コバルトリン化物ナノ粒子：感度の高い酵素非依存性過酸化水素検出のための堅牢な電気触媒

概要

本研究では、有害なリン源を用いない簡便で穏和な水熱法によりコバルトリン化物ナノ粒子（Co₂P NPs）を合成した。Co₂Pの形態構造と表面組成を透過型電子顕微鏡（TEM）、X線回折（XRD）、X線光電子分光（XPS）で評価した。遷移金属リン化物の優れた電気触媒還元活性と良好な電気伝導性に着目し、インジウム錫酸化物（ITO）基板上にCo₂P NPsを担持した電極（Co₂P/ITO）を作製し、過酸化水素（H₂O₂）検出に適用した。Co₂P/ITO変換器は5秒未満の迅速なアンペロメトリック応答、0.001～10.0 mMの広い応答範囲、0.65 μMの低検出限界を示した。さらに、酵素非依存性Co₂P/ITOセンサは優れた選択性、再現性、繰り返し精度、安定性を示し、H₂O₂センシングに極めて信頼性が高く有望なバイオセンサとして適格であることを示した。

導入

過酸化水素（H₂O₂）は生体内の代表的な反応性酸素種であり、正常な生理機能において重要な役割を果たす[1]。生細胞内のH₂O₂濃度は細胞生理バランスと密接に関連している[2]。また、H₂O₂の異常濃度が癌、アルツハイマー病、パーキンソン病などの重篤な疾患を引き起こすことも報告されている[3-5]。正常な酸化ストレスバイオマーカーであるH₂O₂濃度を正確、感度良く、迅速、選択的に検出する方法の開発は、早期診断に不可欠である。これまでに分光法[6]、比色法[7]、蛍光法[8,9]、電気化学的手法[10-12]など多くの分析法がH₂O₂測定に適用されてきた。特にアンペロメトリック測定を含む電気化学的手法は、高感度、優れた選択性、低コストなどの利点から、多様なセンシング手法の中でH₂O₂生物分析の最もシンプルで効果的な検出法の一つになりつつある。

酵素電気化学センサはH₂O₂検出に有効であることが証明されている。しかし、酵素固定化の複雑さ、環境不安定性、低再現性により、酵素ベースセンサの大規模実用応用は制限されている。したがって、非酵素電気化学H₂O₂センサの開発が強く求められている。

近年、貴金属[13-15]、非貴金属およびそれらの化合物[16-19]、炭素材料[20,21]ベースのセンサが電気化学的H₂O₂検出に用いられてきた。非酵素バイオセンサ用電気化学活性材料として、遷移金属化合物への関心が高まっている。遷移金属リン化物（TMPs）は優れた電気触媒活性、良好な電気伝導性、多数の優れた特性を持つ新規材料群であり、水分解[22,23]、水素化脱硫[24]、スーパーキャパシタ電極[25]などへの応用が広く研究されている。最近の研究では、CoP、Ni₂P、Cu₃P[26-28]も非酵素H₂O₂検出用効率的電気触媒として機能することが示されている。しかし、TMPsのバイオ分析応用に関する研究は依然として限られている。また、トリフェニルホスフィン[29,30]、黄リン[31,32]、その他環境有害なリン源[33]の使用は、TMPs調製時の操作リスクを高める。したがって、TMPs調製におけるグリーン手法の開発研究がこの分野で補完される価値がある。

本研究では、酢酸コバルトと赤リンを原料とする一段階水熱法によりCo₂P NPsを合成した。さらに、滴下法によりCo₂P NPsをITO基板上に担持し、H₂O₂検出に適用した。Co₂PはH₂O₂還元に対する優れた電気触媒活性を示し、さらに好ましい選択性、優れた再現性、良好な安定性を示したため、H₂O₂検出用感度プラットフォームとしての潜在的応用を示唆している。

実験

試薬と材料

全試薬は分析級を精製せずに使用した。酢酸コバルト(II)四水和物（Co(Ac)₂·4H₂O）、塩化コバルト(II)六水和物（CoCl₂·6H₂O）、D-(+)-グルコース、L-グリシン（L-Gly）、アスコルビン酸（AA）、尿酸（UA）、尿素、NaCl、KCl、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、過酸化水素（30% H₂O₂）、エタノール、アセトンを神経化学試薬（中国）から購入。D-(-)-フルクトース、L-アルギニン（L-Arg）、L-リシン（L-Lys）、ドパミン（DA）、アセトアミノフェン（APAP）、アミノトリメチレンホスホン酸（ATMP、50 wt%）をアラジン（中国）から購入。市販赤リン（98.5%、100メッシュ）をエナジーケミカルテクノロジー（上海）から購入。ナフィオンPFSAポリマー分散液（5%）を北京ホンハイテクノロジーから購入。全実験で脱イオン水を使用。ITOガラス（10×20×1.1 mm、ITO膜厚185±2 nm、シート抵抗6.6±0.1 Ω）を深センサウスシャンチェンテクノロジーから供給。

Co₂Pナノ粒子の合成

市販赤リン（2 g）を15 mL水中で超音波分散し、50 mLテフロンライニングステンレスオートクレーブで200℃、12時間水熱処理して酸化層を除去[34]。その後、真空オーブンで乾燥。赤リン前処理後、Co(Ac)₂·4H₂O（1 mmol）を30 mL蒸留水に溶解し、水溶液を調製。前処理済み赤リンを超音波下で15分間添加（Co/Pモル比1/10）。懸濁液を50 mLテフロンライニングオートクレーブに急速移し、電子オーブンで160、200、240℃、各12時間水熱処理。生成物を遠心分離回収し、蒸留水とエタノールで各3回洗浄。最終的に60℃で3時間空気中乾燥し、Co₂P NPsを得た。

Co(PO₃)₂の合成

先行報告[35]を参照してCo(PO₃)₂を調製。0.1 M CoCl₂·6H₂Oメタノール溶液を調製し、ATMP（50 wt%）2 mLを20 mLの紫色溶液に滴下添加し30分攪拌。不溶性コバルトメタリン酸配位ポリマーが生成。得られたピンク粉末をAr流下で900℃まで昇温（昇温速度5℃/分）し2時間保持。室温冷却後、黒色生成物を回収し、さらに650℃で4時間空気中加熱して有機配位子を炭化除去。最終的に淡紫色のCo(PO₃)₂粉末を得た。

Co₂P/ITO電極の作製

ITOガラス（1 cm×2 cm）をアセトン、エタノール、脱イオン水で各10分超音波洗浄。窒素吹き付けで乾燥。電極修飾のため、Co₂P NPs 5 mgを1 mL脱イオン水に分散し5 mg/mL懸濁液を調製。5%ナフィオン溶液5 μLを添加し15分超音波処理して均一なインク状懸濁液を得た。Co₂P/ITO電極は、Co₂P懸濁液100 μLをITO表面に滴下し空気中乾燥させ作業電極とした。Co₂P/ITO電極の模式的調製プロセスをScheme 1に示す。

キャラクタリゼーション

XRDデータはCu Kα線を用いたD8 ADVANCE回折計で解析。TEM測定はエネルギー分散型スペクトル検出器付きTecnai G2 F20で実施。XPSスペクトルはThermo ESCALAB 250XI分光計で測定。

電気化学測定

ボルタンメトリー測定はCHI 660E電気化学ワークステーションで三電極系により実施。Co₂P/ITO電極を作業電極、白金箔（1 cm×1 cm）を対極、3 M KCl水溶液のAg/AgClを参照電極として、合成サンプルのH₂O₂検出電気化学活性を調べた。電解質にはリン酸緩衝生理食塩水（PBS；0.1 M、pH 7.4）を用い、人体内生理環境を模擬。Co₂P/ITO電極のH₂O₂検出センシング性能をサイクリックボルタンメトリー（CV）とアンペロメトリー（I-t）で評価。全検出実験は室温で100 rpm攪拌下で実施。電気化学インピーダンス試験はVersaSTAT 3Fワークステーションで実施し、フェリシアン化物溶液を電解質としてインピーダンス測定に用いた。

結果と考察

Co₂P NPsのキャラクタリゼーション

Co₂P NPsの結晶構造をXRDで確認。図1aに、160、200、240℃で12時間合成したCo₂PサンプルのXRDパターンを示す。200℃調製サンプルは、40.7°、40.9°、52.0°、56.2°付近に回折ピークを示し、これらはCo₂Pの斜方晶相（JCPDS No. 32-0306）の(121)、(201)、(002)、(320)面に対応。温度を160から200℃に上昇させると回折ピーク強度が増し、ピークが狭くシャープになり、200℃でより高い結晶性を示す。しかし240℃では不純物が生成し、29.7°のピークはCo(PO₃)₂の(-222)面（JCPDS No. 27-1120）に帰属される。200℃での合成時間の影響をAdditional file 1: Fig. S1に示す。反応時間12時間以内では、(121)ピークの半値全幅が最小となり、より良い結晶性を示す。また、反応時間6-24時間で不純物は生成しない。Scherrerの式により、200℃、12時間調製Co₂P NPsの結晶粒子サイズは14.2 nmと計算された。

Co₂P NPsの形態をTEMで評価。図1bに示すように、200℃調製生成物は直径10-20 nmの不規則ナノ粒子で構成され、高分解能TEM（HRTEM）像（図1bインセット）で2つの格子縞が明確に観察される。隣接面間距離は0.22 nmで、Co₂Pの(121)面に対応し、TMPの生成物がCo₂Pであることをさらに確認。

Co₂P表面の化学組成をXPSで分析。Additional file 1: Fig. S2にCo₂PのXPSサーベイスペクトルを示す。Co、P、O元素が検出され、Co₂Pと一部酸化生成物の存在を確認。Co₂Pのエネルギー分散型X線分光（EDX）スペクトル（Additional file 1: Fig. S3）でもCo、P、Oの3元素共存を確認。Co 2pとP 2pの高分解能XPSスペクトルを図1c,dに示す。Co 2pスペクトルでは、781.1 eVと797.6 eVのピークがそれぞれCo²⁺ 2p₃/₂とCo²⁺ 2p₁/₂の結合エネルギー（BE）に帰属[26,36]。786.0 eVと803.1 eVのピークは2つの明確なシェイクアップサテライトピーク。Co 2p BEの778.2 eVは金属Co（777.9 eV）から正にシフトしており、Co₂P中のCoが小さな正の部分電荷（δ⁺、0<δ<2）を持つことを示唆[37]。一方、P 2p BEの129.4 eVは単体P（130.2 eV）から負にシフトし、PがCo₂P中で負の部分電荷（δ⁻）を持つことを示す。CoとP元素のBE変化は、Co₂P中での電子密度移動方向がCoからPへ向かうことを示す[38]。Co₂Pの表面酸化により少量の酸化P種が生成。したがって、高BE側の133.2 eVピークは酸化物に帰属[39]。

Co₂P/ITO電極でのH₂O₂電気化学検出

Co₂P NPsのH₂O₂還元電気触媒活性を調べるため、Co₂P NPs懸濁液を裸ITO表面に滴下し非酵素H₂O₂電極を作製。図2aに、pH 7.4の0.1 M PBS中での裸ITOとCo₂P/ITOのCV曲線を、5.0 mM H₂O₂あり/なしで示す。破線は裸ITOのH₂O₂還元応答が無視できることを示す。一方、Co₂P/ITO電極はH₂O₂存在下で-0.5 Vに顕著な還元ピークを示し、Co₂P NPsのH₂O₂還元に対する顕著な電気触媒活性を実証。図2bに、2.5 mM H₂O₂存在下でのCo₂P/ITO電極の異なる走査速度（30-100 mV/s）でのCV曲線を示す。走査速度増加に伴い還元ピーク電流が増加し、ピーク電位がより負側にシフトし、Co₂P/ITO上のH₂O₂還元が非可逆反応であることを示す。対応するキャリブレーション曲線（図2bインセット）では、還元ピーク電流密度が走査速度に比例して線形増加し、Co₂P/ITO電極表面でのH₂O₂電気化学還元が表面制御プロセスであることを示唆[40]。

図2c,dに、-0.5 Vで攪拌下0.1 M PBSへH₂O₂を逐次添加した際のCo₂P/ITO電極アンペロメトリック応答とキャリブレーション曲線を示す。Co₂P/ITO電極はH₂O₂添加に迅速に応答し、5秒以内に定常電流に到達。図2dのキャリブレーション曲線では、H₂O₂濃度0.001-1.0 mM、1.0-5.0 mM、5.0-10.0 mMの多重線形範囲を示す。センサ感度はH₂O₂濃度増加に伴い変化し、これは電極表面でのH₂O₂電気触媒還元キネティクスの変化による。先行報告[10]によれば、低濃度ではH₂O₂吸着が律速段階、高濃度ではH₂O₂活性化が主要決定因子、中間領域では吸着と活性化の両方が還元キネティクスを制御する。高濃度では多数の分析物質がCo₂P表面に吸着し活性サイトを覆うため感度が低下[41]。

様々な反応温度・時間で調製したCo₂PサンプルのH₂O₂センシング性能比較をAdditional file 1: Fig. S4, S5, Table S1に示し、200℃、12時間調製サンプルが最高性能を示す。反応温度240℃ではCo₂P中にCo(PO₃)₂が不純物として生成。Co(PO₃)₂のH₂O₂検出電気化学特性をAdditional file 1: Fig. S6で調べたところ、Co(PO₃)₂はH₂O₂に対する電気化学応答が無視でき、伝導性もCo₂Pより劣るため、アンペロメトリック試験でCo₂P/ITOの電流信号を低下させる。したがって、Co₂Pサンプルの高純度と良好な結晶性がセンシング性能向上に寄与すると考えられる。よって、200℃、12時間調製Co₂Pサンプルを最良のH₂O₂センシング材料として選択。キャリブレーションI-t曲線は、生体内H₂O₂濃度生理範囲である1.0-50 μM濃度でも良好な線形関係を示す（Fig. S7）[28]。これは本センサの実用応用可能性を高める。さらに、信号対雑音比3でのH₂O₂センサ検出限界（LOD）は0.65 μMと計算された。先行報告H₂O₂センサと比較しても、本Co₂P/ITO変換器の包括的電気化学性能は感度、線形範囲、LODの点で優れている（Table 1）。

1.0 mM H₂O₂を35回繰り返し検出後（図3a,b）、Co₂PのCo 2pおよびP 2p領域XPSスペクトルを分析し、センシングメカニズムをさらに検討。P 2p領域では検出前後でピーク位置に有意な変化なし。しかし、Co 2pスペクトルの778.2 eVと793.0 eVのピークが複数回測定後に消失。778.2 eVピークはCo₂Pサンプル中の還元Co種の存在を示す[37]ため、これら2ピークの消失は、Co₂P中の低価数還元Co種が検出過程、特に高濃度H₂O₂で酸化されることを示す。Co 2p領域に残るピーク（782.1 eVと798.3 eV）はそれぞれCo²⁺ 2p₃/₂とCo²⁺ 2p₁/₂に帰属し、複数回測定後にはCo(II)種のみがCo₂Pに存在することを示唆。コバルトベース電気触媒のH₂O₂検出利用に関する先行報告[46-48]では、Co²⁺種がH₂O₂還元の触媒活性サイトであることが実証されている。一般に、PBS中でのH₂O₂電気化学還元は以下の2段階を経る[49,50]。

H₂O₂ + e⁻ → OHₐd + OH⁻ (1)

OHₐd + e⁻ → OH⁻ (2)

2OH⁻ + 2H⁺ → 2H₂O (3)

第1段階でH₂O₂が電子を得て吸着OH⁻（OHₐd）を形成。中間体OHₐdがさらに電子を得ると、H₂O₂の最終還元生成物H₂Oが生成。H₂O₂/H₂Oの酸化還元電位がCo³⁺/Co²⁺より高いため、Co₂P中のCo(II)種は電子移動過程でCo(III)に酸化され、H₂O₂は非可逆的にH₂Oに還元される。アンペロメトリック試験では印加バイアスが-0.5 V vs Ag/AgCl（= 0.14 V vs NHE）であり、これはCo³⁺/Co²⁺標準酸化還元電位より低い。結果として酸化されたCo(III)がCo(II)に還元され、Co(II)触媒活性サイトが再生される。したがって、H₂O₂電気化学検出中にCo(II)種の触媒サイクルが進行し、繰り返し測定後に低価数還元Co種がH₂O₂により酸化されることが結論付けられる。

Co₂P/ITO電極の選択性、安定性、再現性、繰り返し精度

耐干渉性能はバイオセンサの重要特性。溶解酸素の影響を避けるため高純度窒素を用いた。アンペロメトリック試験で印加される電位で酸素も還元されるため[51]。Co₂P/ITOの0.1 M PBS中CV曲線を窒素パージあり/なしで比較すると、2.5 mM H₂O₂の還元電位と電流応答は類似（Fig. S8）、溶解酸素干渉は無視できる。Co₂P/ITOの選択性を、体液中の一般的物質や小分子（無機塩、糖類、アミノ酸、還元性生体分子）でテスト。図4aに示すように、上記干渉物質添加後の電流応答は1.0 mM H₂O₂応答に比べて無視できる。H₂O₂の2つの酸素原子が1つまたは2つのCo原子と結合可能[52]なため、H₂O₂分子はCo₂P中のCo(II)種に特異的に化学吸着する。また、実際の生体試料中の一部還元性化合物の無差別酸化干渉も、センシング時の負バイアス電位で大幅に低減可能[53]。したがって、Co₂PのH₂O₂に対する好ましい選択性は、Co(II)種が特異的吸着サイトとして機能し、センシング過程で負バイアス電位を印加することに主に由来する。

さらに、Co₂P/ITO変換器の安定性、再現性、繰り返し精度を評価。図4bに50 μM H₂O₂中での10回連続CV走査の還元ピーク電流を示す。10サイクル後、ピーク電流はわずか2.7%低下。また、空気中1ヶ月保存後も初期電流応答の約98.2%を維持（Fig. S9）、理想的な検出安定性と優れた長期耐久性を実証。電極間再現性は、H₂O₂電流応答の相対標準偏差（RSD）で評価。電極作製誤差を可能な限り排除するため、H₂O₂存在下の定常電流密度から個々電極の初期バックグラウンド信号を差し引き、得られた差分値を各電極の電気化学応答とした。同条件で6個のCo₂P/ITO電極を作製し制御実験を行ったところ、電流応答のRSDは1.24%（図4c）、比較的優れた再現性を示す。一方、繰り返し精度は1電極で1.0 mM H₂O₂を8回検出し、RSD 1.14%を達成（図4d）。以上の結果は、非酵素電気化学H₂O₂検出用電極としての満足すべき安定性、再現性、繰り返し精度を示している。

結論

まとめると、Co₂P NPsを水熱法で合成することに成功した。さらに、200℃、12時間調製Co₂P NPsがpH 7.4 PBS中でのH₂O₂電気化学還元に効率的な触媒であることを実証。非酵素H₂O₂センサとして、Co₂P/ITO電極は5秒未満の迅速アンペロメトリック応答、0.001-10.0 mMの広い応答範囲、0.65 μMの低検出限界、および満足すべき選択性、再現性、安定性を示した。本研究は、遷移金属リン化物の小分子生体分子電気化学検出への応用研究を拡げることを目的とし、Co₂P/ITOセンサを新たな非酵素H₂O₂検出プラットフォームとして設計可能であることを示した。