スマートフォンベースのリーダーを使用した疾患バイオマーカーの高感度検出のためのプラズモニックELISA

はじめに

急性心筋梗塞（AMI）は、心筋に流れる血液が突然遮断されて組織が損傷するときに発生する心臓発作の医学名です[1]。 AMIの症状には、重度で持続的な胸骨後の痛み、不整脈、ショック、心不全などがあり、これらは致命的となる可能性があります[2]。 AMIは、ヨーロッパとアメリカで最も一般的な病気の1つです。米国だけでも毎年約150万人が心筋梗塞に苦しんでいます。 AMIの明らかな増加傾向は、近年中国でも観察されており、年間少なくとも50万人の新規患者がいます。バイオマーカーのポイントオブケア検査は、AMIの早期モニタリングと治療にとって非常に重要です。血清ミオグロビン（Myo）は、AMI後1〜2時間で増加し、6〜9時間でピーク値に達します。 Myoは、AMIの早期診断のための最も初期の血清マーカーの1つであると考えられています[3,4,5]。

最近、プラズモン免疫測定法は、従来の酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）とナノ材料を組み合わせることによって開発されました[6、7]。プラズモンイムノアッセイは、臨床診断[8]、環境汚染モニタリング[9]、および食品安全性検出[10]で広く使用されています。他のイムノアッセイと比較して、プラズモンイムノアッセイは高感度であり、洗練された機器を使用せずに肉眼での読み取りが可能です。金や銀のナノ材料などの金属ナノ粒子は、その優れた局在表面プラズモン共鳴（LSPR）により、プラズモンナノセンサーで一般的に使用されています。プラズモンイムノアッセイでは、酵素標識抗体がその基質を触媒して、ナノ材料の凝集または形状変化を引き起こす生成物を生成します。 Chenのグループ[11]は、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）触媒による加水分解反応を使用して、金ナノ粒子（AuNP）の凝集を誘発する病原体検出のためのプラズモニックイムノアッセイを報告しました。プラズモンイムノアッセイの感度はRT-PCRに匹敵します。ただし、比色分析での堅牢で超高速で非常に安定したAuNPの凝集は、AuNPの凝集手順が動的であるため、依然として課題となっています[12、13]。別の種類のプラズモンイムノアッセイは、プラズモンナノ粒子の形状変化を誘発することに基づいています。三角銀ナノプリズム（AgNPR）エッチングベースのプラズモンバイオセンサーが、過酸化水素（H ₂ ）を使用する癌バイオマーカーの検出について報告されました。 O ₂ ）AgNPRエッチング用のグルコースオキシダーゼ（GOx）によって生成されます[14、15]。ただし、分子標的を定量的にテストするには、プラズモンイムノアッセイとともに、ナノマテリアルのスペクトルを測定するための比較的洗練されたかさばる機器が必要です。これらの機器に関連する不便さにより、ポイントオブケア分析には適用できません。したがって、ポイントオブケア検査（POCT）診断のために、ポータブルで安価で使いやすいプラズモンイムノアッセイリーダーを開発することが急務です。

金ナノロッド（AuNR）は、その独特の物理的、光学的、電子的特性により、バイオセンサー[16、17、18]、プラズモンイメージング[19]、腫瘍光熱療法[20]、光線力学療法[21]に広く採用されています[22 、23、24]。この作業では、Myoの検出のためのAuNRの酵素を介したLSPRの変化に基づく高感度プラズモンイムノアッセイを報告しました。 AMIのPOCT診断を容易にするために、スマートフォンの環境光センサー（ALS）を使用した新しいプラズモンイムノアッセイリーダーを開発しました。プラズモニックイムノアッセイから得られた結果と血清検体の従来のELISAから得られた結果との高い相関関係は、特に技術リソースが限られている地域で、AMIの早期POCT診断のためのこの新しい方法の応用可能性を示しました。

材料と方法

材料と試薬

Myo（人間の心臓組織から）はAbcam（Cambridge、UK）から購入しました。抗myoモノクローナル抗体（mAb1およびmAb2）は、私たちのラボで作成されました（追加ファイル1）。硝酸銀（AgNO ₃ 、99.8％）および水素化ホウ素ナトリウム（NaBH ₄ ）Sinoreagent（上海、中国）から購入しました。過酸化水素（H ₂ O ₂ 、30 wt％）およびH ₂ SO ₄ GZ化学試薬工場（広州、中国）から購入しました。発光ダイオード（LED、850 nm）は、Shenzhen OCtai Co.、Ltd。（Shenzhen、China）から購入しました。クロロ金酸（HAuCl ₄ ）、TMB（3,3 '、5,5'-tet-ラメチルベンジジン）、Tween-20、およびセチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）は、Amresco（ヒューストン、テキサス州、米国）から購入しました。 Aspergillus niger のグルコースオキシダーゼタイプVII （GOx）、西洋ワサビペルオキシダーゼタイプVI（HRP）、およびウシ血清アルブミン（BSA）は、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。この研究では、抵抗率が18.2MΩcmの脱イオン水（Milli-Qグレード、Millipore）を使用しました。血清サンプルは広州海外中国病院（広州、中国）から収集されました。

装置

96ウェルプレートのAuNRのLSPRスペクトルは、Synergy H1ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments、Inc。USA）によって収集されました。 HRPベースのELISAの吸光度は、MK3マイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments、Inc。USA）を使用して450nmで測定しました。 AuNRの特性評価は、120kVの加速電圧で動作するPHILIPSTECNAI-10透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して実行されました。 ＴＥＭ測定用のサンプルは、炭素の薄膜でコーティングされた銅グリッド上に水性分散液を１滴堆積させることによって調製され、溶媒は空気中での蒸発によって除去された。 3Dプリンターは、SHINING 3D（杭州、中国）から購入しました。プラズモンイムノアッセイリーダーの基本的なスマートフォンとして、HUAWEI P9スマートフォン（中国、深セン）が選ばれました。

スマートフォンベースのプラズモニックイムノアッセイリーダーの設計

スマートフォンベースのプラズモニックイムノアッセイリーダーの設計は、ソフトウェア（Solidworks 2014）を使用して作成され、ソフトウェア3Dstarによって処理されました。印刷設定では、印刷モードを高品質に設定し、サポート方法を内部および外部サポートに構成しました。無料のスマートフォンアプリケーションである露出計を使用して、測定結果を画面に表示しました。この作業では、プラズモニックイムノアッセイリーダーがAndroid（オープンソース）電話で実行されています。このリーダーは、ユーザーがiOSバージョンのソフトウェア（露出計）を適用した場合、iPhoneでも使用できます。

AuNRの合成

AuNRはシードゴールドを介した成長によって調製されました[25]。金シードの準備：0.01M水酸化ナトリウム中の新鮮な0.01M水素化ホウ素ナトリウムを準備しました。次に、600μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液をHAuCl ₄ に加えました。 攪拌中（300 rpm min ^-1 ）の10 mL 0.1 M CTAB中の溶液（0.25 mM） ）。金の種の色が緑がかった色から薄茶色に変わりました。ナノロッドの合成：AgNO ₃ （70 µL、0.1 M）溶液を10 mL HAuCl ₄ に加えました 0.1 M CTAB中の溶液（0.5 mM）。続いて、140μLのアスコルビン酸（0.0788 M）を攪拌しながら添加しました（300 rpm min ^-1 ）。最後に、12μLの金の種を加え、溶液を攪拌しながら混合しました（300 rpm min ^-1 ）使用前に12時間。

Myo検出のためのAuNRベースのプラズモンイムノアッセイの手順

プラズモンイムノアッセイでは、抗Myo抗体1（Ab1）を含む96ウェルポリスチレンプレートを調製するために、希釈したAb1を96ウェルポリスチレンプレートで4℃で一晩インキュベートしました。 PBSTで3回洗浄した後、96ウェルポリスチレンプレートをブロッキングバッファー（1 mg mL ^-1 ）でブロックしました。 PBST中のBSA）、37°C​​で1時間。次に、96ウェルポリスチレンプレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、-20°Cで保存しました。 GOxで標識されたAnti-Myo抗体2（GOx-Ab2）は、追加ファイル1に示されている手順に従って調製しました。

Myoを検出するために、さまざまな濃度のMyo溶液（100μL）をAb1でコーティングした96ウェルポリスチレンプレートに添加しました。 1時間のインキュベーション後、プレートをPBSTバッファーで3回洗浄し、次に0.01 mg mL ^-1 GOx-Ab2を添加し、37°C​​でさらに1時間インキュベートしました。次に、プレートをPBSTバッファーで3回洗浄し、50μLのグルコース（0.5 mM）を加え、37°C​​で30分間インキュベートしました。続いて、上清をAuNR（[Au0] 0.24 mM）、CTAB（12.5 mM）、およびHRP（3μM）を含む50μLのクエン酸バッファー（40 mM、pH 4.0）と混合し、30分間インキュベートしました。 AuNRの対応するLSPRスペクトルは、市販のマイクロプレートリーダーによって収集され、AuNRの透過光強度（850 nm）は、スマートフォンベースのプラズモニックイムノアッセイリーダーによって測定されました。 Myoのプラズモンイムノアッセイの検量線は、測定された透過光強度を関連するMyo濃度にフィッティングすることによって作成されました。 Myoを検出するために、血清サンプルをPBSバッファーを使用して10倍に希釈しました。次に、100μLの希釈血清サンプルをAb1でコーティングした96ウェルポリスチレンプレートに添加しました。 Myoの濃度は上記のようにテストされました。各値は、3回の繰り返しの平均を表します。

HRPベースのELISAの手順は、追加ファイル1に示されています。

データ分析方法

線形回帰分析は、origin9.0で処理されました。すべての実験は独立して3回繰り返された。各値は、3回の繰り返しの平均を表します。

結果と考察

Myo検出のためのAuNRベースのイムノアッセイの原理

プラズモンイムノアッセイは、サンドイッチイムノアッセイとAuNRのプラズモン特性を組み合わせたものです。 Ab1とAb2はグルコースオキシダーゼ（GOx-Ab2）と結合していました（図1）。結合すると、GOx標識Ab2はその基質グルコースを触媒して、グルコン酸と過酸化水素（H ₂ O ₂ ）。 H ₂ O ₂ 特定の濃度のHRPおよびBr ^- の下でAuNRをエッチングする酸化剤として機能します 、これにより、AuNRのSPRスペクトルが大幅に青方偏移し、850nmでのAuNRの吸光度が低下します。プラズモンイムノアッセイでは、GOxの量はターゲット濃度に比例します。 AuNRのSPRスペクトルの青方偏移の程度と850nmでのAuNRの吸光度の減少は、ターゲット濃度と正の相関がありました。プラズモニックイムノアッセイの結果は、マイクロプレートリーダーを使用してAuNRのSPRスペクトルの青方偏移を測定するか、スマートフォンのリーダーを使用して850nmでのAuNRの吸光度の変化を測定することで認定できます。

Myo検出のためのAuNRベースのプラズモンイムノアッセイの概略図

ミオ検出のためのプラズモニックイムノアッセイの最適化

HRPとCTABの濃度は、検出された結果に直接影響します。この作業では、100μMのH ₂ を含む溶液によってAuNRをエッチングしました。 O ₂ 、およびクエン酸緩衝液（40 mM、pH 4.0）中のさまざまな濃度のHRPおよびCTABから、AuNRのLSPRシフトが記録されました。この研究では、これらの濃度で観察されたAuNRの最大LSPRシフトのために、1.5μMのHRPと6.25μMのCTABが選択されました（図2a）。最適化されたHRPおよびCTAB濃度で、AuNPは100μMH ₂ でエッチングされました。 O ₂ クエン酸緩衝液（20 mM、pH 4.0）中。 AuNRのLSPRスペクトルは赤方偏移し、850 nmでのAuNRの吸光度は時間とともに減少しました（図2b）。 30分後、AuNRのLSPRは安定します。したがって、H ₂ の時間として30分が選択されました。 O ₂ AuNRのエッチング。 AuNPは、さまざまな濃度のH ₂ によってエッチングされました。 O ₂ 。 AuNRのLSPRスペクトルは、H ₂ の減少に伴って青方偏移しました。 O ₂ 濃度（図2c）。 AuNRのTEM画像は、H ₂ の増加に伴って O ₂ 濃度が高くなると、AuNRの形状が長方形から楕円形に変化しました（図2d–f）。これらの結果は、AuNRのLSPRスペクトルがH ₂ の濃度に依存していることを示しています。 O _2。

Myo検出のためのプラズモンイムノアッセイに基づくAuNRの最適化と特性評価。 a プラズモンイムノアッセイに基づくAuNRのHRPおよびCTAB濃度の最適化。異なる色の線は異なる濃度のCTABを表しており、その中で6.25 mMCTABと1.5μMHRPが好まれました。 b H ₂ の時間の最適化 O ₂ 1.5μMHRP、6.25 mM CTAB、100μMH ₂ のAuNRのエッチング O ₂ クエン酸緩衝液（20 mM、pH 4.0）に30分間含まれていることが望ましい。 c さまざまな濃度のH ₂ を50μL添加したAuNRのLSPRスペクトル O ₂ 。 d – f さまざまな濃度のH ₂ によってエッチングされたAuNRのTEM画像 O ₂ （0μM、10μM、および100μM）30分間。 g 異なる濃度のGOx下でのAuNRのLSPRシフト。 h 異なる希釈率でのGOx-Ab2の存在下でのAuNRのLSPRスペクトル。 i 異なる濃度のMyoでコーティングされた直接プラズモンイムノアッセイにおけるAuNRのLSPRスペクトルシフト。各値は、3回の繰り返しの平均を表します

GOxはグルコースを触媒してH ₂ を生成する可能性があります O ₂ 、AuNRをエッチングする可能性があります。この作業では、0.5 mMのグルコースがさまざまな濃度のGOxによって触媒され、生成されたH ₂ O ₂ AuNRのエッチングに使用されました（図2g）。 GOxの濃度が100pg mL ^-1 の場合 （6.66×10 ⁻¹¹ mol L ^-1 ）、AuNRのLSPRスペクトルは明らかな青方偏移を示し、AuNRベースのプラズモンイムノアッセイの高感度を示唆しています。 GOxをAb2と結合させた後、さまざまな濃度に希釈しました。 GOx-Ab2の触媒活性は、分解されたGOxとエッチングされたAuNRによって検証されました。 AuNRのLSPRスペクトルは、GOx-Ab2濃度の増加に伴って赤方偏移しました（図2h）。これは、GOx-Ab2が良好な触媒活性を維持していることを示しています。さらに、Myoをマイクロプレートにコーティングし、GOx-Ab2とインキュベートしました。 30分後、GOx-Ab2をPBSTバッファーで3回洗浄しました。次に、グルコースをマイクロウェルに添加し、30分後にグルコース溶液にAuNRを添加しました。 AuNRのLSPRスペクトルの青方偏移は、GOx-Ab2濃度の増加とともに増加し（図2i）、Ab2がその免疫学的活性を維持し、GOxがその触媒活性を維持することを示しています。

オンサイトMyo検出用のスマートフォンベースのプラズモニックイムノアッセイリーダー

一般的に報告されているプラ​​ズモンイムノアッセイは、市販のマイクロプレートリーダーまたは分光計によって定量的に解釈され、リソースが限られた地域での有用性が制限されます。プラズモニックイムノアッセイのアクセシビリティを向上させるために、スマートフォンの周囲光センサー（ALS）に依存してAuNRの透過光強度を測定するスマートフォンベースのプラズモニックイムノアッセイリーダーを用意しました。ほとんどのスマートフォンでは、ALSは、さまざまな状況に応じて画面の光の強度を自動的に調整するために使用されるデフォルトの構成です。以前、比色分析リーダーでALSを使用したことを報告しました[26、27、28]。プラズモンイムノアッセイリーダーの原理と説明は、以前の出版物に記載されています[29]。 3D印刷されたプラズモニックイムノアッセイリーダーは2つの部分で構成されています。パート1（100mm×40mm×40mm）をスマートフォンに固定して、2つのバッテリー（1.5 V）から電力を供給される安定した光源を供給することができます。パート2（ 76mm×13mm×12mm）を使用してマイクロウェルをホストできます。プラズモンイムノアッセイが完了したら、図3aに示すように、マイクロウェルをパート2に組み立て、次にパート2をパート1に固定しました。次にパート1をスマートフォンのALSに取り付けました。このデザインでは、LEDはスマートフォンのALSと位置合わせされていました。スイッチがオンになると、LEDからの光がAuNRを介して送信され、ALSによって測定されました。各マイクロウェルの透過光強度は、パート2をスライドさせることで読み取ることができます。Androidアプリケーションの露出計を使用して、測定結果をスマートフォンの画面に表示できます。プラズモンイムノアッセイでは、AuNRの最大吸収スペクトルは850 nmであり、H ₂ の増加に伴い O ₂ 濃度が高くなると、850nmでのAuNRの吸光度が徐々に低下しました。そのため、プラズモンイムノアッセイリーダーのLEDの励起光の波長として850nmを選択しました。スマートフォンベースのプラズモンイムノアッセイリーダーの総費用は約2ドルでした。スマートフォンベースのプラズモンイムノアッセイリーダーの測定結果と市販のマイクロプレートリーダーの測定結果を比較するために、マイクロウェル内のAuNRの透過光強度と吸光度を測定しました。これらのデバイスから得られた結果は適合され、99.1％の相関関係を示し（図3b）、スマートフォンベースのプラズモンイムノアッセイリーダーが精度の点で同等のツールであることを示しています。

スマートフォンベースのプラズモンイムノアッセイリーダーのメカニズム。 a スマートフォンベースのプラズモンイムノアッセイリーダーの3Dプリントアクセサリの概略図。 AuNRの透過光強度をスマートフォンのALSで測定し、その値を画面に表示しました。 b スマートフォンベースのプラズモンイムノアッセイリーダーからの結果と市販のマイクロプレートリーダーからの結果との相関関係。各値は、3回の繰り返しの平均を表します

Myo検出のためのプラズモンイムノアッセイの分析性能

AuNRベースのプラズモンイムノアッセイのパフォーマンスのために、異なる濃度のMyoを分析しました。 AuNRのLSPRスペクトルは市販の分光計で記録され、AuNRのLSPRスペクトルの透過光強度はスマートフォンベースのプラズモンイムノアッセイリーダーで測定されました。 Myo濃度の増加に伴い、AuNRのLSPRスペクトルは赤方偏移し、AuNRのLSPRスペクトルの吸光度は減少しました（図4a）。 AuNRのLSPR青方偏移は、Myo濃度の定量分析に使用されました。 Myo濃度が0pg mL ^-1 の場合 、AuNRのLSPR青方偏移は0nmでした。 Myo濃度の増加に伴い、AuNRのLSPRピークは青方偏移しました（追加ファイル1：図S1）。測定された透過光強度は、Myoの濃度を定量化するために使用されました。 LSPRスペクトルの青方偏移によって定量化されたプラズモンイムノアッセイに基づくAuNRの線形検出範囲は、0.1〜1000 ng mL ^-1 でした。 （追加ファイル1：図S2-S3）検出限界は57.81 pg mL ^-1 。測定されたAuNRの透過光強度は、Myo濃度の増加とともに減少しました（図4b）。測定された透過光強度は、Myoの濃度を定量化するために使用されました。 AuNRの透過光強度によって定量化されたプラズモンイムノアッセイの線形検出範囲は0.1〜1000 ng mL ^-1 でした。 （図4c）検出限界は64.13 pg mL ^-1 。 AMIは、Myoの血清濃度が90 ng mL ^-1 を超えると定義されました。 。臨床サンプル中のMyoを検出するために、測定結果の一貫性を向上させるために、分析前に血清を10倍に希釈しました。

Myo検出のためのプラズモンイムノアッセイ。 a Myoのさまざまな濃度でのAuNRのLSPRピークシフト。 b さまざまな濃度のMyoを検出するためのAuNRの吸光度。 c スマートフォンベースのリーダーによって読み取られるMyo検出のためのプラズモンイムノアッセイの検量線。各値は、3回の繰り返しの平均を表します

プラズモンイムノアッセイとELISAの比較

ELISAは、臨床診断で最も広く使用されている手法の1つです。この作業では、ELISAの検出性能とMyo分析のためのプラズモンイムノアッセイを比較しました。同じ抗体と抗原が両方の方法で使用されました。 ELISAの線形検出範囲は25〜1000 ng mL ^-1 でした。 LODは22.7ng mL ^-1 でした （図5a、追加ファイル1：図S4）。 ELISAと比較して、プラズモンイムノアッセイはより感度が高く、より広い検出範囲を示しました。さらに、臨床応用のためのプラズモンイムノアッセイの使用の実現可能性を実証するために、臨床血清サンプル中のMyoをプラズモンイムノアッセイおよびELISAによって測定した。プラズモンイムノアッセイの結果は、それぞれ市販のマイクロプレートリーダーとスマートフォンベースのプラズモンイムノアッセイリーダーによって読み取られました。これら2つの方法の結果はよく相関しており（図5b）、AuNRベースのプラズモンイムノアッセイが臨床AMI診断に使用できることを示しています。

Myo検出のためのプラズモンイムノアッセイと従来のELISAの比較。 a Myo検出用ELISAの検量線。 b 血清サンプルの試験におけるプラズモンイムノアッセイと従来のELISAの比較。横軸はELISAの結果を表し、縦軸はプラズモンイムノアッセイの結果を表します。各値は、3回の繰り返しの平均を表します

結論

AuNRの独自の光学特性を利用することにより、臨床サンプル中の急性心筋梗塞を検出するためのプラズモンイムノアッセイの開発に成功しました。オンサイトテストでのイムノアッセイの有用性を向上させるために、スマートフォンのALSに依存してAuNRの透過光強度を測定するスマートフォンベースのプラズモニックイムノアッセイリーダーを用意しました。スマートフォンリーダーによって読み取られたAuNRベースのプラズモンイムノアッセイの検出限界は0.057ng mL ^-1 でした。 。このバイオセンサーは、従来のELISAよりも感度が高く、生物医学的応用のための有望なプラットフォームとなっています。さらに、スマートフォンベースのプラズモンイムノアッセイリーダーを使用することにより、バイオセンサーは高度な実験装置を必要とせず、限られたリソースのある地域でよりアクセスしやすくなります。

略語

Ab1：

抗Myo抗体

Ab2：

抗Myo抗体2

AgNPR：

三角形の銀ナノプリズム

ALS：

周囲光センサー

AMI：

急性心筋梗塞

AuNPs：

金ナノ粒子

AuNR：

金ナノロッド

ELISA：

酵素免疫測定法

GOx：

グルコースオキシダーゼ

H ₂ O ₂ ：

過酸化水素

HRP：

西洋ワサビペルオキシダーゼ

LSPR：

局在表面プラズモン共鳴

Myo：

血清ミオグロビン

POCT：

ポイントオブケア検査