HER2発現癌のinvivoMRイメージング用のアプタマー修飾磁気ナノ増感剤

背景

上皮成長因子受容体（EGFR）ファミリーに属するヒト上皮成長因子受容体2（HER2）は、ヒトの悪性腫瘍において重要な役割を果たし、ヒトの乳がんの約30％[1]および他の多くのがんの種類で過剰発現しています。 、胃、膀胱、卵巣、および肺の癌を含む[1,2,3,4]。 HER2過剰発現乳がんの患者は、非過剰発現HER2がんの患者よりも生存率が大幅に低くなる傾向があります[5]。さらに、HER2の過剰発現は、乳がんの転移を増加させます[6,7,8]。このため、HER2は癌の診断における重要なバイオマーカーとして機能します。臨床現場では、HER2は、乳がんを診断するために、エストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）とともに、典型的な生物学的マーカーとして使用されます。したがって、乳がん患者は、HER2、ER、およびPRの発現レベルの組織学的検証に続いて明確な診断を受けます。ただし、組織学的検証は侵襲的であり、限られた数の病変でのみ実行されます。このため、コンピュータ断層撮影[9、10]、ポジトロン放出断層撮影[11、12、13]、単一光子放射型コンピュータ断層撮影に基づく組織学的検証の前に、放射線検査を介して非侵襲的に診断マーカーを視覚化するためにさまざまな研究が行われてきました。 [14,15,16]、磁気共鳴画像法（MRI）[17,18,19,20]、およびマルチモーダル画像診断ツール[21,22,23]。

酸化鉄ナノ粒子（IONP）は、臨床的に関連するバイオマーカーを観察するためのさまざまな非侵襲的放射線検査で使用されます[24、25]。 IONPは、ガドリニウムベースの造影剤（GBCA）やニッケルまたはコバルトを含む造影剤などの他の重金属ベースのMRI造影剤よりも高い磁気感度または生体適合性を備えているため、分子イメージングと互換性があります。特に、市販のMRI造影剤とGBCAは、Gd ³⁺ の放出によるinvivo毒性に関連する問題に関連しています。 イオン、IONPベースのMRI造影剤は、鉄に分解、吸収、または除去される可能性があるため、GBCAよりも生体内での安全性が高くなります[26、27]。

分子イメージングにIONPを適用するには、ターゲティング部分が非常に重要であり、化学物質、炭水化物、タンパク質、抗体、またはアプタマーである可能性があります[25、28、29]。これらの分子の中で、アプタマーは、特定の分子に対して高い結合親和性および特異性を有する一本鎖核酸の安定した三次元構造を有する。アプタマーの高い結合親和性は、それらの開発技術と指数関数的濃縮（SELEX）によるリガンドの系統的進化によって引き起こされます[30]。 SELEXは、ランダム配列オリゴヌクレオチドの非常に大きなライブラリを使用しています（〜10 ¹⁵ ）化学合成によって提供され、並行してスクリーニングされて、標的分子に対して高い結合親和力を有するアプタマーを見つけることができる。 SELEXの結果として、アプタマーは一般にピコモル濃度レベルの高い結合親和性で開発できますが、他の生体分子の結合親和性はマイクロモルからサブナノモルの範囲です[31、32]。最近開発された第3世代アプタマーの場合、修飾核酸を使用することでDNaseまたはRNaseに対する耐性が向上するため、invitroおよびinvivoでの安定性もあります[33、34]。これらの理由から、アプタマーは分子イメージング研究で好ましい部分として浮上しています[35]。

この研究の目的は、HER2を過剰発現する癌細胞に高い特異性を持つ磁性ナノ結晶（MNC）に基づくアプタマー修飾T2造影剤の開発でした。この目的を達成するために、磁気感度の高いMNCを、熱分解法とHER2特異的アプタマー（ K ）によって調製しました。 _d =0.42 nM）が使用されました。合成された造影剤は、形態、磁化特性、および磁気緩和能を分析することによって特徴づけられました。また、HER2を発現する癌細胞株を移植した腫瘍異種移植動物モデルで、HER2タンパク質に対するinvitroおよびinvivoターゲティングアッセイをそれぞれ実施しました。

メソッド

資料

TWEEN®80（T80）、4-（ジメチルアミノ）ピリジン、 N 、 N '-ジシクロヘキシルカルボジイミド、トリエチルアミン、ジクロロメタン無水物、鉄（III）アセチルアセトナート、1,2-ヘキサデカンジオール、ドデカン酸、ドデシルアミン、およびベンジルエーテルはSigma-Aldrich（USA）から購入し、3-マレイミドプロピオン酸（MPA）はTCIアメリカ（米国）。 Roswell Park Memorial Institute（RPMI-1640）、ダルベッコの改良イーグル培地、ウシ胎児血清、およびGibco®抗生物質-抗真菌溶液は、Life Technologies（USA）から購入しました。 NIH3T6.7は、American Tissue Type Culture（USA）から購入しました。ジエチルピロカルボナート（DEPC）処理水は、Biosesang Inc.（韓国）から購入しました。チオール化抗HER2アプタマー[Apt _HER2 、配列：5'-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3 '（6：NapdU）、5'-SH修飾、40-mer]はAptamer Science Inc.（韓国）から購入しました。

MNCの合成

単分散磁性酸化鉄ナノ粒子は、Sunの熱分解法を使用して合成されました[36]。これらの磁性ナノ粒子は、鉄（III）アセチルアセトナートとオレイン酸前駆体のためにMNCと呼ばれます。簡単に説明すると、鉄（III）アセチルアセトナート（2 mmol）、オレイン酸（6 mmol）、1-オクタデセン（6 mmol）、1,2-ヘキサデカンジオール（10 mmol）、およびベンジルエーテル（20 mL）の混合物を三口丸底フラスコを機械的に攪拌した。残留酸素分子と水を除去するために、混合物を100°Cに30分間予熱しました。次に、予熱した混合物を200°Cで2時間加熱し、窒素流下で300°Cで30分間還流しました。熱源を除去することにより反応物を室温に冷却した後、反応物を過剰のエチルアルコールで精製した。遠心分離を3回行い、未分散の残留物から生成物を分離しました。 Fe ₃ O ₄ 次に、ナノ粒子生成物を5mLのヘキサンに再分散させました。 100 mg Fe ₃ を使用して上記の手順を繰り返すことにより、最終生成物を合成しました。 O ₄ およびその前駆体。 MNCの形態は、高分解能透過型電子顕微鏡（HR-TEM、JEM-2100、日本電子株式会社、日本）を使用して評価しました。磁化の飽和は、振動試料型磁力計（VSM、MODEL-7300、Lakeshore、USA）を使用して室温で評価しました。熱重量分析装置（SDT-Q600、TA Instrument）を使用して重量を測定することにより、製品中のMNCの量を分析し、Fe ₃ の含有量になるまでMNCを洗浄しました。 O ₄ 約80％に達しました。

マレイミジルの合成-TWEEN ^® 80

マレイミジルT80（Tm80）の調製には、15.3ミリモルのMPAおよび22.9ミリモルの N 、 N '-ジシクロヘキシルカルボジイミドをそれぞれ10mLのジクロロメタンに溶解し、続いて混合しました。次に、混合物を7.6 mmolT80を含む20mLのジクロロメタンに加え、続いて3.2mLのトリエチルアミンを混合物に加えました。最後に、22.9 mmolの4-（ジメチルアミノ）ピリジンを10 mLのジクロロメタンに溶解し、すべての試薬を70mLのバイアルで混合しました。最終混合物を磁石を使用して48時間撹拌しました。混合物の色がアプリコットから赤ワインの色に変わりました。 48時間反応させた後、結晶化した尿素をろ過により除去しました。ジクロロメタンを除去するために、反応物をロータリーエバポレーター（N-1100、EYELA、日本）での蒸発により濾過した。得られた生成物を脱イオン水に懸濁し、非結合試薬を透析によって除去しました（Spectra /Por®、1 kDa MWCO、Spectrum Laboratory Inc.、米国）。最終製品は凍結乾燥により調製された。合成されたTm80は、UV-vis分光計（UV-1800、島津製作所、日本）、フーリエ変換赤外（FT-IR）分光計（PerkinElmer、スペクトル2）、および ^{1 <を使用して、MPAおよびT80と比較することによって確認されました。 / sup> H核磁気共鳴（NMR）分光計（Bruker Biospin、Advance II、追加ファイル1：図S1を参照）。}

マレイミジルMNCの準備

水分散性マレイミジルMNC（mWMNC）は、ナノエマルジョン法を使用して調製しました[37]。簡単に説明すると、100mgのTm80を20mLの脱イオン水に完全に溶解し、20mgのMNCを含む4mLのn-ヘキサンを超音波処理（190 W）および攪拌（1200 rpm）しながらTm80に溶解した水に急速に注入しました。エマルジョンプロセスは、氷冷浴で10分間続けました。残った有機溶媒を室温で12時間蒸発させ、生成物を透析（Spectra /Por®、3.5 kDa MWCO、Spectrum Laboratory Inc.、米国）で精製して、過剰な界面活性剤を3日間除去しました。次に、遠心フィルター（NMWL 3000、Amicon®Ultra、Merk Milipore Ltd.、ドイツ）を使用してmWMNCを1.25 mg _Fe に濃縮しました。 / mLのDEPC処理水。 T80エンベロープMNC（WMNC）も、同じ方法を使用して作成されました。

Apt _HER2 の準備 -MNS

mWMNCと抗HER2アプタマーを結合させる前に、チオール修飾アプタマーの還元ステップを実行しました。簡単に説明すると、1nmolのアプタマーを0.3mLの脱イオン水に溶解し、トリエチルアミンアセテートと1,4-ジチルトレトール溶液を加えて、最終濃度をそれぞれ50mMと25mMにしました。この混合物を室温で1.5時間振とうし、エタノール沈殿によって精製および脱塩しました。 Apt _HER2 を準備するには -MNS、HER2特異的MRIプローブ、MNCの分子量は理論的に計算され（追加ファイル1：図S2を参照）、mWMNCとアプタマーの混合比は1：7と指定されました。したがって、100μg（Fe）のmWMNC（Fe ₃ として） O ₄ 、45 pmol）をPBS（1 mL）に溶解し、5 µg（0.35 nmol）のアプタマーを添加しました。混合物を室温で5分間撹拌し、4℃で2時間インキュベートしました。 Apt _HER2 の流体力学的直径の分布 -次に、動的レーザー散乱アナライザー（ELS-Z、大塚電子、日本）を使用してMNSを分析しました。 Apt _HER2 の能力を確認するには -MRI造影剤としてのMNS、T2緩和能（R2）分析は、Apt _{HER2 <のさまざまな濃縮ファントムを使用して、マイクロ47表面コイル（Intera、Philips Medical System、オランダ）を備えた1.5T臨床MRI装置で実行されました。 / sub> -MNS。 Apt HER2 のR2 -MNSは、Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）シーケンスを使用して、室温で測定されました：TR =10 s、12 msの偶数エコースペースで32エコー、取得数=1、ポイント分解能=156μm×156μm、セクションの厚さ=0.6mm。 R2は、s ^-1 の1 / T2として定義されました。 単位。}

Apt _HER2 -MNS結合親和性アッセイ

Apt _HER2 のHER2特異性の検証用 -MNS、ニトロセルロースフィルター結合法が使用されました[38]。裸のApt _HER2 およびApt _HER2 -MNSは、アルカリホスファターゼ（New England Biolabs、MA、USA）を使用して脱リン酸化されました。アプタマーの5 'または3'末端は、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[ ³² P] -ATP（Amersham Pharmacia Biotech、NJ、USA）[39]。結合アッセイは、 ³² をインキュベートすることによって実施されました。 選択バッファー（20 mM Tris・HCl、4°CでpH 7.5、6 mM NaCl、5 mM 2-メルカプトエタノール、1）中の濃度が100〜10pMのHER2タンパク質を含む10pMの濃度のP標識アプタマーmM Na ₃ EDTA、10％ v / v グリセロール）37°Cで30分間。 ³² の混合物 P標識アプタマーとHER2タンパク質をG-50カラム（GE Heathcare Life Science、UK）でろ過し、遊離放射性同位元素を除去しました。濾過した混合物を再利用可能なフィルム上で現像し、HER2タンパク質に結合したアプタマーの画分をホスホイメージャー（Fuji FLA-5100 Image Analyzer、東京、日本）を使用して定量した。放射性標識アプタマーのニトロセルロースフィルターへの非特異的バックグラウンド結合の影響を排除するために、 ³² を使用して実験を行うことにより、生の結合データを修正しました。 P標識アプタマーのみ。

In Vivo MRI

すべての動物実験は、国際実験動物管理協会の承認の下で実施されました。インビボMRIスキャンは、NIH3T6.7細胞（1.0×10 ⁷ ）の移植によって生成された同系マウス腫瘍モデルを使用して実施されました。 細胞）5週齢の雌BALB / cヌードマウスの大腿部に。 2週間後、腫瘍のサイズをMRIで評価しました。腫瘍のサイズが約500mmに達したとき ³ 、100μg（5 mg / kg）Apt _HER2 -MNSは尾静脈に注射されました。インビボMRI実験は、3.0T臨床MRI装置と8チャンネルの人間の手首コイルを使用して実行されました。 3.0 TでのT2強調MRIの場合、次のパラメータが採用されました：TR / TE =1054/70 ms、取得回数=2、ポイント解像度=400×319mm、スライス厚=1mmTSE係数=8。制御実験は、同じ方法でWMNCを使用して実行されました。すべてのT2信号強度は、各マウスモデル（ n ）のT2強調MRI画像に描画された約5つの関心領域（ROI）を平均することによって計算されました。 =3）、およびT2の逆値であるR2（またはR2 *）値が信号強度分析で使用されました。相対信号強度の経時変化は、初期信号強度（注入前）によって正規化されました。ヒストグラム分析は、ROIにおけるボクセルのR2信号強度についても実施されました。

組織学的分析

プルシアンブルー染色は、腫瘍組織中のFeイオンの検出に使用でき、Apt _HER2 を確認するために実施されました。 -invivoMRI後の各腫瘍モデルからの腫瘍組織の採取後のHER2発現癌のMNSターゲティング。採取した腫瘍組織を10％ホルマリン溶液で24時間固定し、脱水してエタノール濃度を上げ、Histo-Clear®（National Diagnotics、USA）で清澄化した後、パラフィンに包埋しました。プルシアンブルー染色は、組織スライス（厚さ=5μm）をスライドガラスにマウントした後、Histo-Clear®と濃縮エタノールをそれぞれ使用して脱パラフィンと水和を行うことで行いました。その後、スライドをプルシアンブルーの作業溶液（10％フェロシアン化カリウムおよび20％塩酸溶液=1：1）に1時間入れました。 Nuclear Fast Red染色（Sigma Aldrich、USA）を使用して核を染色しました。組織サンプルを30分間3回洗浄した後、スライドにマウンティング溶液を2〜3滴加え、スライドをカバーガラスで覆いました。染色された組織切片は、Olympus BX51およびOlyviaソフトウェア（Olympus、日本）を使用して観察されました。

結果と考察

Apt _HER2 -MNSは、MRIを使用したHER2発現腫瘍の分子イメージング用のIONPに基づく単一分子標的薬として設計されました。したがって、Apt _HER2 -MNSは、ターゲット分子に対して高い特異性と大きな磁化率を持つ必要がありました。最初に高い磁気感度を得るには、MNC、単分散Fe ₃ O ₄ ナノ粒子は、熱分解およびシード成長法を使用して合成されました[36]。 Apt _HER2 の調製とinvivo適用の実験手順 -MNSは図1で説明されています。最初に、MNCのサイズと形状がHR-TEMによって確認されました（図2a、b）。図2cでは、TEM画像から130個のMNCをランダムに選択して、MNCの平均サイズを測定しました。非常に狭いサイズ分布（10.49±1.74 nm）と球形が観察されました。 MNCの超常磁性特性もVSMによって評価され、98.8 emu / g _Fe のMNC飽和磁化値が得られました。 （図2d）。現在静脈注射で利用可能なT2造影剤は、超常磁性酸化鉄（SPIO）または超常磁性酸化鉄（USPIO）に基づいていました[40]。 SPIOまたはUSPIOにも超常磁性がありますが、飽和磁化値は70 emu / g _Fe 未満です。 [40,41,42,43]。超常磁性は、IONPを静脈内造影剤として使用するために必要です。これは、IONPが磁場内にある場合にのみ磁気特性を持ち、IONPが凝集するのを防ぐためです。さらに、MNCの飽和磁化値が高いと、SPIOまたはUSPIOベースの造影剤よりも注入量を減らすのに役立つ可能性があります。

アプタマー修飾磁性ナノ増感剤（Apt _HER2 ）の調製のための実験手順を示す概略図 -MNS）とそのinvivoイメージング能力評価

MNCの形態学的および磁気的特性評価の結果。 a TEM画像。 b 拡大されたTEM画像。 c TEM画像から測定したサイズ分布（総数100）。 d 磁化グラフ

インビボ実験にMNCを使用するために、WMNCおよびmWMNCは、それぞれT80またはTm80を使用するナノエマルジョン法によって調製された。調製したTm80とその前駆体であるMPAおよびT80の物理化学的特性は、吸光度、FT-IR、 ¹ によって確認されました。 H-NMRスペクトル分析（追加ファイル1：図S1を参照）。以前に発表されたように[44]、Tm80を使用したナノエマルジョン法によって調製されたmWMNCは水に安定して分散します。さらに、mWMNCのマレイミジル基は、中性のpHチオール基を持つ分子と容易に結合することができ、この結合は副産物を生成しません。さらに、NapdU修飾アプタマーを使用してin vivo半減期を延長し、その半減期はヒト血清で151時間でした（追加ファイル1：図S3を参照）。 Apt _HER2 -MNSは、mWMNCとApt _HER2 の間の結合によって調製されました。 -SH、およびApt _HER2 の流体力学的特性 -MNSは、動的レーザー散乱とMR緩和度分析を使用して評価されました（図3）。 WMNCとApt _HER2 の直径 -MNSはそれぞれ28.8±7.2および34.1±8.2nmでした（図3a）。 Apt _HER2 40 merのオリゴヌクレオチドで構成され、長さは約5〜10 nmで、Apt _HER2 が存在します。 流体力学的直径の違いを引き起こす可能性があります。 WMNCとApt _HER2 の弛緩性 -MNSは265.7および257.2mM ^-1 _Fe s ^-1 、それぞれ（図3b）、MRI造影剤としての磁気感度を確認するために評価されました。 FDA承認のSPIOまたはUSPIOをベースにしたT2造影剤の場合、ほとんど共沈法で合成されていました。このため、結晶化度が低下し、緩和度が低くなりました（190 mM ^-1 未満）。 _Fe s ^-1 ）磁場下[40]。この研究でMNCを使用することにより、Apt _HER2 -MNSは35〜500％増加しました-SPIOまたはUSPIOベースのT2造影剤よりも磁気緩和能が増加しました。

WMNCとApt _HER2 の特性評価 -invivoMRI造影剤として使用するためのMNS。 a 流体力学的直径（ n =5、WMNC28.8±7.2nm、Apt _HER2 -MNS34.1±8.2nm）。 b 緩和分析グラフ（ n =3、WMNC R ² =265.7 mM ^-1 s ^-1 、 R ² =0.99およびApt _HER2 -MNS R ² =257.2 mM ^-1 s ^-1 、 R ² =0.99）

Apt _HER2 の結合親和性 -HER2タンパク質のMNSは、フィルター結合アッセイ（図4a）を使用して評価され、結果として得られた K _d Apt _HER2 の値 -SHおよびApt _HER2 -MNSは、それぞれ26.88±8.24および0.57±0.26 nMと測定されました（図4b、c）。 Apt _HER2 -OHは、 K のHER2タンパク質に対して非常に高い特異性を持っています _d 値は0.42±0.05nMであり、この結合親和性は5nMのHerceptin®よりも約10倍高くなっています[45]。ただし、裸のApt _HER2 の結合親和性 化学物質、分子、またはナノ粒子との結合によって変化する可能性があります。したがって、Apt _HER2 の結合親和性 HER2タンパク質については、mWMNCとの結合後に評価する必要があります。 Apt _HER2 の結合親和性 -HER2のSHは、裸のApt _HER2 ではなく、チオール基の存在によって減少しました。 なぜなら、チオール基は、タンパク質または他のチオール修飾アプタマーの他のチオール残基と結合できるからです。ただし、Apt _HER2 の結合親和性 -MNSは、Apt _HER2 と同様に測定されました。 、この結果は、バインドされていないApt _HER2 が十分にないことを意味します。 -アプタマーとHER2タンパク質またはmWMNCとの相互作用を妨害する可能性のあるSHは、アプタマーの結合親和性にまったくまたはほとんど影響を与えません。

抗HER2アプタマー（Apt _HER2 ）の結合親和性データ -OH）チオール化抗HER2アプタマー（Apt _HER2 -SH）およびApt _HER2 -フィルター結合アッセイを測定することによるHER2タンパク質へのMNS。 a アプタマーのフィルター結合アッセイのプロセスを示す概略図。 b HER2濃度に対する画分結合アプタマーグラフ。 c K _d Apt _HER2 の値グラフ -OH（0.42±0.05 nM、 R ² =0.99、 p <0.0001）、Apt _HER2 -SH（26.88±8.24 nM、 R ² =0.98、 p <0.0001）、およびApt _HER2 -MNS（0.57±0.26 nM、 R ² =0.91、 p =0.001） b から計算 。エラーバーは正の y で表されました -軸のみ

同系マウス腫瘍モデルを使用してinvivoMRI実験を実施し、Apt _HER2 の能力を評価しました。 -HER2過剰発現腫瘍を標的とするMNS。大腿部へのNIH3T6.7細胞の移植によって生成された腫瘍モデルを使用して、注射前からWMNCまたはApt _HER2 の注射後120分までのMRI実験を実施しました。 -MNS（図5、追加ファイル1：図S4も参照）。 IONPベースの造影剤によるT2コントラスト強調効果は、陽子周辺のT2短縮効果を誘発するため、暗い画像として観察されます。したがって、信号強度分析では、T2またはT2 *値はR2またはR2 *で表されました。 T2の逆の値であるR2は、信号強度を正の値と比較するために使用されます。 WMNCの場合、最も高いR2信号強度は、WMNCの注入の30分後に観察され、その後徐々に減少しました（図5a、b）。 WMNCの注入後120分で、T2信号強度は注入前の状態に似ていました。 R2信号強度の平均値の変化率は10％未満でした。したがって、T2強調MRでは肉眼では認識が困難でした。以前の研究では、T80で包まれた酸化鉄ナノ粒子が標的部分がないにもかかわらず腫瘍組織の周りに蓄積することが実証されました[46]。ただし、その研究では、造影剤の投与量は1.4 mg _Fe T2強調MRIでは、マウス1匹あたりを使用しました。これは、この研究で使用した用量の14倍でした。これは、WMNCが0.1 mg _Fe の用量での実験で効果的なコントラスト増強効果を示すことができなかったことを意味します。 マウスあたり（5 mg _Fe /kg）。 R2 *信号強度の時系列変化も10％未満であり、統計的有意性はありませんでした。対照的に、注射後120分、Apt _HER2 -MNSは、Apt _HER2 の注射前よりも130％高い信号強度の増強を引き起こしました -WMNCと同じ注射量を使用しているにもかかわらずMNS（図5c、d）。この注射量は、アプタマー修飾磁性ナノ粒子ベースの造影剤に関する他の研究の2〜30分の1でした[44、47、48]。この結果は、Apt _HER2 -MNSは、WMNCまたは他のアプタマー修飾造影剤よりも高いターゲティング能力を持っており、Apt _HER2 の高いコントラスト増強効果も示唆しています。 -WMNCよりも線量が低いにもかかわらず、MNSが予想される場合があります。コントラストの増強は、主に末梢血管と腫瘍組織の中心に現れた。 Apt _HER2 の注射後すぐに、末梢血管は暗くなったが -MNS、腫瘍病変の中心のコントラスト強調は60分で最初に現れ、120分まで増加する傾向がありました。

WMNCを使用したHER2 +腫瘍マウスモデルのinvivoMR画像（ n =3）またはApt _HER2 -MNS（ n =3）。 a WMNCの注入前または注入後のT2およびT2 *強調MR画像。 b a から測定された相対信号強度グラフ 。 c Apt _HER2 の注入前または注入後のT2およびT2 *強調MR画像 -MNS。 d 相対信号強度グラフと e c から測定された腫瘍領域の強度ヒストグラム 。 f MRイメージング後に得られた組織学的分析データ。エラーバーは正の y で表されました -軸のみ。 b の相対信号強度 、 d 、および e a の赤い実線のROIから測定されました 、 c 、および追加ファイル1：図S4

Apt _HER2 の注射前後のコントラスト強調効果の目に見える変化を強調するため -MNS、R2信号強度のヒストグラム分析がT2強調MRI画像のROIで実施されました（図5e）。 T2信号はT2強調MRI画像の負の強調として明らかであるため、R2で表されました。 Apt _HER2 の注射後 -MNS、ヒストグラムの中心が右側にシフトされました。ヒストグラムの中心の差を計算すると、コントラスト強調の約10％の増加が観察されました。

Apt _HER2 の存在を確認するには -組織学的に腫瘍のMNS、プルシアンブルー染色を実施しました（図5f）。プルシアンブルーで染色された組織では、核と細胞質が濃いピンク色または薄いピンク色で染色され、腫瘍細胞の周囲にいくつかの青い点が観察されました。 Apt _HER2 の場合、腫瘍組織は青色に染色されていると想定しました。 -MNSは腫瘍を標的にしました。プルシアンブルー染色の結果、腫瘍組織に青い点が観察され、Apt _HER2 の組織スライドが観察されました。 -MNSの青い点の数はWMNCの約3倍でした。プルシアンブルー染色は、組織内のFeイオンを検出できます。したがって、腫瘍組織におけるIONPに基づく造影剤の蓄積を確認するために使用されました[44、49、50]。

結論

結論として、Apt _HER2 -MNSは、HER2発現マウス腫瘍モデルでの物理化学的特性評価およびin vivo MRI実験により、in vivoHER2標的化MRI造影剤として機能します。 Apt _HER2 -MNSは、HER2に対して高い緩和能と特異性を示し、酸化鉄ナノ粒子により、他のT2造影剤よりも投与量が少ないにもかかわらず、顕著なコントラスト増強効果を示しました。この造影剤は、癌患者におけるHER2癌の発現に関する情報を提供することが期待されており、HER2標的薬を使用した化学療法中にHER2 +癌患者を監視するために利用できます。この研究の結果は、HER2過剰発現がんの診断と患者の治療のための有望な戦略を提供することを期待しています。