癌胎児性抗原を超高感度で検出するための新しい磁気弾性免疫センサー

背景

癌は世界で致命的な病気の1つです[1]。患者のがんは、血清中の腫瘍バイオマーカーの濃度が一定量に達すると臨床的に検出できます[2]。したがって、腫瘍マーカーの高感度、高速、正確なアッセイを達成することが非常に必要であり、これは癌の診断のための効果的な戦略を提供します[3]。癌胎児性抗原（CEA）は、分子量180〜200kDaの細胞表面糖タンパク質のファミリーです。それは1965年にヒト結腸癌組織で最初に発見されました[4、5]。 CEAは通常、健康な成人の血液中に非常に低いレベル（0〜5 ng / mL）で存在します[6]。一般に、CEAの異常なレベルは、胃癌[7]、膵臓癌[8]、結腸直腸癌[9]、肺癌[10]、および乳癌[11]などの癌の徴候と見なすことができます。これは、CEAが腫瘍バイオマーカーとして使用できることを意味します。血液中のCEAレベルのモニタリングは、癌の事前警告、スクリーニング、および診断に利用できます。一方、CEAは、臨床的に治療を受けた患者の追跡調査にも使用できます。腫瘍再発に対するCEAの感度は80％を超えており、これは臨床的および病理学的検査よりも早いです。したがって、CEAの継続的な観察は、治癒効果の診断と予後の重要な基礎を提供します[12]。

バイオセンサーは、生物学的分子出力の測定可能な信号の特定の認識に何らかの分野で応答し、迅速な応答、高感度、および低コストを可能にします。最近、酵素的イムノアッセイ[13]、フルオロイムノアッセイ[14]、電気化学的イムノアッセイ[15,16,17]などの免疫学的バイオセンサーが集中的に研究されています。その優れた特異性と感度により、免疫センサーは、標的化合物が非常に低濃度である場合でも、腫瘍バイオマーカーの分析に有望な手段を提供しました[18、19、20、21]。

ナノテクノロジーは、バイオセンシング技術にナノ粒子（NP）を適用するための新しい方法を提供しています。金属NPは多くの特別な特性を示し、生体認識要素をインターフェースするための優れたプラットフォームを提供します[22、23]。 NPに基づくイムノアッセイは研究者にとって大きな注目を集めています[24、25、26]。磁気弾性バイオセンサーは、周囲温度やpHの影響を受けず、応答感度が高くなっています。したがって、本研究では、金ナノ粒子（AuNPs）と磁気弾性マイクロチップに基づく磁気弾性イムノアッセイ法を提案しました。 CEAバイオマーカーを検出するための免疫センサーの開発に成功しました。

結果と考察

磁気弾性（ME）マイクロチップのリボン状の形状を考慮すると、透磁率はその長さに沿って最大になります[27]。予備的な結果は、MEチップの最適な幅と厚さがそれぞれ1mmと28μmであることを示しています[28]。図1bに示すように、シミュレーションを使用してチップの長さを最適化しました。

MEチップの最適な長さ。 a 相対変位は長さの変化により異なります。 b シミュレーションを使用してチップの長さを最適化しました

相対変位は、図1aの長さの変化によって異なります。最大相対変位は、1次モーダル解析で長さが6mmのときに得られます。理論的に最高の感度を意味します。したがって、この論文では、チップの最適な寸法を6mm×1mm×28μmと設計しました。

Nano-MEバイオセンサーの概略図を図2に示します。まず、Nano-MEチップをシステインで化学的に処理し、固定化のための機能層として、表面に自己組織化分子（SAM）フィルムを作製しました。 CEAAb。次に、ウシ血清アルブミン（BSA）は、非特異的結合と立体障害を減らすことにより、CEAAbの性能を促進します。チップの表面形態を観察するために原子間力顕微鏡（AFM）画像を実施した。図3aに示すように、SAM層の厚さは120nmでした。図3bの画像は、CEAAbが粗さの増加とともにSAM層に共有結合していることを示しています。図3cには、CEAが明確に認識され、効果的に組み合わされており、高さが約200 nmで、サイズが大きいことが明確に示されています。

構築されたNano-MEバイオセンサーのスキーム

SAM層のAFM画像（ a ）。 CEAAb-SAMレイヤー（ b ）。 CEA-CEAAb（ c の複合体 ）

チップの特定の寸法では、抗体の濃度は免疫センサーの感度に関連する重要な要素です。したがって、さまざまな濃度のCEAAb（図4aに示すように、20、50、70、および100μg/ mL）の応答シグナルを評価する必要がありました。結果は、CEAAbの濃度が50μg/ mLの場合、約448 Hzで最適な応答が得られたことを示しています（図4b）。 CEAAbの濃度が70μg/ mLに増加すると、立体障害と静電反発力のために応答が低下し始めました[29]。

a 周波数応答対CEAAbの曲線。 b 頻度ヒストグラム

原則として、CEAは抗体で特異的に認識され、応答頻度の低下につながります。図5aは、CEAに対する免疫センサーのリアルタイム応答曲線を示しています。一方、図5bの線形フィッティング曲線を取得します。

リアルタイムの応答（ a ）およびフィッティング曲線（ b ）バイオセンサー対CEAの

一般的に、センサーの安定した応答は40分で達成されました（図5a）。共鳴周波数の変化は、CEAの対応する濃度で記録されました。 Hzの変化は、0.1〜100 ng / mL（ R ）の範囲のCEA濃度の対数に直線的に依存します。 ² =0.9688）、検出限界は2.5 pg / mLです（図5b）。私たちの知る限り、線形範囲と検出限界は、以前の方法[28]よりも明らかに低くなっています。結果は、CEAに対するワイヤレスで高感度の方法が成功裏に確立されたことを示しました。

結論

この貢献において、CEAの高感度検出のためのNano-ME免疫センサーは、MEチップに基づいて首尾よく開発されました。 AuNPとBSAは、感度と安定性を効果的に改善しました。提案されたNano-ME免疫センサーは、0.1〜100 ng / mLの幅広いCEAの測定範囲を示し、2.5 pg / mLの低い検出限界を示します。したがって、調製されたままの免疫センサーによるCEAの正確な決定は、満足のいく結果で達成された。その特異性、単純さ、および再現性の恩恵を受けて、提案されたプラットフォームは、非侵襲的癌検出の開発における有望なアプリケーションを示しています。

メソッド

時間とともに変化する磁場の下で、MEマイクロチップは長さに沿って振動します。 MEマイクロチップを振動させるための変調磁場では、磁場のエネルギーが弾性ポテンシャルエネルギーに変換されて最大値に達します。リボン状のセンサーチップの形状により、透磁率はその長さに沿って最大になります。したがって、入射磁場は、センサーの基底面に垂直な方向を除いて、ほぼすべての方向からセンサーに縦振動を発生させます。式で与えられる。 （1）：

ここで E は弾性係数 v を示します はポアソン比、ρ はセンサー材料の密度であり、 L はチップの縦方向の寸法です。試験温度、湿度、その他の環境パラメータが一定の場合、磁気弾性センサーの共振周波数の変化は、質量変化（△ m ）のみに敏感に依存します。 ）その表面上で、式で与えられるように。 （2）

式に基づく。 （2）、共振周波数の変化はCEAの量に比例します。したがって、CEA濃度は、周波数の変化によって達成できます。ここで、 f ₀ は初期共振周波数 M は初期質量△ m は質量変化であり、△ f はセンサーの共振周波数のシフトです。式2は、センサーの感度（△ f /△ m ）は、センサーの初期磁気弾性質量（M）に反比例します。物理的寸法が小さいセンサーは、初期質量が小さいため、感度が高くなります。式の負の符号は、頻度の減少を表します（△ f ）非磁気弾性質量の追加（△ m ）センサー上。したがって、標的生物がバイオセンサー表面に結合すると、質量が増加し、それに対応して基本共振周波数が低下します。

Metglas合金2826MB（Fe40Ni38Mo4B18）の磁気弾性ベースは、Honey well Corporation（Morristown、NJ、USA）によって処理されました。 CEA、CEA抗体、ウシ血清アルブミン（BSA、99％）、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH =7.4）はSangon（上海、中国）から購入しました。アセトン、イソプロパノール、エタノール、1-エチル-3-カルボジイミド（EDC）、および N -ヒドロキシスルホスクシンイミド（NHS）は、Sigma-Aldrich Corporation（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。他のすべての試薬は分析グレードのものでした。超純水はMill-Qシステム（Milli-pore、USA）から入手しました。 AFMパークシステム（ND-100、韓国）、プラズマ（P3C、上海、中国）、ガウス抵抗計（GM500）、ZNBベクトルネットワークアナライザー（R＆S、ドイツ）、レーザーカッター（AV3620A、青島、中国）、およびHT20ガウスメーター（Hengtong、Shanghai）が使用されました。

合金MEベースを6mm×1mm×28μmマイクロチップにレーザーカットし、アセトン、イソプロパノール、エタノール、脱イオン水で5分間超音波洗浄し、窒素で乾燥させました。洗浄されたマイクロチップの表面改質の活性化は、プラズマ法によって処理されます。マイクロチップの両面をクロム層（100 nm）でスパッタリングした後、AuNP層（40 nm）でコーティングしてNano-MEチップを作製しました。 Nano-MEチップは、高純度酸素（0.9999）を含む血漿を処理し、40 mMシステアミン溶液に浸して、室温で12時間保持します。その後、Nano-MEチップを生物学的に修飾し、1-エチル-3-カルボジイミド（EDC）および N の存在下で、さまざまな濃度のCEAAbとともに37°Cで1時間インキュベートしました。 -ヒドロキシスルホスクシンイミド（NHS）。 CEAAbは、最初に10 mg / mLEDCおよび10mg / mLNHSで活性化されました。最後に、CEAAbで修飾されたNano-MEチップを、0.1％BSAで30分間さらに実施しました。

Nano-MEバイオセンサーは次のように構成されました：ガラス管がコイルで包まれ、ベクトルネットワークアナライザーに接続されました。一方、磁場を加えると交流電流が供給され、コイルに交流磁場が発生します。 Nano-MEバイオセンサーの共振周波数は、ベクトルネットワークアナライザーで取得できます。さまざまな濃度のCEA（0〜100 ng / mL）を試験管に加え、周波数シフトを5分ごとに40分まで記録しました。その後、AFM特性評価のためにNano-MEチップをPBSですすいだ。

略語

AFM：

原子間力顕微鏡

AuNPs：

金ナノ粒子

BSA：

ウシ血清アルブミン

CEA：

癌胎児性抗原

CEAAb：

CEA抗体

EDC：

1-エチル-3-カルボジイミド

Hz：

頻度

ME：

磁気弾性

NHS：

N -ヒドロキシスルホスクシンイミド

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

SAM：

自己組織化分子