肺および精巣における刷り込み遺伝子の発現および異常なメチル化に対するナノSiO2の影響

要約

ナノテクノロジーは急速に発展しており、現在多くの最先端の医療に使用されています。ただし、エピジェネティックなメカニズムがますます多くの病気に関連付けられているため、ナノ粒子（NP）への曝露がさまざまな全身性疾患を誘発する可能性があるという懸念が高まっています。 NPエピゲノム修飾の役割は、疾患の病因にとって重要です。私たちの研究は、細胞をSiO ₂に曝露することにより、肺および精巣細胞の損傷のエピジェネティックなメカニズムを特定することを目的としています。 NP。オスのC57BL / 6マウスを使用して、SiO ₂の損傷効果を特徴付けました。肺および精巣細胞上のNP、およびインプリントされたDlk1 / Dio3ドメイン領域での結果として生じるメチル化状態。 SiO ₂に曝露されたA549細胞 NPには細胞アポトーシスがあり、雄マウスはSiO ₂に曝露されました NPは肺と精巣の組織を変化させました。インプリントされたドメインDlk1 / Dio3領域の遺伝子は両方の組織で変化しました。 Dlk1 、 Rtl1 、および Dio3 Dlk1 が精巣でアップレギュレートされている間、および Dio3 肺組織でもアップレギュレーションされます。男性の成人の肺と精巣のバイサルファイトシーケンシングPCRは、ほとんどが低メチル化されており、いくつかの高メチル化CpGが含まれていました。これらの発見は、ナノ粒子が刷り込み遺伝子のDNAメチル化に重要な役割を果たしていることを示しています。

背景

二酸化ケイ素は、化学式がSiO ₂のケイ素の酸化物です。、自然界ではクォーツとして、またさまざまな有機環境で最も一般的に見られます[1]。人工ナノ粒子は、ハイテク産業におけるナノテクノロジーの急速な成長と応用に広く普及しています。この特定のナノ粒子は、大きな比表面積、豊富な反応部位、高い表面エネルギー、不飽和化学結合などの物理的科学的特性により、電子機器、プラスチック製品、医療、化粧品、コーティング材料など、さまざまな消費者製品で広く使用されています。強力な吸着能力、および金属や有機物と相互作用する強い傾向により、汚染物質と環境中のそれらの輸送を変化させます[2]。 SiO ₂の存在さまざまな消耗品に含まれるナノ粒子（NP）は、環境に放出される可能性を高め、人口と接触します。

以前の実験的研究は、金属および金属酸化物ナノ粒子種の単回投与の気管内注入または複数回の腹腔内注射が、細胞レベルから全身レベルおよび生物レベルまでの毒性作用を引き起こすことを示した[3]。 SiO ₂の処理 NPは、アポトーシスを増加させ、細胞の運動性を低下させることにより、乳がん細胞株の増殖を抑制します。さらに、SiO ₂への暴露 NPは上皮成長因子受容体（EGFR）を著しく妨害します[4]。ラットモデルを3つの異なるサイズのTiO ₂で処理した場合 NPと対照と比較して、大きな凝集体（> 100 nm）エアロゾルによる気管支肺胞洗浄液（BALF）治療は急性炎症反応を誘発し、小さな凝集体（<100 nm）エアロゾルは重大な酸化ストレス損傷と細胞毒性を引き起こしました[5]。

生殖に対するナノ粒子の毒性の研究は成長分野です。ある研究は、同じ治療用量の下で、NiNPが Cでより高い生殖毒性を誘発したことを示した。 elegans Ni MP（微粒子）より。 Cで観察されたこれらの生殖毒性。 elegans ひなのサイズの縮小、受精卵、精子の活性化が含まれていました[6]。特定の環境影響が、精子ゲノムを変化させることなく、父方の経路を介して子孫に受け継がれる可能性があるという証拠が増えています[7、8]。父方の情報は、ゲノムだけでなく、関連する特定のエピジェネティックマーカー、mRNAコンテンツ、および非コードRNAにも存在します。

酸化ストレスはナノ粒子毒性の重要なメカニズムであり、DNA損傷、炎症、タンパク質変性、脂質過酸化を引き起こす可能性があります[9]。これらの生物学的効果は、ナノ粒子のサイズ、表面積、形状、表面化学、機能化、溶解性などの物理化学的特性の影響を受けます[10、11]。ナノ粒子への曝露が、細胞毒性のない低用量でも組織や細胞のエピジェネティックな変化を引き起こす可能性があることを明確に示す証拠が増えています[12、13]。エピジェネティクスは、DNAのメチル化、遺伝子刷り込み、ヒストン修飾、非コードRNAによる調節など、DNA配列の変化を伴わない遺伝子機能の遺伝的変化の研究です[14]。このようなエピジェネティックな変化は、多くの病的状態や疾患の発症と進行に関連しています[15]。したがって、エピジェネティックな影響は、細胞レベルでの患者のリスク評価スクリーニングの重要な部分です。

Dlk1 / Dio3刷り込みドメインには、父方がメチル化されている3つの既知の示差的にメチル化された領域（DMR）が含まれています。以前の研究は、IG-DMRが Gtl2 の対立遺伝子のメチル化状態を決定することを示唆しています。プロモーターDMRは、クラスター全体の遺伝子発現を制御します[17]。マウスゲノムには、12番染色体の遠位領域のDlk1 / Dio3ドメインに多数の刷り込み遺伝子があります。刷り込み遺伝子 Dlk1 の間にあるIG-DMR および Gtl2 男性の生殖細胞系列で特異的にメチル化され、刷り込み遺伝子領域の親の対立遺伝子特異的発現を調節します[18]。 IG-DMRのメチル化状態は出生前に確立されるため、男性の生殖細胞分化中の男性の生殖細胞系列で男性の生涯を通じて維持されます。つまり、IG-DMRのメチル化は、成熟精巣の精原細胞と精母細胞で維持されます。

私たちの目的は、環境の変化による子孫への父方の影響を説明するために、転写および翻訳サイレンシングの前に精子形成中の雄の生殖細胞系遺伝子発現の変化を見つけることでした。環境要因は精子の転写修飾を改変する可能性があり、それは子孫の発達の変化につながる可能性があります。私たちの研究でこの調査を実施するために、SiO ₂の毒性作用をスクリーニングするためのモデルとして細胞株とマウスを使用しました。 NP。私たちの知る限り、これは、ナノ粒子が肺と精巣の両方の組織に損傷を与えるDlk1 / Dio3刷り込み領域のエピジェネティックなメカニズムを実証する最初の研究です。

メソッド

実験動物

動物の取り扱いは、南京医科大学の対応する動物使用プロトコルの下で、実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施されました。マウスはBeijingVital River Laboratory Animal Technology Co.、Ltdから入手しました。すべての動物は、23°Cで12時間の光サイクルで飼育されました。滅菌水と齧歯類の餌は、マウスによって自由に消費されました。マウスの活動と行動を毎日監視した。 2週間後、マウスにナノサイズのSiO ₂を注射しました。 12.5 mg / kg。

化学薬品

ナノサイズのSiO ₂ （99.5％微量金属ベース、粒子サイズ10〜20 nm）は、Sigma-Aldrich Chemical Co.（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手しました。ナノ粒子をRPMI1640培地に懸濁してストック溶液を作成し、超音波振動で20分間分散させ、適切な濃度に希釈し、さらに20分間分散させました。

SiO ₂の特性 NP

サイズとゼータ電位は、Malvern Zetasizer NanoZSPを使用して記録されました。

RNA抽出とqRT-PCR

肺と精巣のサンプルを液体窒素で瞬間冷凍し、約4時間後に80°Cで保存しました。サンプルを抽出する前に、サンプルを解凍しました。

全RNAは、1 mLのTRIzol試薬（Invitrogen Life Technologies Co、USA）を使用してサンプルから分離されました。混合物を80％の出力で5分間超音波処理し、0.2 mLのクロロホルムを加え、次に12,000 g で遠心分離しました。 / min、4°Cで15分間。次に、タンパク質を取り除くために、フェノール/クロロホルム精製の3つのステップが追加されました。次に、UV吸光度を使用して、260nmと280nmでの各サンプルのRNA含有量と品質を測定しました。 mRNAのプライマー配列は、追加ファイル1：表S1およびS2に示されています。 qRT-PCRは、以前に説明されているように[19]、製造元の指示を使用して実行されました。リアルタイムPCRは、SYBR Green（Vazyme）を使用して実行されました。 PCRサイクルは次のとおりです。95°Cで30秒間の初期変性、続いて95°Cで15秒間の変性、60°Cで15秒間のアニーリング、72°Cで30秒間の伸長の40サイクル。標的遺伝子の量は、β-アクチンで正規化した後、2 ^-ΔCt法を使用して分析しました。

DNA抽出、バイサルファイト処理、およびバイサルファイトシーケンシングPCR

DNAは、製造元の推奨に従ってDNAキット（QIAamp DNA Mini Kit;Qiagen。No.51304; USA）を使用して、精巣および肺組織から分離されました。 500 ngのすべてのゲノムDNAのバイサルファイト変換は、メーカーの推奨に従ってキット（EpiTect®Bisulfiteキット;Qiagen。No.59104; USA）を使用して達成されました。さまざまなCpGメチル化オリゴヌクレオチドがMethylPrimer Express v1.0ソフトウェアを使用して設計され、配列はP1-F 5'-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3 '、P1-R 5'-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3'です。 P2-F 5'-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3 '、P2-R 5'-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3'; P3-F 5'- TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3 '、P3-R 5'- ACCCATAACAAACCACAACA-3'; P4-F 5'-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3 '、P4-R5'-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3'。

各DNAサンプルは次のようにPCRによって増幅されました：2.5μlの10×PCRバッファーPCR反応ミックスと500 ngのバイサルファイト処理DNA、それぞれ0.5μlのフォワードおよびリバースプライマー、0.5μlのdNTPミックス、0.5μlのrTaq（500 U、dNTP 、Mg ²⁺ ）（タカラバイオ、東京、日本）、ddH ₂の追加最大25μlの容量。 94°Cで10分間ポリメラーゼを活性化した後、次のシーケンスの40サイクルが続きました：94°Cで30秒、58°Cで30秒、72°Cで1分、72°で最終伸長Cで10分。

細胞培養と処理

A549細胞は、ATCC（マナッサス、バージニア州、米国）から購入し、10％ウシ胎児血清（FBS）を添加した1640年に、37°Cおよび5％CO ₂で培養しました。加湿インキュベーターで。細胞を96ウェルプレートにプレーティングし、さまざまな濃度のSiO ₂とインキュベートしました。 NP：62.5、125、250、500、1000、および2000μg/ mlで24時間。

細胞生存率アッセイ

細胞生存率は、CCK8増殖アッセイによって評価されました。細胞を1.5×10 ⁴ の密度でプレーティングしました 96ウェルプレートのウェルごとに、一晩インキュベートしました。 SiO ₂にさらされた後さまざまな濃度のNP、100μlのCCK8を各ウェルに添加し、細胞を37°Cで30分間インキュベートして、CCK8を代謝させました。最後に、450nmでの吸光度を測定しました。細胞阻害率を計算し、IC ₅₀に変換しました。 SPSS15.0を使用します。

統計分析

すべての計算は、SPSS15.0ソフトウェアを使用して実行されました。グループ間の比較は、無関係の t を使用して行われました。テストとBSPのピアソンカイ2乗検定。データは平均±SDとして表されます。すべての場合において、 p の値 <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果

SiO _{2の特性評価} NP

SiO ₂の特性を明らかにしました実験条件下でのNP。 SiO ₂の平均流体力学的半径とゼータ電位培地中のNPは、それぞれ371.77±18.46nmと18.83±2.12mVでした（図1）。

SiO _2の効果 A549細胞株のNP

SiO ₂の毒性を決定するには NPは、IC ₅₀を決定するために、A549細胞で増殖試験を実施しました。 SiO ₂ A549細胞上のNP。図1cに示すように、SiO ₂ NPは、濃度依存的にA549細胞の生存率を低下させます。細胞生存率の低下は、SiO ₂で顕著です。 62.5μg/ mlを超えるNP濃度（ p <0.001）。 IC ₅₀ 化学物質の24時間は、24時間の曝露後に細胞の50％に影響を与える濃度として定義されます。 IC ₅₀ SiO ₂について24時間測定 NPは4942μg/ mlでした。

SiO ₂の影響マウスの肺と精巣のNP

SiO ₂への曝露かどうかを判断しました 12.5 mg / kg体重のNPは、マウスモデルで肺膜の損傷、さらには精巣の損傷を引き起こします。図に示すように、SiO ₂ NP曝露は、精巣の対照群と比較して、肺の組織切片の層状体の破壊（図2a、b）とミトコンドリアのクリステ損傷を引き起こしました（図2c、d）。次に、SiO ₂の肺と精巣への影響を調査しました。 Dlk1 / Dio3インプリント領域でのインプリンティングの活性化に関するNP。

ネズミの肺と精巣に刷り込まれた遺伝子の発現

肺と精巣の変化を説明するために、これらの組織に刷り込まれた遺伝子を検出しました。 24個の刷り込み遺伝子を選択します。彼らは Dio3 でした、 Ddc 、 Dlk1 、 Gpr1 、 Gtl2 、 H19 、 Igf2、Igf2as 、 Igf2r 、 Inpp5f 、 Magel2 、 Magi2 、メスト 、 Mir296 、 Mir298 、 Ndn 、 Nnat 、 Peg10 、 Plagl1 、 Pwcr1 、 Rasgrf1 、 Rtl1 、 Snrpn 、およびスナーファー。 これらの遺伝子のうち13個は、肺と精巣の両方で発現しています。 Dio3 、 Dlk1 、 Gpr1 、 Gtl2 、 Igf2r 、 Igf2 、 Inpp5f 、 Peg10、Ndn 、 Nnat 、 Rasgrf1 、 Rtl1 、および Snrpn （図3a、b）。主な焦点の差次的に発現された遺伝子は、 Dlk1 を含むDlk1 / Dio3刷り込み領域にありました。、 Gtl2 、 Rtl1 、および Dio3 。

Dlk1 / Dio3インプリント領域の表現

インプリントされたDlk1 / Dio3領域には、3つのタンパク質コーディング遺伝子（ Dlk1 ）が含まれています、 Gtl2 、 Rtl1 、および Dio3 ）継承された対立遺伝子[20]（図4c）。 SiO ₂に対する肺および精巣組織の応答におけるDlk1 / Dio3領域の役割を解明する NP処理では、コントロールと比較したDMRのメチル化パターンを分析しました。さまざまな遺伝子が、肺と精巣のメチル化の標的になっています。 Dlk1 の表現および Dio3 Rtl1 が肺と精巣の両方でアップレギュレーションされたのに対し、精巣でのみアップレギュレーションされました（図4a、b）。

Dlk1 / Dio3DMR領域のメチル化

DNAメチル化に応答して遺伝子の発現が変化するかどうかをさらに調査するために、マウスの肺と精巣におけるこの領域のメチル化状態に取り組みました。 DNAメチル化分析では、CpGアイランドの3つのセクションの配列を決定しました。精巣では、それらは低メチル化されています。ただし、CpGアイランド1では、それらは大幅に高メチル化されています（図5）。肺では、全体のメチル化は精巣と同じですが、CpGアイランド2は高メチル化を示しました（図6）。

ディスカッション

ナノマテリアルの使用の増加は、人間の健康と環境への影響に対する潜在的な影響についての懸念を引き起こしています。以前の研究では、SiO ₂ NPは、老齢ラットの肺の炎症や心筋虚血性損傷など、肺や心臓血管の損傷を引き起こす可能性があります[21]。さらに、ナノ粒子は生殖細胞系列に影響を与える可能性があります。そのような細胞はAg NPの毒性作用に対してより敏感であるように見え、低用量への曝露後に悪影響を示したからです。 Ag NP曝露は、ミトコンドリア活性の低下に加えて、ラット精子細胞で観察される異常の数を増加させ、先体と原形質膜の両方の完全性を低下させました[22]。私たちの調査は、実験プラットフォームを使用して、ナノ粒子が男性の生物やその未曝露の子孫を標的にする可能性を評価する一連の研究の一部です。

以前のinvitro研究では、いくつかのナノ粒子への短期暴露が細胞アポトーシスとTM-4セルトリ細胞の刷り込み遺伝子の異常な発現をもたらすことを報告しました。これらの発見は、刷り込み遺伝子の異常な発現が、ナノ粒子が生殖毒性を誘発する根本的なメカニズムである可能性があることを示しています[23]。さらに、私たちの以前のin vivo研究では、内分泌かく乱物質などのいくつかの環境要因も、曝露された個人だけでなく、後代の世代でも表現型または病状を促進します。恒久的にプログラムされる生殖細胞系列のエピミューテーションは、エピジェネティックな世代間表現型の伝達を可能にする可能性があります[19]。この研究の目的は、SiO ₂によってエピジェネティックな状態に加えられた変化を調査することでした。男性の世代間効果の機構的基礎を築くためのマウスモデルにおけるNP治療。

エピジェネティック状態は、DNA配列を変更せずにゲノム内で発生する化学修飾を定義するために使用される用語です[24]。 DNAメチル化、刷り込み遺伝子、ヒストン修飾、および非コードRNA発現を含むエピジェネティックなメカニズムは、外因性環境におけるゲノム機能に影響を与える可能性があります[25]。私たちの知る限り、私たちの研究は、SiO ₂を調査する最初の研究です。エピジェネティックレベルで肺および精巣の毒性を誘発するNP。

最初に、SiO ₂の急性毒性を調べました。ヒト肺上皮細胞株であるA549細胞のNP。しかし、実験マウスでの我々の発見は、層状肺II型上皮細胞の損傷およびSiO ₂との接触後の精巣ミトコンドリア頂部損傷を明らかにした。環境濃度のNP [26]。肺と精巣の病理のメカニズムをよりよく理解するために、インプリントされた遺伝子を発現させました。ゲノムインプリンティングとは、起源の親に応じて、配偶子の接合子における1つの親対立遺伝子のサイレンシングを指します。このサイレンシングは、DNAメチル化やヒストン修飾などの後成的プロセスを介して発生します[27]。以前の研究では、Dlk1 / Dio3ドメインでの刷り込み遺伝子発現が胎児の成長[28]、人間の思春期のタイミング[29]、および代謝性疾患への感受性[30]にとって重要であることが示されています。研究によると、IG-DMRはGtl2プロモーターDMRの対立遺伝子のメチル化状態を決定し、DMRはDlk1 / Dio3領域全体の遺伝子発現を制御します[17]。この刻印された制御領域の主な機能は、生殖細胞によるDNAメチル化を配偶子のシグナルとして継承し、その後、体細胞内でその後の対立遺伝子特異的なDNAメチル化パターンを維持することです[31]。私たちの研究は、SiO ₂ NPは、肺組織と精巣組織の両方でDlk1 / Dio3領域の発現に変化を引き起こします。 Dlk1 / Dio3領域では、父方が発現した遺伝子（ Dlk1 、 Rtl1 、および Dio3 ）NP治療後の対照と比較して特に異常です。バイサルファイトシーケンシングの結果は、肺と精巣で異なるレベルの低メチル化を示しています。 IG-DMRのメチル化状態は、一般に処理された組織では低く、この低メチル化は、刷り込み遺伝子の差次的発現のメカニズムを表している可能性があります。

結論

結論として、我々の結果は、SiO ₂ NP曝露は、細胞の損傷を引き起こす重要なDNAメチル化の変化を誘発する可能性があり、これらの変化はDlk1 / Dio3刷り込み遺伝子クラスターの発現にとって非常に重要です。重要なことに、DNAメチル化の変化は、肺組織と精巣組織の両方に影響を及ぼします。これらの結果は、曝露されたモデルの子孫が受け継いだナノ粒子のエピジェネティックな影響と、そのようなエピジェネティックな変化を媒介する分子メカニズムの解明を調べる将来の研究において重要な役割を果たします。