アスペクト比可変金ナノロッドの種媒介合成と近赤外光音響イメージングへの応用

概要

アスコルビン酸を形状制御剤として用いた改良種媒介法により、アスペクト比可変の金ナノロッドを作製した。アスコルビン酸添加量を調整することで、アスペクト比を8.5–15.6に制御し、縦方向表面プラズモン共鳴（SPR）ピークを近赤外（NIR）ウィンドウ（約680–1100 nm）に広げた。チオール化ポリエチレングリコール（SH-PEG）で表面修飾後、ナノロッドは優れた生体適合性とコロイド安定性を示し、有望なNIR光音響造影剤として位置づけられる。in vitroおよびin vivo試験で、コントロール比3.1倍のコントラスト向上と5.6倍の信号対雑音比（SNR）向上を実証し、光音響イメージング（PAI）における可変吸収の利点を強調した。

背景

一次元ナノ構造（ナノワイヤ、ナノロッド、ナノチューブ、ナノベルト）は、異方的形状によりナノデバイスと生物医学応用に理想的である。金ナノロッド（AuNRs）は、形状依存的SPR、容易な合成、表面修飾の容易さから、PAIと光熱療法の造影剤として特に魅力的。近年の進展で、アスペクト比制御による縦方向SPRの精密チューニングが可能となり、生体組織の光学ウィンドウ（700–950 nm、1000–1350 nm）内での共鳴が実現された。しかし、広いNIR吸収を持つ高アスペクト比AuNRsのスケーラブルな合成は依然課題である。

本研究では、アスコルビン酸濃度を変調することでアスペクト比8.5–15.6のAuNRsを得る簡便な種媒介法を報告する。得られたロッドは680–1100 nmに跨る可変NIR吸収帯を示し、PEG修飾後は無視できる細胞毒性と堅牢なin vivoイメージング性能を示す。

実験

金ナノロッドの合成

改良種媒介プロトコルは既存手順（文献16,17）に従う。簡単には、10.3 mLの0.025 M HAuCl₄と3.644 g CTABを混合、脱イオン水で希釈し2.5×10⁻³ M HAuCl₄と0.1 M CTABとし、フラスコA–Dに分注。氷冷0.01 M NaBH₄種溶液350 µLをフラスコAに加え3分攪拌。フラスコA、B、Cから順次0.4 mLをB、C、Dに移し、各々に0.1 Mアスコルビン酸（AA）25 µLを添加。5秒攪拌後、フラスクCから4 mLと250 µL AAをフラスコDに加え、28℃で12時間放置。得られた沈殿を蒸留水で繰り返し洗浄し余分なCTABを除去、典型的ナノロッド（AuTR）を得た。

4段階シーケンスでのAA量を35、30、20、15 µLと変えることで、アスペクト比8.5、10.5、12.5、15.6をそれぞれ達成した。

AuNRsの表面修飾

SH-PEG（10 mg/1 mL水）を10分超音波処理後、0.1 M NaBH₄ 50 mLで超音波下15分還元しジスルフィド二量体を切断。洗浄済みAuNRsをSH-PEG溶液（10 mL）と混合し5分攪拌、5時間放置。最終生成物を遠心分離と水洗浄で精製。

特性評価手法

形態はSEM（JEOL JSM-7001F）とTEM（JEOL 2100F、200 kV）で観察。UV-VisスペクトルはShimadzu 3100分光光度計で測定。光音響信号は、回転走査PAシステム（Surelite I-20レーザ、Surelite OPO Plus、Olympus PMUT V310-SUトランスデューサ、データ収集ハードウェア）で測定。

細胞生存率実験

全手順は富山大学工学部倫理委員会承認済み。HeLa細胞をAuNRs（0.25–1.0 nM）で24時間培養し、MTTアッセイと光学顕微鏡で生存率評価。

in vitroおよびin vivo PAI

アガーファントム（アガー2 g/100 mL水）を加熱・攪拌・鋳造（直径4.5 cm型）。直径0.9 mmガラス毛細管に新鮮ウシ血液またはAuTR-PEG（1 nM）混合血液を充填し血管模擬。ファントムを680 nmまたは800 nmレーザ（11 mJ cm⁻²）で照射。動物実験では、マウスをイソフルランとクロラールハイドレートで麻酔、除毛、超音波カップリング剤塗布。1 nM AuTR-PEGを静脈注射後、大脳血管を800 nmと680 nmで撮像。24時間後に別波長で再注射・撮像。

結果と考察

高分解能TEMで均一AuTRを確認：直径22 ± 1.5 nm、長さ290 ± 13 nm（アスペクト比≈13.2）。HRTEMで（110）格子縞（1.44 Å）観測、[110]方向成長を示唆。

UV-Visスペクトルに横ピーク（~520 nm）と縦ピーク：アスペクト比8.5–15.6増加に伴い縦ピークが~680 nmから1100 nmへ赤方偏移、生体NIRウィンドウと合致。SH-PEG修飾でピーク強度が微減（~5%）、位置シフトなし。

in vitro PA実験でAuTR濃度に対する線形信号依存性を確認。800 nm励起でAuTRが血液単独比2.3倍のPA信号増加；Au rod 1（アスペクト比8.5）は680 nmで2.1倍増加。マルチ波長PAスペクトルが光学吸収と一致、SPRとPA性能の相関を確認。

MTTアッセイでAuTR-PEGは1 nMで>95%細胞生存率維持、非修飾AuTRは同濃度で71%に低下、PEG化の保護効果を示す。

in vivoイメージングでAuTR-PEG（800 nm）とAu rod 1-PEG（680 nm）が血管コントラストを有意に向上：AuTR-PEG/800 nm群でコントラスト3.1倍、SNR 5.6倍向上。Au rod 1-PEG/680 nm群でコントラスト3.6倍、SNR 5.7倍改善。

25 µL 0.1 M AAで合成した典型的Auナノロッド（AuTR）の形態と構造： a 明視野TEM像. b 単一ロッド拡大TEM像. c パネルb矩形領域「1」のHRTEM像. d AuTRとAuTR-PEGのUV-Vis吸収スペクトル

結論

アスペクト比8.5–15.6、縦方向SPR 680–1100 nmに可変な金ナノロッドを生成するスケーラブルな種媒介合成法を開発した。SH-PEG修飾で優れた生体適合性と安定性を付与し、堅牢なNIR光音響コントラストを実現。in vitroおよびin vivo結果がPAIでの優れたコントラストとSNRを確認し、これらナノロッドを第1 NIRウィンドウ全域でのイメージングに適した多用途剤として検証、脳血管疾患診断への応用可能性を示唆する。

略語

1D

一次元

AA

L-(+)-アスコルビン酸

AuNR

金ナノロッド

AuTR

典型的金ナノロッド

CTAB

セチルトリメチルアンモニウムブロミド

DNA

デオキシリボ核酸

MTT

メチルチアゾリルテトラゾリウム

NIR

近赤外

NRs

ナノロッド

OPO

光学パラメトリック発振器

PA

光音響

PAI

光音響イメージング

SAED

選択領域電子回折

SEM

走査型電子顕微鏡

SH-PEG

チオール-ポリエチレングリコール

SNR

信号対雑音比

SPR

表面プラズモン共鳴

TEM

透過型電子顕微鏡