硫酸を利用した赤色発光炭化ポリマードットの調製とバイオイメージングの応用

背景

カーボンドット（CD）は、優れた水溶性、光学的安定性、独自の蛍光特性、低毒性、低コストなどの利点から注目を集めています[1]。ほとんどのCDは、電気化学免疫センサー[2]、バイオイメージング[3,4,5,6]センサー[7,8,9,10,11,12]、光-などのさまざまなアプリケーションの潜在的な候補として研究されました。触媒作用[13,14,15]、発光デバイス[16]、およびオプトエレクトロニクス[17,18,19]。 CDの合成は、光学特性と用途の研究において重要な役割を果たします。 CDを作成するための報告されたアプローチは、主にさまざまな炭素材料からの「トップダウン」および有機分子、ポリマー、または天然物からの「ボトムアップ」として要約できます[20]。 「ボトムアップ」法は、大規模な蛍光CDを合成するための効率的なルートです[21]。 –OH、–COOH、–C =O、および–NH ₂ を含む適用された分子のグループ 熱水、マイクロ波、燃焼、熱分解などにより、高温で脱水および炭化することができます。

赤色発光ドットは、バイオイメージング分野での侵入深さが大きいため、かなりの関心を呼んでいます。特に、励起波長に依存しない発光材料は単一の安定したフォトルミネッセンス（PL）光を提供できるため、純粋なカラードットは特定の場合に重要です。 CDのほとんどの放射は励起波長に依存し、CDは通常、青、緑、または黄色の光を放射しますが、明るい赤色の光を放射するCDはほとんどありません[22]。

最近、 o などのフェニレンジアミン（PD）の異性体 -、 m -、および p -PDは、CDを調製するための炭素源として研究されていました[8、9、23、24]。青、緑、赤の発光CDは、 m から作成できます。 -、 o -、および p -それぞれPDエタノール溶液[23]。フルカラー発光CDは、 p から作成できます。 -PDおよび尿素水溶液[24]。以前の研究[25]で、新しい赤いカーボンドット（量子収率=15.8％、水中）を「 p 」から簡単に合成できることを提案しました。 -PD + HNO ₃ 」水系であり、水中の金属イオンの検出に適用されます。最近、同様の「 o -PD + H ₃ PO ₄ 」[26]および「 o -PD + HNO ₃ 」[27]システムが報告され、Liu etal。 [27]は、CD（QYs =10.8％、水中）の名前を「炭化ポリマードット（CPD）」に変更しました。従来のカーボンドットとは異なり、CPDの発光波長は励起波長に依存しないため、PDベースの「CD」はCPDとしてより正確に名前を付ける必要があります。

ここでは、赤発光CPDを準備するための強酸支援熱水ルートの簡単で高効率な方法と2光子フォトルミネッセンス特性を備えたバイオイメージングのアプリケーションを報告します。 CPDの形成メカニズムは、Gaussian09プログラムパッケージを使用して提案されています。

メソッド

酸支援 p からの赤色CPDの合成 -PDシステム

以前の研究[25]に基づいて、硫酸（H ₂ SO ₄ ）、塩酸（HCl）、および過塩素酸（HClO ₄ ）赤いCPDの準備のアシスタントとして、対応するCPDはそれぞれSA-CPD、HC-CPD、およびPA-CPDとしてラベル付けされました。 H ₂ の実験条件を最適化するために SO ₄ 支援システムでは、 c などのいくつかのパラメータを選択しました （酸）から c （ p -PD）比率、 c （ p -PD）、温度（ T ）、および反応時間（ t ）。 CPD生成物をヘキサンで洗浄して、未反応の p を除去しました。 -PDとエチルアルコールで酸を除去し、14000 rpmで30分間遠心分離してポリマーの沈殿物を除去し、0.22μmのフィルターメンブレンでろ過しました。粉末が望ましい場合は、精製されたCPD溶液を、ロータリーエバポレーターでさらに蒸発させて、80°Cおよび低真空条件でほぼ乾燥状態にすることができます（残りは粉末状になります）。

特性評価と測定

高分解能TEM（HR-TEM）画像は、200kVで動作するJEM-2100透過型顕微鏡で記録されました。 CPD溶液の赤外線スペクトルは、KRS-5ウィンドウスライス（TlBrとTlIの混合物）を使用してPrestige-21 FT-IR分光計を使用して収集しました。通常、液相を1つのスライスに滴下して乾燥させました。スライスは他のスライスで覆われ、テストスタンドに固定されました。次に、赤外線スペクトルを記録しました。

CPDの蛍光スペクトルはF-2500蛍光分光光度計で測定されました。 UV-Vis吸収スペクトルは、Lambda 950 UV / VIS / NIR分光計で記録されました。 CPDの2光子発光スペクトルは、顕微鏡システムのファイバースペクトログラフ（QE65000、Ocean Optics）によって記録されました。 SA-CPDの水溶液と粉末の再溶解溶液をスライド上で回転させ、2光子フォトルミネッセンス特性を測定しました。

CPDのフォトルミネッセンス量子収率（QY）は、参照色素としてローダミンB（エタノール中のQYs =56％）を使用して、365 nmのUV光で励起された580〜610 nmの発光範囲で測定されました[25、28]。 QYの測定値は、追加ファイル1に表示されました。

計算方法

Gaussian 09パッケージは、密度汎関数理論（DFT）の計算に使用されました[29]。平衡構造は、6–311 ++ G（d）基底関数系[30]と組み合わせたB3LYP法によって最適化されました。溶媒効果の役割を調査するために、分極連続体モデル（PCM）で水を利用しました。周波数分析は、最適化された各構造が停留点に対応していることを確認するために同じレベルで行われました。

細胞培養と処理

ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM; Gibco）中の1.35 mLのHeLa細胞（初期密度4×10 ⁴ ） ミリリットルあたりの細胞を各皿に播種し、5％CO ₂ を含む加湿雰囲気下で37°Cで24時間培養しました。 。 SA-CPD粉末を水に再溶解して、予備溶液（400μgmL ^{− 1} ）を調製しました。 ）。 1350μLの細胞を150μLのSA-CPD予備溶液で培養しました（最終濃度は40μgmL ^{− 1} ）12時間後、PBSで3回洗浄して、遊離のSA-CPDを除去します。最後に、細胞イメージングの結果は、850 nmのフェムト秒レーザー励起（30 mW）下で共焦点顕微鏡を使用して収集されました。

結果と考察

レッドCPDの準備の最適化

基本的な実験では、さまざまな濃度比、反応温度、および時間のさまざまな酸支援システムが調査されました（追加ファイル1：図S1を参照）。さまざまな酸系で180°C以上（2時間反応）で赤色のCPDが形成される可能性があり、反応は溶液中の陰イオンの影響を受けないことがわかりました。長時間（4〜12時間、H ₃ の場合は240°C PO ₄ およびHFシステム。追加ファイル1を参照：図S1f）反応により粒子サイズが大きくなり、最終的に赤色の蛍光が弱まりますが、HClシステム（2〜6時間、200°C、追加を参照）では蛍光の変化は明らかではありません。ファイル1：図S2）。テフロンライナーの省エネと上限温度を考慮して、最適温度と反応時間はそれぞれ200°Cと2時間に選択されています。 p の最適化戦略に基づく -PD + HClシステム（追加ファイル1：図S2を参照）、 p を最適化しました -PD + H ₂ SO ₄ および p -PD + HClO ₄ システムを構築し、表1に示す最適化結果を取得しました。

SA-CPD、HC-CPD、およびPA-CPDは、 p から作成されました。 -H ₂ を利用したPDソリューション SO ₄ 、HCl、およびHClO ₄ 、 それぞれ。最適化された c （酸）から c （ p -PD）H ₂ の比率 SO ₄ -、HCl-、およびHClO ₄ 支援システムはそれぞれ1、3、3です（追加ファイル1：図S3aを参照）。適切な c （ p -PD）赤色CPDの調製範囲は広い（0.02〜0.20 mol L ^{− 1} ）。最適化された温度（ T ）と反応時間（ t ）は200°Cで2時間です。 SA-CPDは、QYが21.4％と高い最も明るい赤色のCPDです（追加ファイル1：図S3b）。 H ₂ には2つの理由があります SO ₄ アシストカーボンドットは、HCl-、HClO ₄ と比較して品質が優れています。 -、およびHNO ₃ -支援されたもの（私たちの前の仕事[25]で公開されました）。まず、H ₂ SO ₄ は、高温高圧の反応液中で酸性度を維持する不揮発性強酸です。次に、H ₂ SO ₄ 支援システムは、前駆体にアンモニウム塩沈殿を形成できる唯一のシステムであり、沈殿物は遊離反応物をゆっくりと放出し、大粒子ポリマー沈殿の形成を回避し、高品質のカーボンドットの形成をさらに促進します。 HA-CPDとPA-CPDは暗赤褐色の濃厚な溶液であり、365 nmのUV光照射下で暗赤色のPLを放出しますが、調製されたままのSA-CPDは明赤の透明な薄い溶液であり、明るい赤色の光を放出します（追加ファイル1：図S3c）。洗浄、濃縮、ろ過、蒸発によって精製した後、SA-CPDの暗赤褐色の粉末（追加ファイル1：図S3d）が16.5％の生成物収率で得られました。粉末は水に再溶解でき、溶液は明るい赤色の蛍光を発します（追加ファイル1：図S3e）。

TEMの特性評価とFT-IR分析

サンプルOpPDのTEM画像（H ₂ なし） SO ₄ ）およびSA-CPD（H ₂ を使用） SO ₄ ）を図1に示しました。サンプルOpPDは、フラグメント（オリゴマー、図1a）とポリマー（図1aインサート）で構成されています。 SA-CPDは、平均サイズが約5 nmの単分散CPDです（図1c）。グラフェンの（100）面内格子間隔に対応する、〜0.21 nmの間隔で十分に分解された格子フィンガーを示します（図1b挿入）。

サンプルOpPDのTEM画像（H ₂ なし） SO ₄ ）（ a ）およびSA-CPD（ b ）。 c SA-CPDのサイズ分布。 d サンプルOpPDおよび赤色CPDのFT-IRスペクトル。サンプルのOpPDおよびSA-CPDは、 p から作成されました。 -H ₂ の有無によるPD水溶液 SO ₄ -支援

CPDの表面状態は、光学特性に影響を与える可能性があります。サンプルOpPDおよびSA-CPDの表面化学基は、FT-IRスペクトルによって特徴づけられました（図1d）。 2つのサンプルには、Ar-H（2700–3200 cm ^{− 1} ）などの類似したグループがいくつかあります。 [33]、芳香族C-H伸縮振動に属します）、C-C（〜1433 cm ^{− 1} は、芳香族C骨伸縮振動に属し、ベンゼノイドユニットに特徴的な芳香族伸縮振動の存在を示します）[34]、C =O（1628 cm ^{− 1} 、–COOHグループに属します）。サンプルのOpPDと比較して、O-H（3300–3700 cm ^{− 1} などの新しいグループ および1175cm ^{− 1} –COOHグループに属する）、C-O-C（1055 cm ^{− 1} 、エステルに存在）、およびC-H（2400–3000 cm ^{− 1} 開環反応で形成されるアルキルラジカルに属します）、CPDに見られますが、–NH ₂ または、N-H（3100–3300 cm ^{− 1} などの–NH–関連グループ および1512cm ^{− 1} およびC-N（1126、1261、および1305 cm ^{− 1} 無料の–NH ₂ に属します または p の–NH–グループ -PD前駆体は、弱くなるか消えます。 –OHまたは–COOH基の存在は、SA-CPDの表面の酸化度（H ₂ を使用）を示します。 SO ₄ 添加）は、サンプルOpPD（酸添加なし）よりも高くなっています。

CDの形成のために提案されたメカニズム

形成エネルギーは、Gaussian09プログラムパッケージを使用して計算されました。酸支援によってプロトン化された後、バイポリマーは、縦方向および横方向の成長と呼ばれる2つの方法で重合することができます。横方向成長の計算された形成エネルギー（− 1406.07 kJ mol ^{− 1} ）は、縦方向の成長よりも大幅に高くなります（− 616.25 kJ mol ^{− 1} ）。これは、完全にプロトン化されたバイポリマー（pH 3、過剰なH ⁺ の後）を示しています。 追加された）は、横方向に重合して平面構造を形成する傾向があります（図2）。次に、これらの平面構造を自己組織化して、球状のCPDを形成しました。

縦方向および横方向の成長の形成エネルギー

光学特性

さまざまな酸の助けを借りて調製されていますが、すべてのCPDは同様の光学特性を持っています[25]。 SA-CPD水溶液のUV-Visスペクトル（図3a）の場合、〜290 nmにある吸光度ピークはベンゼン環の遷移に関連付けられており、430nmと510nmにあるピークはπに割り当てることができます。 -隣接するアミン基の孤立した電子対に共役した置換フェナジンのπ*遷移と、ベンゼン環からキノイド環への電子遷移。励起曲線は、可視領域で広く緩やかな上昇傾向を示しており、最大励起ピーク（〜580 nm）は発光ピーク（〜600 nm）に近いです。 CPDは、220nmから310nmに励起されると赤色光ゾーン（600〜700 nm）で発光し、310nmから580nmに励起されるとオレンジ色の光（〜600 nm）で発光します（図3b）。この種の赤色発光CPDの蛍光は、励起波長に依存しないことに注意してください[22、35]。

a UV-Vis吸収、励起（600 nmでピーク）、および b SA-CPDの発光（励起220〜580 nm）スペクトル

細胞イメージング

粉末化プロセス前後のSA-CPDの2光子フォトルミネッセンス特性を図4aに示します。フェムト秒パルスレーザー（30 mW）による同じ励起波長850 nmで、602 nm（粉末化プロセス前）から529 nm（粉末化プロセス後）への青方偏移があります。 PL強度は粉末化プロセス後に増加しました。

SA-CPDの2光子フォトルミネッセンススペクトル（ a ）および850 nm、30 mWフェムト秒パルスレーザー（ b ）で励起されたSA-CPDで処理されたHeLa細胞の共焦点蛍光顕微鏡画像 – e ）

SA-CPD粉末をPBS（1X）に再溶解し、共焦点蛍光顕微鏡と850 nmフェムト秒パルスレーザー（30 mW）を使用したHeLa細胞イメージングに適用しました（図4b–eを参照）。 HeLa細胞で12時間培養した後、SA-CPDはHeLa細胞に飲み込まれ、CPDは細胞質に入りました。赤チャネル（645〜675 nm）のFL強度は弱く、緑チャネル（526〜574 nm）は明るいため、粉末化プロセスの青方偏移と一致しています。

結論

カーボンドットを調製するための酸支援熱水経路の簡単な方法とバイオイメージングの応用が報告されました。 H ₂ 内 SO ₄ -、HCl-およびHClO ₄ -支援システム、H ₂ から作成されたSA-CPD SO ₄ 支援システムは、平均サイズが約5 nm、QYが21.4％、生成物の収率が16.5％の最も明るいCPDです。 SA-CPDs水溶液は、300〜580nmの光で励起されると600nmで発光します。発光波長は励起波長に依存しません。さらに、SA-CPDには、850 nmのフェムト秒パルスレーザー（30 mW）で励起されたときに602nmで発光する2光子フォトルミネッセンス特性があります。この方法は、HeLa細胞のイメージングにも利用されており、バイオイメージングアプリケーションなどでの可能性があります。

略語

CD：

カーボンドット

CPD：

炭化ポリマードット

HC-CPD：

カーボンドットは p から作成されました -HCl支援システムによるPD

PA-CPD：

カーボンドットは p から作成されました -HClO ₄ を使用したPD -支援システム

p -PD：

P -フェニレンジアミン

QY：

量子収率

SA-CPD：

カーボンドットは p から作成されました -H ₂ を使用したPD SO ₄ -支援システム