苗木、および e 100 mg / LのAuNPに曝露された植物で誘発された根毛の成長の詳細。スケールバーは1cmに対応します

結論

水環境での穏やかな2成分（クエン酸ナトリウム-テトラクロロ金酸カリウム）還元により、金ナノ粒子の調製に成功しました。これにより、丸い形状の狭い分布の粒子が得られ、結果のサイズを優れた方法で制御できます。合成後の遠心分離により、目的のNP濃度に到達し、植物実験での結果の歪みに対するイオンとクエン酸バッファーの影響を排除しました。 Aの根の成長に対する、さまざまなサイズ（直径10、14、および18 nm）および濃度（1、10、および100 mg / L）のAuNPの影響。タリアナ 調査されました。側根の数と長さは、特定のサイズに関係なく、より高い粒子濃度のNPs溶液で処理した後に大幅に減少しました。 10 nmのAuNPの場合、一次根の成長に対する悪影響が観察されました。驚いたことに、最小のAuNP（10 nm）は明らかに根毛の成長を誘発しました。全体として、この研究は、AuNPへの植物の直接曝露が植物毒性に大きく寄与し、Auナノ粒子を含む廃棄物とスラッジの環境に配慮した処分の必要性を強調していることを示しました。

略語

AAS：

原子吸光分光法

AgNPs：

銀ナノ粒子

AuNPs：

金ナノ粒子

DLS：

動的光散乱

ICP-MS：

誘導結合プラズマを備えた質量分析

LR：

側根

MS：

ムラシゲスクーグ

NMNP：

貴金属ナノ粒子

NP：

ナノ粒子

TEM：

透過型電子顕微鏡