シリカナノ粒子が肺と精巣組織の遺伝子発現とDNAメチル化に与える影響

背景

二酸化ケイ素は化学式SiO₂のケイ素酸化物で、自然界では石英として最も一般的に見られ、様々な有機環境にも存在する[1]。エンジニアードナノ粒子は、ハイテク産業におけるナノテクノロジーの急速な成長と応用により広く普及している。この特定のナノ粒子は、大きな比表面積、豊富な反応サイト、高い表面エネルギー、不飽和化学結合、強い吸着能力、金属や有機物と相互作用する強い傾向などの物理化学的特性により、電子機器、プラスチック製品、医療、化粧品、コーティング材料など幅広い消費者製品に使用されている[2]。SiO₂ナノ粒子（NP）が幅広い消費財に存在することは、環境への放出とヒト集団への接触の可能性を高めている。

これまでの実験研究では、単回気管内投与または複数回腹腔内投与による金属および金属酸化物ナノ粒子が、細胞から全身および個体レベルまで毒性効果を引き起こすことが示されている[3]。SiO₂ NP処理は、アポトーシス増加と細胞運動性低下により乳がん細胞株の増殖を抑制し、上皮成長因子受容体（EGFR）を著しく撹乱する[4]。ラットモデルで3種の異なるサイズのTiO₂ NPを対照群と比較した場合、気管支肺胞洗浄液（BALF）処理で大きな凝集体（>100 nm）エアロゾルは急性炎症反応を誘導し、小さな凝集体（<100 nm）エアロゾルは顕著な酸化ストレス損傷と細胞毒性を生じた[5]。

ナノ粒子の生殖毒性研究は成長分野である。ある研究では、同一投与量でNi NPがC. elegansにおいてNiマイクロ粒子（MP）より高い生殖毒性を示し、産卵数減少、受精卵減少、精子活性化低下などが観察された[6]。特定の環境影響が、精子ゲノムの変化なしに父親経由で子孫に伝達される証拠が増えている[7, 8]。父親由来情報はゲノムのみならず、関連する特定のエピジェネティックマーカー、mRNA含量、ノンコーディングRNAにも存在する。

酸化ストレスはナノ粒子毒性の重要な機構であり、DNA損傷、炎症、タンパク質変性、脂質過酸化を引き起こす[9]。これらの生物学的効果は、サイズ、表面積、形状、表面化学、官能基化、溶解性などのナノ粒子の物理化学的特性に影響される[10, 11]。低用量で細胞毒性を示さないレベルでも、ナノ粒子曝露が組織と細胞にエピジェネティック変化を引き起こす明確な証拠が増えている[12, 13]。エピジェネティクスは、DNA配列の変化を伴わない遺伝子機能の遺伝的変化の研究であり、DNAメチル化、遺伝子インプリンティング、ヒストン修飾、ノンコーディングRNAによる制御を含む[14]。このようなエピジェネティック変化は、多数の病理状態と疾患の発症と進行に関連する[15]。したがって、エピジェネティック効果は細胞レベルでの患者リスク評価スクリーニングの重要な部分である。

Dlk1/Dio3インプリントドメインには、父方由来でメチル化される3つの既知の差別的メチル化領域（DMR）が含まれる：遺伝子間DMR（IG-DMR）、母方発現3-DMR（Gtl2-DMR）、Dlk1-DMR[16]。先行研究では、IG-DMRがGtl2プロモーターDMRの対立遺伝子メチル化状態を規定し、インプリント遺伝子領域全体の遺伝子発現を制御すると示唆されている[17]。マウスゲノムには、染色体12遠位領域のDlk1/Dio3ドメインに多数のインプリント遺伝子が存在。Dlk1とGtl2の間に位置するIG-DMRは男性生殖細胞で特異的にメチル化され、インプリント遺伝子領域の親由来特異的発現を制御する[18]。IG-DMRメチル化状態は出生前に確立され、男性生殖細胞分化中の男性生殖系列で男性の一生を通じて維持されるため、IG-DMRメチル化は成熟精巣の精原細胞と精母細胞で維持される。

本研究の目的は、転写・翻訳的サイレンシング前の精子形成期における男性生殖系列遺伝子発現の変化を見出し、環境変化を通じた父親の子孫への影響を説明することである。環境因子は精子の転写修飾を変化させ、子孫発達の変化をもたらす可能性がある。この調査を実施するため、細胞株とマウスをモデルとしてSiO₂ NPの毒性効果スクリーニングに用いた。私たちの知る限り、これはナノ粒子が肺と精巣組織の両方でDlk1/Dio3インプリント領域のエピジェネティック機構による損傷を実証した最初の研究である。

実験方法

実験動物

動物取り扱いは、長崎医科大学の対応する動物使用プロトコル下で、実験動物の飼育と使用のガイドラインに従って実施。マウスは北京バイタルリバー実験動物技術有限公司から入手。全動物を23℃、12時間光周期で飼育。滅菌水とラット飼料を自由摂取。マウスの活動と行動を毎日モニタリング。2週間後、ナノサイズSiO₂を12.5 mg/kgで投与。

試薬

ナノサイズSiO₂（99.5%トレースメタル基準、粒子サイズ10-20 nm）をシグマアルドリッチケミカル（ミズーリ州セントルイス、米国）から入手。ナノ粒子をRPMI 1640培地に懸濁しストック溶液を作製、超音波振動で20分分散、適切な濃度に希釈しさらに20分分散。

SiO₂ NPの特性

サイズとゼータ電位をマルバーンゼータサイザーNano ZSPで測定。

RNA抽出とqRT-PCR

肺と精巣試料を液体窒素で瞬間凍結し、約4時間後-80℃で保存。解凍後、TRIzol試薬（インビトロジェンライフテクノロジーズ、米国）1 mLで総RNAを分離。混合物を80%出力で5分超音波処理、クロロホルム0.2 mL添加、4℃で12,000g/min、15分遠心分離。その後、タンパク質除去のためフェノール/クロロホルム精製を3回実施。UV吸光度で260 nmと280 nmにて各試料のRNA含量と品質を測定。mRNAプライマー配列は追加ファイル1：Table S1とS2に示す。qRT-PCRを製造元指示に従い実施[19]。リアルタイムPCRをSYBR Green（Vazyme）で実施。PCRサイクル：95℃で30秒初期変性、その後95℃で15秒変性、60℃で15秒アニーリング、72℃で30秒延伸の40サイクル。β-actinで正規化後、2^-ΔCt法で標的遺伝子量を解析。

DNA抽出、ビスルファイト処理、ビスルファイトシーケンシングPCR

精巣と肺組織からDNAキット（QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. No.51304; 米国）でDNAを分離、製造元推奨に従う。全ゲノムDNA 500 ngのビスルファイト変換をキット（EpiTect® Bisulfite kit; Qiagen. No. 59104; 米国）で実施、製造元推奨に従う。異なるCpGメチル化オリゴヌクレオチドをMethyl Primer Express v1.0ソフトウェアで設計、配列はP1-F 5'-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3'、P1-R 5'-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3'；P2-F 5'-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3'、P2-R 5'-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3'；P3-F 5'-TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3'、P3-R 5'-ACCCATAACAAACCACAACA-3'；P4-F 5'-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3'、P4-R 5'-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3'。

各DNA試料を以下でPCR増幅：2.5 μl 10×PCRバッファーPCR反応混合液に500 ngビスルファイト処理DNA、各プライマー0.5 μl、dNTP Mix 0.5 μl、rTaq（500 U、dNTP、Mg²⁺）0.5 μl（タカラバイオ、東京、日本）、ddH₂Oを加えて25 μlに調整。94℃で10分ポリメラーゼ活性化後、以下の40サイクル：94℃で30秒、58℃で30秒、72℃で1分、最終延伸72℃で10分。

細胞培養と処理

A549細胞をATCC（バージニア州マナサス、米国）から購入、10%胎児牛血清（FBS）添加1640培地で37℃、5% CO₂、湿潤インキュベーターで培養。96ウェルプレートに播種し、SiO₂ NPを62.5、125、250、500、1000、2000 μg/mlの異なる濃度で24時間インキュベート。

細胞生存率アッセイ

CCK8増殖アッセイで細胞生存率を評価。1.5×10⁴ cells/wellの密度で96ウェルプレートに播種し一晩インキュベート。異なる濃度のSiO₂ NP曝露後、各ウェルに100 μl CKK8を添加、37℃で30分インキュベートしCCK8代謝を許容。最後に450 nmで吸光度測定。細胞抑制率を算出し、SPSS 15.0でIC₅₀に変換。

統計解析

全計算をSPSS 15.0ソフトウェアで実施。群間比較に無相関t検定とBSPのピアソンカイ二乗検定を使用。データを平均±SDで表示。全ての場合、p < 0.05を統計的有意とする。

結果

SiO₂ NPの特性評価

実験条件下でSiO₂ NPを特性評価。培養液中でのSiO₂ NPの平均動的半径とゼータ電位はそれぞれ371.77 ± 18.46 nm、18.83 ± 2.12 mV（図1）。

SiO₂ NPのA549細胞株への影響

SiO₂ NPの毒性を判定するため、A549細胞で増殖試験を実施し、SiO₂ NPのIC₅₀を決定。図1cに示すように、SiO₂ NPは濃度依存的にA549細胞生存率を低下。62.5 μg/ml以上の濃度で有意な生存率低下（p < 0.001）。化学物質のIC₅₀ 24 hは、24時間曝露後に50%の細胞に影響を与える濃度と定義。SiO₂ NPのIC₅₀ 24 hは4942 μg/mlと決定。

SiO₂ NPのマウス肺と精巣への影響

12.5 mg/kg体重のSiO₂ NP曝露が、マウスモデルで肺膜損傷さらには精巣損傷を引き起こすか検証。図に示すように、SiO₂ NP曝露により肺の組織学的切片でラメラ小体の破綻（図2a, b）と、対照群と比較して精巣でのミトコンドリアクリステ損傷（図2c, d）が生じた。次に、SiO₂ NPの肺と精巣への影響について、Dlk1/Dio3インプリント領域のインプリンティング活性化を調査。

マウス肺と精巣のインプリント遺伝子発現

肺と精巣の変化を明らかにするため、これらの組織のインプリント遺伝子を検出。24のインプリント遺伝子を選択：Dio3、Ddc、Dlk1、Gpr1、Gtl2、H19、Igf2, Igf2as、Igf2r、Inpp5f、Magel2、Magi2、Mest、Mir296、Mir298、Ndn、Nnat、Peg10、Plagl1、Pwcr1、Rasgrf1、Rtl1、Snrpn、Snurf。これらのうち13遺伝子が肺と精巣の両方で発現：Dio3、Dlk1、Gpr1、Gtl2、Igf2r、Igf2、Inpp5f、Peg10, Ndn、Nnat、Rasgrf1、Rtl1、Snrpn（図3a, b）。主な焦点となる差別的発現遺伝子は、Dlk1、Gtl2、Rtl1、Dio3を含むDlk1/Dio3インプリント領域。

Dlk1/Dio3インプリント領域の発現

インプリントDlk1/Dio3領域は、遺伝子座対立遺伝子上に3つのタンパク質コーディング遺伝子（Dlk1、Gtl2、Rtl1、Dio3）を含む[20]（図4c）。SiO₂ NP処理への肺と精巣組織応答におけるDlk1/Dio3領域の役割を解明するため、対照群と比較してDMRのメチル化パターンを解析。肺と精巣で異なる遺伝子がメチル化の標的となる。Dlk1とDio3の発現が肺と精巣の両方でアップレギュレーション、Rtl1は精巣のみでアップレギュレーション（図4a, b）。

Dlk1/Dio3 DMR領域のメチル化

遺伝子発現変化がDNAメチル化に応答するかさらに調査するため、マウス肺と精巣でのこの領域のメチル化状態を解析。DNAメチル化解析で、CpGアイランドの3区分の配列を決定。精巣では低メチル化だが、CpGアイランド1で有意な高メチル化（図5）。肺では精巣と同様の全体的メチル化パターンながら、CpGアイランド2で高メチル化を示す（図6）。

考察

ナノ材料の用途拡大は、ヒト健康と環境への潜在的影響への懸念を高めている。先行研究でSiO₂ NPが肺炎症や老齢ラットの心筋虚血損傷など、肺と心血管損傷を引き起こすことが示されている[21]。さらに、ナノ粒子は生殖系列に影響を与える可能性があり、そのような細胞はAg NPの毒性効果により敏感で、より低用量で悪影響を示すことが分かっている。Ag NP曝露はラット精子細胞の異常数を増加させ、アクロソームと形質膜の完全性を低下させ、ミトコンドリア活性を減少させた[22]。本研究は、ナノ粒子が雄性生物さらにはその非曝露子孫を標的とする可能性を評価する実験プラットフォームを用いた一連の研究の一部である。

以前のin vitro研究で、一部ナノ粒子への短期曝露がTM-4セルトリ細胞で細胞アポトーシスとインプリント遺伝子の異常発現をもたらすことを報告。これらの知見は、インプリント遺伝子の異常発現がナノ粒子による生殖毒性誘発の基盤機構となりうることを示唆[23]。さらに、以前のin vivo研究では、内分泌撹乱物質などの環境因子が、曝露された個体のみならず連続する子孫世代にも表現型や疾患状態を促進することを示した。生殖系列で永続的にプログラムされるエピミュテーションは、エピジェネティックな世代間伝達表現型を可能にする[19]。本研究の目的は、マウスモデルでのSiO₂ NP処理によるエピジェネティック状態の変化を調査し、雄性世代間伝達効果の機構的基盤を築くことである。

エピジェネティック状態とは、DNA配列を変化させずにゲノム内で起こる化学的修飾を定義する用語[24]。DNAメチル化、インプリント遺伝子、ヒストン修飾、ノンコーディングRNA発現などのエピジェネティック機構は、外因性環境においてゲノム機能に影響を与える[25]。私たちの知る限り、本研究はSiO₂ NPがエピジェネティックレベルで肺と精巣毒性を誘発することを調査した最初の研究である。

まず、ヒト肺上皮細胞株A549細胞でSiO₂ NPの急性毒性を検討。しかし、実験マウスでの知見では、環境濃度のSiO₂ NP接触後に、肺II型肺胞上皮細胞の層板障害と精巣ミトコンドリアクリステ障害が明らかになった[26]。肺と精巣病理のメカニズムをより良く理解するため、インプリント遺伝子を発現解析。ゲノムインプリンティングとは、親由来に依存して接合体の配偶子で一方の親由来対立遺伝子がサイレンシングされる現象で、このサイレンシングはDNAメチル化および/またはヒストン修飾などのエピジェネティックプロセスを介して起こる[27]。先行研究で、Dlk1/Dio3ドメインでのインプリント遺伝子発現が胎児成長[28]、ヒト思春期のタイミング[29]、代謝疾患感受性[30]に重要であることが示されている。IG-DMRがGtl2プロモーターDMRの対立遺伝子メチル化状態を規定し、Dlk1/Dio3領域全体の遺伝子発現を制御することが示唆されている[17]。このインプリント制御領域の主機能は、生殖細胞由来DNAメチル化を配偶子シグナルとして継承し、後に体細胞内で対立遺伝子特異的DNAメチル化パターンを維持すること[31]。本研究では、SiO₂ NPが肺と精巣組織の両方でDlk1/Dio3領域の遺伝子発現変化を誘導することを実証。Dlk1/Dio3領域では、父方発現遺伝子（Dlk1、Rtl1、Dio3）がNP処理後、対照群と比較して特に異常を示した。ビスルファイトシーケンシング結果は、肺と精巣で異なるレベルの低メチル化を表示。処理組織でのIG-DMRメチル化状態は概して低く、この低メチル化がインプリント遺伝子の差別的発現の機構を表している可能性がある。

結論

結論として、本結果はSiO₂ NP曝露が重要なDNAメチル化変化を誘導し、細胞損傷を引き起こす可能性があり、これらの変化がDlk1/Dio3インプリント遺伝子クラスターの発現に極めて重要であることを示唆。重要なことに、DNAメチル化の変化は肺と精巣組織の両方に影響を与える。これらの結果は、曝露モデルの子孫へのナノ粒子によるエピゲノム効果の継承と、そのようなエピジェネティック変化を媒介する分子機構の解明を目指す今後の研究において重要な役割を果たす。

略語

BALF:

気管支肺胞洗浄液

CCK-8:

セルカウンティングキット-8

DMRs:

差別的メチル化領域

EGFR:

上皮成長因子受容体

IG-DMR:

遺伝子間DMR

MPs:

マイクロ粒子

NPs:

ナノ粒子