形状選択的な細胞取り込みのための成長する金ナノ構造

背景

金ナノ構造（NS）は、形状やサイズに依存する光学的および電子的特性により、さまざまな生物医学的用途で使用されてきました[1]。 Au NSは、変更可能で環境に敏感な局在表面プラズモン共鳴（LSPR）を表示します[2]。可視範囲内のAuLSPRは、バイオセンサーの適切な候補であり、コンピューター断層撮影（CT）[3、4]および光音響イメージング[5]の優れた造影剤です。さらに高いアスペクト比（AR、縦方向と横方向の寸法の比として定義）を持つNSは、縦方向のプラズモン波長でより効率的に光を散乱するため、球面NPよりも光学イメージングアプリケーションで優れたパフォーマンスを発揮します。 NSが小さいほど吸収効率が高くなり、光熱療法の効率が向上します[6、7、8、9]。また、異方性構造は最近、効率的な消光、非常に高いモル吸光係数、高度に局所化された強力な電磁場の発生に起因する優れたプラズモン特性を備えた自己組織化構造を形成するために使用されています[10、11、12、13]。 Au NSのアスペクト比とサイズを調整できるため、さまざまな構造を合成して、局所的な加熱、センシング、カプセル化、ターゲット分子の放出など、さまざまなアプリケーションに対応できます[14、15、16]。

Au NSは通常、電気テンプレート[17]、光化学的還元技術[18]、またはシード成長（Agの有無にかかわらず）を使用して合成されます[19、20]。近年、シード成長合成は、NS成長の制御を可能にするために有機添加剤または二成分界面活性剤混合物を使用することにより、さらなる変更の対象となっています[21、22、23、24、25]。採用された合成条件は、サイズと形状を調整することによってAu NSの特性を調整することを可能にし、それによってNSの散乱断面積と吸収断面積を変更します。 NSが生物学的環境に導入されると、これらのAu NSの物理化学的特性（サイズ、形状、および表面化学）は、細胞への取り込み、つまりナノ粒子と細胞の相互作用において重要な役割を果たします。このような相互作用を理解することは、さまざまな形状のAu NSを利用する新しい生物医学アプリケーションを探索するために不可欠です[26、27、28、29、30]。たとえば、Auナノロッドを使用して、癌細胞に細胞温熱療法を誘発し、細胞機能を妨害する可能性があり、場合によっては、ロッドの表面修飾によってそれらを変化させることができます[30、31、32、33、34]。 Chen etal。 Auナノケージは乳がん細胞の標的光熱破壊に使用できると報告されています[35]。また、最近の報告では、ナノ粒子の形状がサイズよりも細胞への取り込みを同等またはそれ以上決定している可能性があることが示されています[36、37]。これには、in vitroで説明するのに重要な他の点では同一の条件下で、いくつかの形状のスクリーニング（つまり、さまざまな形状のAu NSと細胞との相互作用）が必要です。 私たちの知る限り、球体とナノロッド以外のさまざまな形状のAu NSと細胞との相互作用を調査する包括的な研究は存在しません[38、39]。

ここでは、5つの異なる形状のAuNSと膠芽腫-星状細胞腫細胞との相互作用およびそれらの細胞取り込みを調査します。多形性膠芽腫（GBM）は、最も攻撃的な悪性ヒト脳腫瘍の1つとして分類されます。 GBMに苦しむ患者の予後は不良であり、化学療法と標準治療による平均生存期間は15か月未満です[40、41]。膠芽腫-星状細胞腫は、医学的観点からだけでなく、それらの急速な成長のためにも、取り込み研究にとって特に興味深いものです。膠芽腫-星状細胞腫の細胞培養は、人口倍加時間が32時間であり、細胞外栄養素を継続的に必要としています。このため、Au NSなどの異物を急速に飲み込む可能性が高く、これは、たとえば、温熱腫瘍の切除[42]、細胞標識、または薬物送達のために開かれます。

現在の作業では、5つの異なる形状のAu NSが合成されています。4つの異方性NS（ナノロッド-NR、ナノマクラ-） NM、テトラヘキサヘドラ––THH、双角錐––BP）は、二成分界面活性剤混合物と修正ターケビッチ法を使用した球状（SP）粒子を使用したシード媒介成長アプローチによる[43]。 NSの形状は、2つの異なる界面活性剤の比率を変えることで調整できます。 2段階のシード媒介成長プロトコルに従った場合、Au nano makura （マクラ 枕は日本語です ）合成されました。 Au NSを膠芽腫-星状細胞腫細胞と共培養する前に、不動態化リガンドを11-メルカプトウンデカン酸（MUA）に置き換えるために、2段階の表面修飾を行いました。膠芽腫-星状細胞腫細胞における細胞毒性とNSの取り込みに対する形状と濃度の影響を評価しました。

実験的

資料

オレイン酸（OA、90％）はAlfaAesarから購入しました。硝酸銀（AgNO ₃ ）、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド（DDAB、98％）、クロロ金酸（HAuCl ₄ .3H ₂ O、99.999％）、D-（-）-イソアスコルビン酸（AsA、98％）、水素化ホウ素ナトリウム（NaBH _4、 ≥96％）、11-メルカプトウンデカン酸（MUA、98％）、および分子量5000DaのO- [2-（3-メルカプトプロピオニルアミノ）エチル] -O-エチルポリエチレングリコール（PEG-SH）はSigma-Aldrichから購入しました。 。セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB、99％+）はAcros Organicsから購入し、クエン酸ナトリウム二水和物（Na-クエン酸塩、ACSグレード）はMerckから購入しました。すべての化学物質は、さらに精製することなく、受け取ったままの状態で使用されました。すべての溶液は、Simplicity®Millipore浄水システムで精製された蒸留脱イオン水（抵抗率〜18.2μΩ-cm）を使用して調製されました。

異方性Auの合成

異方性AuNSは、二元界面活性剤を使用したAg支援シード成長法を使用して合成されました（表1）。図1aは、NR、THH、およびBPの成長に使用される合成方法の概略図を示しています。

AuNSの合成の概略図。 a さまざまな形状のAuNSの合成に使用されるAg支援シード成長メカニズムを示す概略図。 b nano makura の2シード成長メカニズムを示す概略図

簡単に説明すると、5mLの0.5mM HAuCl ₄ .3H ₂ 0を最初に5mLの0.2M CTAB溶液と混合し、攪拌しました。その後、1.6mLの3.75mM NaBH ₄ を混合物に加え、反応中に形成されたガスを逃がすために、攪拌しながら2分間反応させました。 30分待った後、シード溶液を使用してさらに成長させました。

典型的な成長反応では、表1に示すように、CTABと共界面活性剤のさまざまな比率の水性混合物15 mLを80°Cで作成しました。界面活性剤溶液を室温まで冷却した後、AgNOの4mM溶液750μL ₃ を加え、35°Cで15分間撹拌しました。これに続いて、15mLの1mM HAuCl ₄ を追加しました。 .3H ₂ O溶液を加え、さらに15分間撹拌しながら混合します。その後、135μLの0.063 M AsAと96μLのAuシードを追加し、35°Cで24時間反応を実行しました。遠心分離を使用して生成物を分離した。 OAの場合、成長溶液の最初の黄色は15分以内（シードの追加前）に放電し、Au ³⁺ の減少を示していることに注意することが重要です。 Au ⁺ へ 。図1bは、2シード成長アプローチに基づくNMの合成の概略図を示しています。従うプロトコルは、通常のシードの代わりに中間成長溶液（300μL）（最初の成長溶液にAuシードを追加した直後に取得）を新しい成長溶液に追加し、反応を可能にすることを除いて、上記と同様です。 35°Cで24時間継続します。

球状のAuNSの合成

球状のAuNSは、修正されたTurkevich法を使用して合成されました[44]。通常の合成では、10mLの10mMクエン酸ナトリウム溶液を25mLの反応フラスコに加え、70°Cに維持しました。 10ミリリットルの1.5mMクロロ金酸（HAuCl ₄ 。 3H ₂ O）を滴下し、70°Cで激しく攪拌しながら20分間反応させました。反応後約8分で溶液は紫がかった赤に変わりました。その後、溶液を室温まで冷却し、14,500 rpmで10分間遠心分離して、未反応の溶液から球状のAuNSを分離しました。

AuNSの表面機能化

Au NSの表面の配位子を交換するために、Thierry etal。 [45]が続いた。合成されたままのNSの濃度は1mg mL ^-1 に調整されました。 機能化ステップの開始前。チオールはAu表面に対してより高い親和性を持っているため、最初のステップは、結合したCTAB二重層を部分的に置き換えるためのPEG-SH層の導入に依存します[46]。さらに、PEG-SH層はNSに立体安定化を提供します。 2番目のステップでは、残りのCTABが置き換えられ、PEG-SH層がさらにアルカンチオールMUAと交換されます。 MUAにより、立体障害のあるPEG-SHコーティングされたAu表面からCTABを完全に除去できます。

一般的な機能化手順では、1mLの1mg mL ^-1 AuNSの溶液を1mLの1mg mL ^-1 と混合しました。 PEG-SH溶液の溶液。混合溶液を激しく攪拌し続け、CTABをPEG-SHで2時間部分的に置換しました。その後、14,500 rpmで20分間遠心分離して、PEG化NSを除去し、1mLのMQ水に再分散させました。カルボン酸基でAuNSを機能化するために、500μLのPEG化NS溶液を250μLのエタノール/水で調製したMUAの10 mM溶液と混合し、55°Cに維持された音波浴で1時間反応させました。 。その後、MUAでコーティングされたAu NSを、14,500 rpmで20分間の遠心分離を使用して、遊離MUAから分離しました。 MUAでコーティングされたAuNSは、MQ水に簡単に再分散されました。

invitro研究

膠芽腫-星状細胞腫細胞培養

ヒト神経膠芽腫-星状細胞腫細胞（U-87 MG、ECACC、Sigma-Aldrich、ソールズベリー、英国）は、1.25％ゲンタマイシン（Sigma）および10％ウシ胎児血清（Autogen Bioclear、Wiltshire、英国）。培養物には、2 mM L-グルタミン、1％非必須アミノ酸（NEAA、Sigma）、および1 mMピルビン酸ナトリウム（NaP、Sigma）が追加されました。

LIVE /DEAD®アッセイ

LIVE / DEAD細胞生存率アッセイ（Invitrogen、Life Technologies）は、細胞の膜の完全性を評価し、カルセインAM（励起/放出494/517 nm）とエチジウムホモ二量体-1（励起/放出517/617）の2つの異なる色素で構成されています。 nm）。生細胞では、細胞内エステラーゼがカルセインAMと反応し、細胞質の緑色蛍光を発します。エチジウムホモ二量体-1（EthD-1）は、死んだ細胞の損傷した細胞膜上に拡散し、そこで核酸に結合して赤色の蛍光を発します。 NSで標識した後、LIVE /DEAD®細胞の生存率を、膠芽腫-星状細胞腫細胞に対して、製造元の説明に従って実行しました。簡単に説明すると、LIVE /DEAD®溶液を、2.7μLのカルセイン（Invitrogen）を含む4.5 mLのPBSで調製し、12μLのエチジウムホモ二量体（Invitrogen）を1：1（ v ）で添加しました。 / v ）比率を調整し、顕微鏡検査の前に37°Cで30分間反応させます。核染色（Hoechst 33258、励起/発光356/465 nm、Sigma）を追加しました（200μgmL ^-1 ）核を視覚化し、AuNSの核への取り込みを解明するため。イメージングは​​、AxioVision Relを使用して、Axiovert 200 M蛍光顕微鏡（Zeiss、ドイツ）で×40​​または×10の倍率で実行されました。 4.3ソフトウェア。画像は後でImageJ1.46で処理されました。

濃度に基づいた細胞毒性の評価

70％のコンフルエンシーの細胞は、NS /培地量100μgmL ^-1 の濃度のAuNSで標識されました。 、200μgmL ^-1 、500μgmL ^-1 、および2 mg mL ^-1 9ウェルプレート（Corning®）で37℃で24時間インキュベートしました。各濃度に対して3つのパラレル（ウェル）を準備しました。コンフルエンスの同じ段階にある非標識神経膠芽腫-星状細胞腫培養物を対照として使用した。死んだ細胞のパーセンテージは、手動で数えることによって計算された。膠芽腫-星状細胞腫細胞の非常に秩序のない形態は、自動カウントの信頼性を低下させます。生細胞と死細胞の3つの重ね合わせ画像を各ウェルで撮影し、各形状の平均生細胞と死細胞を計算しました。ブランクサンプルについても同じことが行われ、ブランクの平均デッド/ライブを差し引くことによって生存率が評価されました。

nano makura の時間の関数としての細胞取り込みの評価 Au NS

70％のコンフルエンシーの細胞をnano makura で標識しました NS /培地量2mg mL ^-1 の濃度のAuNS 核染色を用いたLIVE /DEAD®アッセイの前に、37°C​​で2、6、12、および24時間インキュベートしました。コンフルエンスの同じ段階にある非標識神経膠芽腫-星状細胞腫培養物を対照として使用した。細胞ペレットは、パラホルムアルデヒド（2％ v ）で一次固定する前に、トリプシンと遠心分離によってTEM用に準備されました。 / v ）およびグルタルアルデヒド（2.5％ v / v ）PBS（0.1 M、pH =7.4）で一晩。二次固定のために、細胞膜の最適な染色のために2つの異なる固定液を調製しました。どちらも、1％四酸化オスミウム（ v ）を含む0.1Mカコジル酸緩衝液で調製しました。 / v ）および1％四酸化オスミウム（ v ）を含むもう1つ / v ）および1.5％フェロシアン化カリウム（ v / v ）。室温での二次固定の1時間後、アルコールによる段階的な脱水を行った後、酸化プロピレンによる脱水、浸透、および70nmスライスのウルトラミクロトームセクショニングを行いました。

特性評価手法

明視野（BF）STEM画像は、30kVの加速電圧で動作するHitachiS-5500電子顕微鏡を使用して取得されました。高分解能透過型電子顕微鏡（HRTEM）画像は、200kVで動作するJEOL2100を使用して取得されました。 NSのサイズ分布とゼータ電位は、Malvern ZetasizerNano-ZS機器とメーカー独自のソフトウェアを使用して測定されました。動的光散乱（DLS）測定は、球状粒子の仮定に基づいており、マルチアングルの設定と結果のデータの厳密なフィッティングなしで異方性NSの流体力学的サイズを測定するのには適していません。ただし、DLSは、機能化手順から発生するサイズの変化を定性的に追跡する手段として、この調査で使用されています。すべての場合において、MQ水を溶媒として使用しました。紫外可視（UV-Vis）スペクトルは、UV-2401PC（島津製作所）分光光度計で取得しました。スペクトルは、200〜800nmのスペクトル範囲で収集されました。 X線光電子分光法（XPS）分析は、10mAおよび15kV（Al、hν=1486.6 eV）で動作する単色化アルミニウムX線源（Al、hν=1486.6 eV）を備えたKratos Axis Ultra DLD分光計（Kratos Analytical、英国）を使用して実行されました。 150 W）。調査スペクトルは、アナライザーの通過エネルギーが160 eVで、0〜1100eVの結合エネルギーの範囲で収集されました。ハイブリッドレンズ（静電および磁気）モードが、約300μm×700μmの分析領域とともに採用されました。

結果と考察

異方性AuNSの合成と特性評価

異方性AuNSは、二元界面活性剤混合物を使用するシード媒介成長アプローチを介して合成されました。 CTABでキャップされたAuシード（〜5 nm）を二成分界面活性剤混合物の成長溶液に加えると（OA CTABのモル比〜20：1）、低アスペクト比のAu NRが形成されました（図2aおよび表2）。 HRTEM画像は、NRの単結晶および犬の骨の形態を明らかにしました（図2aの挿入図）。弱い還元剤としても機能する脂肪酸であるOAは、Au ³⁺ の還元を促進します。 Au ⁺ へ 。成長溶液の色が黄色から透明に変化したこと（〜15分）により、観察結果が確認されました。成長溶液にアスコルビン酸をさらに添加すると、Au ⁺ の還元速度が増加します。 。その結果、混合ミセル構造のパッキングはNRの側面{110}および端{100}と比較して密度が低いため、Au原子はNRの端{111} [16]ファセットで急速に拡散します[25]。したがって、側面の{110}および{100}ファセットよりも端の{111}ファセットでのNRの異常増殖は、犬の骨の形態のNRの形成につながります。我々の結果はまた、他のファセットと比較して、これらのファセットと界面活性剤分子との強い相互作用のために、{110}ファセットがAuでコーティングされる可能性が低いことを示唆している。また、犬の骨の形態のAuNRの形成におけるOAとアスコルビン酸の役割を確認しました。成長溶液中のOAまたはアスコルビン酸の濃度を下げると、AuNRのみが得られました。これらの結果は、金原子の還元速度と拡散速度が低下し、Au NRが形成されたことを示しています（追加ファイル1：図S1、ESI†）。

さまざまな形状のAuNSのSTEM画像とUV-Visスペクトル。 a 犬の骨の形態のAuNRのBF-STEM画像と挿入図のHRTEM画像は、NRの単結晶性を示しています。 b 細長い四面体AuNSのBF-STEM画像（挿入図はSEM画像）。 c Au BPのSEM画像（挿入図は単一BPのSEM画像です）。 d Au球状粒子のTEM画像（挿入図のHRTEM画像はAu粒子の多結晶性を示しています）。 e AuNMのBF-STEM画像。 f さまざまな形状のAuNSのUV-visスペクトル

成長溶液中でCTABに対するOAの濃度を上げると（表1）、細長いTHH形状のAu NSが得られました（図2bおよび表2）。 Au NSの形状の変化は、OAによる混合ミセル構造の修飾に基づいて説明することができます。棒状の混合ミセル構造は、低濃度のOAで形成されます。混合ミセル構造におけるOAの量の増加は、その構造を凸状に変更し、細長いTHH AuNSの形成を促進します。私たちの以前の研究はまた、共界面活性剤の濃度の増加が混合ミセル構造をより凸状にすることを明らかにしました[25]。 Au NSの形状は、OAをDDABに置き換えることによっても変更できます。以前の研究[25]で報告されているように、CTABとDDAB（図2cと表2）を使用して双角錐（BP）形状のAuNSを取得しました。さらに、球状のAu粒子は、修正されたTurkevich法によって合成されました（図2d）。

また、AuNSの形状に対するシード溶液の影響を調査しました。シード溶液は、反応の1分後にCTABとOAの成長溶液（OA：CTAB〜20：1）から採取され、OA：CTAB〜20：1を含む新しい成長溶液に添加されました。 nano makura のAuNS （NM）形態は、成長反応の完了後に得られました（図2e）。 NMの形態は犬の骨に似ているように見えます。ただし、さまざまな角度で撮影されたTEM画像（図3aおよび表2）に示されているように、NSはすべての方向に成長するため、これらのNSをNMと呼びます。 Au NMの成長メカニズムを説明するために、さまざまな時間間隔で成長溶液から少量を採取し、STEMイメージングを使用して中間反応を分析しました（図3b）。 CTABでコーティングされたシード粒子を最初の成長溶液に加えると、成長溶液の色が急速に濃い紫色に変わり、異方性のAuNSが形成されたことを示します。最初の成長溶液からの300μLの溶液を2番目の成長溶液に加え、その後、溶液を数滴TEMグリッドにすぐに加えました。

Au NM（nano makura ）の形態と成長 ）。 a さまざまな角度で撮影されたNMのTEM画像。 b BF-STEM画像は、NMタイプのAuNSの形成における成長ステップを示しています。さまざまな時点で成長溶液から採取した溶液を、精製せずにTEMグリッドに直接追加しました

代表的なSTEM画像は、横方向（0秒）よりも縦方向の方がAuNMの成長が比較的速いことを示しています。 30秒後、蝶ネクタイの構成に似たNSが見られました。最終的なサイズのNMは、反応の約3分ですでに観察されています。 30分と8時間後に、NSの形状とサイズにそれ以上の変化は見られませんでした。私たちの分析に基づくと、Au NMの全体的な成長は、確率論的な「ポップコーン」のような自己触媒成長メカニズムに従っていると仮定できます。このメカニズムでは、個々の種子がしばらく休眠状態になり、その後、突然急速に最終的な形状に成長します。 CortieらによってNRについて観察されました。 [47]。 NMは、以前に報告された犬の骨の形をしたNS [48、49]とは異なり、さまざまな回転角で取得されたNMのHRTEM画像（図3a）で示される3次元構造を持っています。

さまざまな形状のAuNSの光学特性を測定し、その結果を図2fに示します。 Au NSは、UV-Vis-可視-近赤外線（IR）範囲で調整可能なLSPR特性を示します。プラズモンバンドは、異方性構造のマルチプレットに分割されます。これは、異なる軸に沿った共鳴振動により、縦方向と横方向のバンドです。 NRは、少なくとも3つの異なる帯域（–516 nm、679 nm、および796 nm）を示し、最も強い帯域は中央の帯域です。 3番目のバンドの出現は、オレイン酸のエッチング効果によって引き起こされるNRの多分散性に関連している可能性があります。これにより、エッジが粗いナノロッドが形成されます。ナノロッドよりもギザギザの表面を持つNMでは、横方向と縦方向の両方の共鳴ピーク（それぞれ557nmと760nm）が観察されます。ただし、より大きな構造（THHおよびBP）の場合、単一および広いLSPRピークがそれぞれ568nmおよび593nmで観察されます。 THHのUV-visスペクトルは以前の研究[50]と同様の類似性を示していますが、BPの2つのモードは、他の方法で観察されたものとは異なり、広いピークに融合しているようです[51]。これは、BP形状の収率が低いか、Au NSに適用された非形状選択的遠心分離、または溶液中での形状異方性につながる不均一なコーティングに起因する可能性があります。

AuNSの表面機能化

異なる形状のAuNSは、二重層CTABをO- [2-（3-メルカプトプロピオニルアミノ）エチル] -O-メチルポリエチレングリコール（PEG-SH）に、続いてMUAに置き換えるという2段階の方法を使用して機能化されました。図4aは、機能化の各段階でのNSの流体力学的直径を示しています。各NS（BPを除く）について、CTABでコーティングされたNSと比較すると、サイズの連続的な増加が得られ、機能化が成功したことを示しています。 DLS測定は球状粒子の仮定に基づいているため、異方性NSのサイズ決定分析は、異方性NSと同じ拡散係数を持つ球状NSに近似する必要があります。

AuNSのサイズとゼータ電位。 a 機能化の各段階後のAuNSのDLSサイズの変動。 b 機能化の各段階でのAuNSのゼータ電位の変化。 X -軸は、さまざまな形状のAuナノ構造を表します（NRナノロッド、THHテトラヘキサヘドラ、NMナノマクラ 、BP双角錐、SP球形）

これにより、PEG-SHでコーティングされたBPのサイズがわずかに減少することが明らかになり、上記のUV-visデータもサポートされます。機能化の結果、NSの表面電荷は図4bに示すように大幅に減少します。カチオン性界面活性剤は、PEG-SHで容易に置換されますが、Au表面への親和性が高いため、MUAにさらに置き換えられます。 MUAのサイズが小さいため、PEG化後もNSに残っているCTABを置き換える柔軟性が高くなります。 MUAでコーティングされたNSの最終的なゼータ電位値は、NRを除くすべてのNSの負に帯電した表面を反映しています。この不一致は、小さなNRの不均一なコーティングまたはそれらの多分散性、および適用される測定原理に関連している可能性があります。球状NSの場合、最初の負の表面電荷はクエン酸塩コーティングによるものです。ただし、すべてのNSのゼータ電位の大きさが大きいと、水溶液中でのNSの安定性が保証されます。機能化の各段階の後にAuNSで実行されたXPS測定、つまりPEG-SHとそれに続くMUAは、表面の臭素含有量が非常に低いことを示しており、NSの表面から大量の結合CTABが除去されていることを確認しています。 （表1、ESI）。

さらに、NSをPEG-SHおよびMUAでコーティングしても、光学特性が劇的に変化することはありません。ただし、異方性NSの機能化後に、連続的なピークの広がりが得られます（追加ファイル1：図S3、ESI†）。これは、異方性、不均一なコーティング、サイズの拡大（DLSデータ）、サンプルの多分散性、または上記の組み合わせによるNSの回転軸の違いが原因である可能性があります。 Au NSの光学特性は、形状、表面、サイズ、および凝集状態に依存するため、細胞との相互作用も異なります。細胞相互作用の研究は、Au NSがどの程度取り込まれるか、それらの細胞毒性効果を明らかにすることができ、将来の治療および診断への応用を示すことができます。

さまざまな形状のAuNSの細胞間相互作用

一般に、Au NSは、受容体を介した、または受容体に依存しないエンドサイトーシス、アクチン依存性の食作用、または他の現在未知のエンドサイトーシス経路を介して細胞に侵入します[52]。 NSがどのルートをたどるかを説明することは、NSの細胞内運命を最終的に決定するため、非常に重要です[53]。研究によると、細胞内取り込みのメカニズムは、物理化学的特性、AR、NSの表面特性、および細胞型に依存することが示されています[54、55、56、57、58]。表面安定化分子の電荷は、事実上NSの電荷になります[59]。正に帯電したNSは、生物学的媒体に強力なタンパク質吸着を示し、細胞膜に深刻な損傷を与える可能性があります。このため、細胞膜への強い吸着および/またはタンパク質の吸着を避けるために、中性または負の電荷が好ましい[26、60]。さらに、NSの形状によって、安定化分子の表面被覆率がどの程度均一であるかが決まります[61]。

ここでは、球状NSを除くすべてのAu NSが、界面活性剤CTABを使用して合成されました。細胞相互作用の研究の前に、Au NSをMUAで機能化して、負に帯電した表面を獲得しました。続いて、安定したMUAコーティングされたAu NSをヒト神経膠芽腫-星状細胞腫細胞と24時間共培養し、細胞毒性に対する形状と濃度の影響を、細胞内AuNSを強調するために核染色を添加したLIVE /DEAD®アッセイで評価しました。 。

最高の細胞死は、高濃度のNMで観察され（図5a）、ブランク補正後の細胞死は20％近くでした。他のNSは細胞毒性において同じ傾向を示さなかった。これは、NMが他の形状よりも高い速度/量で取り込まれていることを示している可能性がある[62]。これらの形状の細胞数を数えると、ブランク補正後に5％未満の細胞毒性が示されました（すべての形状の画像については、追加ファイル1：図S4、ESI†を参照してください）。

膠芽腫-星状細胞腫細胞に対するAuNSの効果。 a Percentage cell death of glioblastoma-astrocytoma cells as a function of concentration of AuNSs. Incubation time was 24 h. Images b –m are acquired after incubation of makura -shaped AuNSs in glioblastoma-astrocytoma cells taken at several time points up to 24 h. b TEM shows an invagination of the cellular membrane (m membrane, scale bar = 1 μm), and c halogen and d fluorescence images show association of makura-shaped AuNSs at the cellular membrane. e Uptake of makura-shaped AuNSs were observed after 6 h (scale bar = 500 nm), f with uptake in intracellular vesicles (v vesicle, scale bar = 2 μm). g Staining of the nucleus (n ) suggests that makura-shaped Au NSs were excluded from the nucleus. h TEM images taken after 12 h suggest uptake via macropinocytosis (scale bar = 500 nm), with i intravesicular location of makura-shaped AuNSs (vm vesicular membrane, scale bar = 500 nm). j Intracellular compartmentalization was also visible from the microscopy. Uptake of makura-shaped AuNSs continued at 24 h as seen in TEM images k (scale bar = 2 μm) and l (scale bar = 5 μm). m Detachment of glioblastoma-astrocytoma cells from the surface was observed, which most likely is an indication of cell death

The data presented here suggest that size plays a minor role in cytotoxicity in glioblastoma-astrocytoma cells. For instance, the small spherical NSs (15 nm) showed the same uptake/cytotoxicity as the large BPs (650/270 nm). Based on previous studies, we expected the NRs to give the highest cytotoxicity, due to their AR and surface charge. Positively charged NSs are considered to be particularly toxic as they can induce apoptosis [63] and cause the production of reactive oxygen species [64]. However, in the data presented here, the positively charged NRs did not show increased cell death compared to any other shape (Fig. 5a). This might be explained as follows:the surface charge of NS was determined with zeta potential measurements, an approach based on spherical particle assumption (Table 2). Thus, the reported charge of the NRs most likely misrepresents their actual charge. Although the AR of the rods synthesized here is large (2.8), their overall size falls in a size range that shows good uptake in cells (20–50 nm). [30, 65] A previous study has suggested that the size of NS does not only seem to govern endocytosis but also exocytosis. For instance, the removal half-life of 14 nm AuNS was much faster than removal half-life of 74 nm AuNS [26]. Here, the smaller Au rods and spheres, may, therefore, have been removed via exocytosis, which may explain their low cytotoxicity.

The main feature of the NM is not their size, but their irregular structure, and it appears from the image in Fig. 5a that shape has been the determining factor for the high uptake. However, an irregular morphology may have undermined the surface coverage of MUA and as such decreased the solution stability of the NM. Also, we cannot exclude that as two-dimensional cell studies are affected by gravity, a low stability in the cell medium increases the likelihood of sedimentation which can propel the endocytosis.

To get further insight into the uptake mechanism and interactions, we followed uptake of NM at high concentration (2 mg mL ⁻¹ ) with light microscopy and TEM for 24 h. The images show that after 2 h of co-incubation, the NM associate with the cellular membrane (Fig. 5c, d) and are engulfed by the cells (Fig. 5b, e). The mechanism of endocytosis seems to be initially receptor-mediated (Fig. 5b) and at later stages through macropinocytosis (Fig. 5h). The latter is believed to occur when large objects enter a cell, and the aggregation of NSs may have induced macropinocytosis. This might mean that the initial solution stability of the Au NM is sufficient, but that with time they aggregate and are taken up as larger species, most likely due to protein adsorption. Uptake of any extracellular NS in an intracellular vesicle involves wrapping of the cell membrane. If many such wrapping events occur, this alters the global elasticity of the cell membrane, which in turn affects the membrane integrity. If many macropinocytosis events occur, the membrane integrity may be severely impaired. This is believed to be one of the effects for the cytotoxicity observed for the NM.

Once inside the cell, it appears that the Au NM align at the periphery of the vesicles, adhering to the vesicular membrane (Fig. 5i). The endosome seems to be trafficked towards the nucleus (Fig. 5f, g, and l), which is consistent with previous studies that show that Au NSs taken up via receptor-mediated endocytosis may eventually end up in the Golgi apparatus [53, 66]. The uptake appears to continue upto 24 h (Fig. 5k), owing to the high concentration gradient of Au NS in the cell culture media [59].

At 24 h with co-incubation, the morphology of the cells changes (Fig. 5m), going from star-shaped to a more rounded shape with less visible filopodia [67], followed by detachment from the surface. Although this study does not go further in the molecular events following uptake of NS, a detachment of filopodia may suggest that NM can interact with the cytoskeleton and cause detachment and apoptosis.

We extended the cytotoxicity assay beyond 24 h and investigated the result of co-incubation at 48 and 72 h, the reason being that few cell studies are performed at these time points [68, 69], and the main argument being that cellular uptake reaches a plateau at 24 h [70]. Our results show (Additional file 1:Figure S5, ESI†) that beyond 24 h, the cells continued to detach from the flask surface, i.e., cell death and uptake continue beyond 24 h. As we cannot exclude that starvation of the cells would have increased the cytotoxicity and detachment, a cytotoxic response is a dynamic process likely to evolve over time differentially.

Conclusions

In summary, we have synthesized five different shapes of Au NSs using a seed-mediated growth approach (nanorods, nanomakura , tetrahexahedral, bipyramidal) and the Turkevich method (spherical). These NSs have different sizes:the smallest being the NRs and the largest being the BPs, ranging from 22 to 156 nm. Their optical properties measured using UV-vis spectroscopy show LSPR span from UV, visible, to near IR. High values of zeta potential render good stability in aqueous solution. With an aim to exchange the cationic surfactant on the surface, a two-step functionalization protocol was employed to replace the CTAB with PEG thiol and MUA.

After coating, the NSs showed a decrease in surface charge, coupled with an increase in size, proving successful functionalization. In vitro studies were performed for all the synthesized NSs involving co-incubation with glioblastoma-astrocytoma cells for 24 h. The greatest cytotoxic response (~ 20%) was observed with NM at high concentration, which is consistent with higher uptake. An in––depth study with TEM revealed a time-dependent internalization in cancer cells via endocytosis and macropinocytosis. This successful internalization of the Au NM in cancer cells, coupled with their unique physicochemical properties, render them suitable for hyperthermia and drug delivery to cancer cells while being simultaneously imaged.

略語

AgNO₃ ：

Silver nitrate

Au：

ゴールド

BF:

Bright filed

BPs:

Bipyramids

CTAB：

セチルトリメチルアンモニウムブロミド

DDAB:

Didecyldimethylammonium bromide

DLS：

動的光散乱

EMEM:

Eagle’s Minimal Essential Medium

EthD-1:

Ethidium homodimer-1

GBM:

Glioblastoma multiforme

HAuCl4:

Cholorauric aicd

HRTEM：

高分解能透過型電子顕微鏡

IR：

赤外線

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

MUA:

11-Mercaptoundecanoic acid

Na-citrate:

Sodium citrate dihydrate

NM:

Nanomakura

NRs:

Nanorods

Ns:

Nanostructure

OA：

オレイン酸

PEG-SH:

O-[2-(3-Mercaptopropionylamino) ethyl]-O-ethylpolyethylene glycol

STEM:

Scanning transmission electron microscopy

TEM：

透過型電子顕微鏡

THH:

Tetrahexahedra

UV-Vis:

紫外可視

XPS：

X線光電子分光法