磁気共鳴画像法および薬物送達のための治療薬としてのFe3O4ナノクラスターに基づくハイブリッドナノ構造の製造

要約

抗がん剤と無機ナノ結晶を組み合わせて多機能ハイブリッドナノ構造を構築することは、がん治療と腫瘍抑制のための強力なツールになりました。ただし、機能性と再現性が向上したコンパクトで多機能なナノ構造を合成することは、依然として重要な課題です。この研究では、Fe ₃を使用したマグネタイトハイブリッドナノ構造の製造について報告します。 O ₄ ナノ粒子（NP）は、水中油型マイクロエマルジョンアセンブリとレイヤーバイレイヤー（LBL）法を組み合わせることにより、多機能マグネタイトナノクラスター（NC）を形成します。 Fe ₃ O ₄ NCは、最初にマイクロエマルジョン自己組織化技術によって調製されました。次に、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（PAH）とポリ（4-スチレンスルホン酸ナトリウム）（PSS）およびドキソルビシン塩酸塩（DOX）からなる高分子電解質層をFe ₃で覆った。 O ₄ Fe ₃を構築するためのNC O ₄ LBL法によるNC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。 DOXを搭載した調製済みのハイブリッドナノ構造は、pH応答性の薬物放出と、in vitroでのヒト肺癌（A549）細胞に対する高い細胞毒性を示し、 T として機能します。 ₂ T を大幅に改善できる加重磁気共鳴画像法（MRI）造影剤 ₂ 緩和性とより良い細胞MRI造影効果につながります。 490 nmの励起下で赤色信号を発するロードされたDOXは、バイオイメージングアプリケーションに適しています。この作品は、Fe ₃を構築するための新しい戦略を提供します O ₄ T を備えたベースの多機能セラノスティックナノプラットフォーム ₂ -加重MRI、蛍光イメージング、およびドラッグデリバリー。

はじめに

近年、生物医学的応用における将来の診断および治療のために、様々な多機能ドラッグデリバリーシステムが開発されてきた[1,2,3,4]。有利な特性が統合された多機能ハイブリッドナノ構造は、マルチモーダルイメージングや同時診断および治療などの重要なアプリケーションを備えています[5、6、7、8、9、10、11]。さらに、これらのナノ構造は、薬物蓄積の改善、治療効果の向上、および/または副作用の低減のための刺激応答性薬物送達システムです。特に、これらのpH応答性ドラッグデリバリーシステムは、広範な研究の関心を集めています。これは、ほとんどのヒト腫瘍のpH値がより酸性であり、薬物分子の制御放出を設計するための可能な方法を提供するためです[12、13、14、15、16]。

過去数十年にわたって、無機ナノ材料と有機ポリマー[17,18,19,20]を組み合わせたさまざまなハイブリッドナノ構造が開発されてきました。これには、磁性粒子[21,22,23]、アップコンバージョンナノ粒子（NP）[17、24]が含まれます。、およびメソポーラスシリカ粒子[25]。その中で、室温で比較的大きな磁化を持つ酸化鉄に基づく磁性ハイブリッドナノ構造は、生物医学分野で広く使用されてきました[26、27、28、29]。高分子電解質層でコーティングされた無機ナノ材料の機能化により、pH応答性のカプセル化と薬物分子の放出を実現できます[12、17、30]。最近では、ポリ（スチレンスルホン酸）ナトリウム（PSS）とポリカチオンポリ（アリルアミン塩酸塩）（PAH）で構成される高分子電解質層が広く研究されています[31、32、33、34、35、36]。多機能ドラッグデリバリーシステム用の磁性および発光NPまたは薬物分子と組み合わせた高分子電解質層も最近報告されています[37、38、39]。酸化鉄（Fe ₃ O ₄ ）NPは、その独特の超常磁性、生体適合性、低細胞毒性、および柔軟性により、磁気共鳴画像法（MRI）およびドラッグデリバリーの分野でますます注目を集めています[9、11、28、29、40、41、42 ]。一般に、Fe ₃の磁気応答性を改善する方法は2つあります。 O ₄ NP。 1つ目は、マイクロメートルサイズのマグネタイト粒子を合成することです。ただし、サイズが大きいため、水溶液中で凝集する傾向があり、生物医学的用途には有益ではありません。もう1つのアプローチは、Fe ₃を組み立てることです。 O ₄ NPをナノクラスター（NC）に変換します。これらのFe ₃ O ₄ NCは、個々のFe ₃と比較して磁気応答性を大幅に改善しました。 O ₄ NP [22、43]。したがって、自己組織化Fe ₃ O ₄ 多機能ハイブリッドナノ構造を製造するためのコアとしてNCが採用されており、Fe ₃の集合効果によりMRI性能が向上します。 O ₄ NP [43,44,45]。私たちの知る限り、自己組織化されたFe ₃ O ₄ pH応答性薬物放出のためにPAH / PSS多層で機能化されたNCはほとんど報告されていません。

この作品では、Fe ₃に基づく多用途のセラノスティックナノプラットフォーム O ₄ NPはMRIとドラッグデリバリーのために構築されました。私たちのアプローチでは、Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、水中油型マイクロエマルジョン法とレイヤーバイレイヤー（LBL）静電吸着法を組み合わせることによって得られました。パックされたFe ₃ O ₄ NCシステムは強化された T につながる可能性があります ₂ 緩和能とイメージングコントラスト、およびFe ₃の大きな比表面積 O ₄ NC / PAH / PSSハイブリッドナノ構造は、抗がん剤の高負荷を可能にします。さらに、in vitro実験では、Fe ₃とインキュベートしたヒト肺がん（A549）細胞の細胞MRI造影が示されています。 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXが大幅に強化されました。

材料と方法

資料

FeCl ₃ ・6H ₂ O（99.99％）、FeCl ₂ ・4H ₂ O（99.99％）、オレイン酸（OA、90％）、および1-オクタデセン（ODE、90％）は、AlfaAeasarから購入しました。オレイン酸ナトリウム（NaOA）、エタノール、ヘキサン、シクロヘキサン、イソプロパノール、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（SDBS）、フッ化アンモニウム（NH ₄ F）、水酸化ナトリウム（NaOH）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、およびアンモニアは、Sinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd（中国）から購入しました。ポリ（アリルアミン塩酸塩）（PAH）、ポリ（スチレンスルホン酸）（PSS）、および3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドはSigma-Aldrichから購入しました。抗がん剤ドキソルビシン塩酸塩（DOX、> 98％）はShanghai Sangon Biotech Company（Shanghai、China）から購入しました。 APMI 1640増殖培地およびウシ胎児血清（FBS）はHycloneから購入しました。すべての試薬は、さらに精製することなく、受け取ったままの状態で使用しました。

オレイン酸第二鉄の調製

磁性NPの合成は、オレイン酸第二鉄の合成から始まりました。 FeCl ₃ ・6H ₂ O（2.59 g）、NaOA（14.6 g）、C ₂ H ₅ OH（32 mL）、H ₂ O（24 mL）とヘキサン（56 mL）を150 mLの3つ口フラスコで混合し、70°Cに加熱して4時間還流し、透明なオレイン酸第二鉄錯体溶液を形成しました。その後、分液漏斗で液体を分離し、上油層を保存した。液体中のヘキサンは、70°Cで回転蒸発により蒸発し、真空下で48時間乾燥しました。準備したサンプルは、さらに使用するために真空グローブボックスに保管しました。

Fe ₃の合成 O ₄ NP

Fe ₃を合成しました O ₄ 以前に報告された手順にわずかな変更を加えた後のNP [46]。オレイン酸第二鉄（7.2 g）、OA（1.28 mL）、およびODE（50 mL）を100 mLの3つ口フラスコで混合し、アルゴン保護下で300°Cに40分間加熱しました。その後、混合物を室温まで冷却し、空気中で12時間以上酸化させた。得られたナノ結晶をイソプロパノールの添加により沈殿させ、遠心分離し、エタノール-水混合物（1：1 v ）で2回洗浄しました。 / v ）。オレイン酸でキャップされたFe ₃ O ₄ 最終的にNPを200mLのシクロヘキサンに分散させ、上澄みを密封して次の実験のために保存しました。

Fe ₃の準備 O ₄ NC

Fe ₃ O ₄ NCは、以前に修正を加えて説明したように、簡単で簡単なマイクロエマルジョン自己組織化技術によって調製されました[47]。簡単に説明すると、Fe ₃の200μL溶液 O ₄ シクロヘキサン中のナノ結晶を、14mgのSDBSを含む4mLの水溶液に注ぎました。混合溶液を5分間4回超音波処理した。形成された水中油中固体（S / O / W）エマルジョンを室温で6時間撹拌して有機溶媒を蒸発させ、続いてFe ₃を自己組織化した。 O ₄ 3DNACを形成するためのNP。最終製品を脱イオン水で3回洗浄して、過剰なSDBS、取り込まれなかったナノ結晶、およびいくつかのより大きな汚染物質を除去しました。

Fe ₃の準備 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造

Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、静電引力相互作用によって調製されました。準備されたままのFe ₃ O ₄ 陰イオン性界面活性剤のカプセル化により、NCは負に帯電します。それらは、正に帯電した高分子電解質、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（PAH、MW 15 000）の層の吸着によって最初に正に帯電するようになりました。具体的には、300μLのFe ₃ O ₄ NCサンプルは、最初に脱イオン水を使用して3mLに10倍に希釈されました。 Fe ₃ O ₄ 続いて、NC混合物を激しく攪拌しながらPAH水溶液（1 mL、10 g / L、4 mM NaCl）に滴下しました。溶液を24時間撹拌した後、遠心分離によって過剰のPAHを除去し、得られたPAHでコーティングされたFe ₃ O ₄ NC（Fe ₃ O ₄ NC / PAH）を水（3 mL）に再分散させました。

Fe ₃ O ₄ 次に、負に帯電した高分子電解質であるポリ-（4-スチレンスルホン酸ナトリウム）（PSS、MW 70 000）の層を吸着させることにより、NC / PAHを負に帯電させました。具体的には、3 mL Fe ₃ O ₄ NC / PAHサンプル溶液をPSS水溶液（1 mL、10 g / L、4 mM NaCl）に激しく攪拌しながら滴下しました。溶液を24時間撹拌した後、遠心分離によって過剰のPSSを除去し、得られたPSSでコーティングされたFe ₃ O ₄ NC / PAH（Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS）を水（3 mL）に再分散させました。

DOX水溶液は最初に調製されました[17]。濃度は5.0mg / mLでした。ハイブリッドナノ構造溶液は、Fe ₃を混合することによって得られました。 O ₄ NC / PAH / PSS溶液（3 mL、32 mg / mL）とストックDOX溶液（60μL）を小さなプラスチックチューブに入れ、暗室で24時間攪拌します。遠心分離後、Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造が最終的に得られました。

MRI測定

MRI測定は、11.7 Tマイクロ2.5マイクロイメージングシステム（Bruker、ドイツ）で実施されました。異なる量のFe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造を1.2mLのアガロース水溶液に分散させ、MRI測定のためにマイクロチューブにロードしました。最終的なFeイオン濃度はそれぞれ0mM、0.013 mM、0.026 mM、0.032 mM、0.041 mM、0.052 mM、0.065mMでした。測定パラメータは次のとおりです。繰り返し時間（TR）=300 ms、エコー時間（TE）=4.5 ms、イメージングマトリックス=128×128、スライス厚=1.2 mm、視野（FOV）=2.0×2.0cm、および平均数（NA）=2。

細胞取り込みとMRイメージング

効率的な細胞取り込みを実証するために、A549細胞を共焦点ディッシュのカバースリップに播種し、加湿した5％CO ₂でインキュベートしました。 37°Cで4時間の雰囲気。次に、Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造を異なる濃度でインキュベーション培地に添加し、2時間インキュベートしました。最終的なFeイオン濃度は、それぞれ0、2.2、4.5、9.0、および13.5μMとして得られました。培地を除去した後、細胞をPBS（pH =7.4、20 mM）で2回洗浄し、MRイメージングに直接使用しました。

DOXの標準曲線

適量のDOXを振動により水に溶解させた。次に、一連の異なる濃度のDOX水溶液を調製しました（0–0.03 mg / mL）。さまざまな濃度のDOX溶液の蛍光強度を測定しました（λ _ex =490 nm）。最後に、DOXの標準曲線は、蛍光強度 vs のカーブフィッティングによって決定されました。 DOX濃度。

面積標準曲線： Y =447.4423 + 69745.08457X。

標準曲線の精度： R ² =0.9992。

DOXのロードとリリース

Fe ₃の負荷容量を測定するには O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造、調製されたままのハイブリッドナノ構造の遠心分離後に上澄み溶液を収集した。上澄み液中のＤＯＸ分子の蛍光スペクトルを調べ、上澄み中のＤＯＸの濃度を、ＤＯＸの標準曲線を比較することによって計算した。 Fe ₃に残っているDOXのパーセンテージ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、次の式に従って計算されました。

$$ \ mathrm {Loading} \ \ mathrm {efficiency} \ \ left（\％\ right）=\ left（{\ mathrm {W}} _ 0 \ hbox {-} {\ mathrm {W}} _ {\ mathrm {s}} \ right）/ {\ mathrm {W}} _ 0 \ times 100 \％$$

ここで W ₀ および W _s それぞれ、初期DOX質量と上澄みのDOX質量を表します。

0.15 Mの同じNaCl濃度のPBS緩衝液（pH 5.0および7.4）での累積DOX放出研究では、Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造を1.0mLの緩衝液に分散させた後、透析バッグに移しました。その後、緩衝液に保存し、暗室で37℃で穏やかに振とうしました。選択した時間間隔で、100μLの溶液を取り出し、蛍光スペクトルで分析した後、元の溶液に戻しました。

Feのinvitro細胞毒性₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造

Fe ₃のinvitro細胞毒性 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、標準的なメチルチアゾリルテトラゾリウム（MTT）アッセイに基づいてA549細胞に対して評価されました。 A549細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）、100μg/ mLのストレプトマイシン、および100μg/ mLのペニシリンを添加したAPMI1640増殖培地で培養しました。セルは、5％CO ₂の加湿雰囲気で37°Cに維持されました。放送中。アッセイは同じ方法で3回行った。簡単に説明すると、A549細胞を8×10 ³ の密度で96ウェルプレートに播種しました。 100μLの培地でウェルあたりの細胞数。一晩増殖させた後、細胞を様々な濃度の遊離DOX、Fe ₃でインキュベートしました。 O ₄ NC / PAH / PSS、およびFe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造（0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μM）、24時間。 24時間インキュベートした後、10μLの3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド溶液（5 mg / mL）を各ウェルに加え、細胞をさらに4時間インキュベートしました。 37°Cでh。 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド溶液を除去した後、150μLのジメチルスルホキシド（DMSO）を各ウェルに添加し、プレートを10分間穏やかに振とうして溶解させた。沈殿した紫色の結晶。マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer、Victor X4）を使用して、490 nmで光学密度（OD）を測定しました。細胞生存率は、コントロール細胞と比較したパーセンテージとして評価されました。

特性評価

Fe ₃のサイズと形態 O ₄ NPとFe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、FEI Tecnai G2-F20透過型電子顕微鏡（TEM）によって加速電圧200kVで調べられました。動的光散乱（DLS）測定は、Malvernの粒子サイズおよびゼータ電位アナライザー（Zetasizer Nano ZS90）で実行されました。 UV-vis吸収スペクトルは、Perkin Elmer Lambda-25UV-vis分光計によって取得されました。蛍光スペクトルは、HitachiF-4600蛍光分光光度計を使用して記録されました。誘導結合プラズマ原子発光分析（ICP-AES）（Agilent 5100）を使用して、Fe ₃中の元素Fe濃度を分析しました。 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。

結果と考察

Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、一次酸化鉄（Fe ₃ O ₄ ）NPは、LBL静電吸着法に続いて、変更[17、47]で前述したように、マイクロエマルジョン自己組織化技術によって高密度に充填された球状凝集体を生成します。図1は、Fe ₃の合成の概略図を示しています。 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。疎水性オレイン酸でコーティングされたマグネタイトFe ₃ O ₄ NPは当初、有機溶媒中での熱分解プロセスによって生成されました[46]。 Fe ₃ O ₄ NPは球形でサイズが均一で、平均粒子サイズは約15 nmです（追加ファイル1：図S1）。磁性NCの組み立てには、OAコーティングされたFe ₃ O ₄ NPをシクロヘキサンに分散させた後、SDBSを含む水溶液に滴下した。複雑な溶液を超音波処理して、安定した水中油型エマルジョンを形成しました。エマルジョン中の有機溶媒を蒸発させた後、Fe ₃ O ₄ NPは自己組織化され、疎水性相互作用を介して球状ナノクラスターを形成しました。次に、Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、静電引力相互作用によるLBL法によって調製されました。これは、図1に概略的に示されています。

Fe ₃の形態とサイズ O ₄ NCとFe ₃ O ₄ NC / PAH / PSSハイブリッドナノ構造は、それぞれTEMとDLSで調べられました。図2aおよびbに示すように、Fe ₃ O ₄ NCは、準球形クラスターを示します。 DLSで測定された平均粒子サイズは約57nmです（図2e）。以前の報告では、正電荷を持つPAHまたは負電荷を持つPSSは、その優れた静電特性により、テンプレート表面に交互に堆積されます[48、49、50、51]。 Fe ₃上に堆積した各高分子電解質層の形成を研究する O ₄ NC、ゼータ電位実験が行われた。 PSS / PAHおよびDOXコーティングの高分子電解質層によるゼータ電位の変化を追加ファイル1：図S2に示します。手付かずのFe ₃ O ₄ NCは、SDBSが存在するため、負のゼータ電位が-19.7mVになります。 Fe ₃上の正に帯電したPAH単層の吸収 O ₄ NCは、表面電位を-19.7から+ 32mVに反転させます。続いて、負に帯電したPSS層の堆積により、+ 32から-34mVへの別の表面電位の反転が発生します。これは、磁性NCハイブリッドナノ構造の製造中の段階的な層成長を示しています。これらの結果は、PAH層とPSS層がFe ₃に正常にコーティングされたことを示しています。 O ₄ NC。最後に、DOXはFe ₃の表面にうまく吸着されました。 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。これは、正のゼータ電位（+ 1.91 mV）によって確認されました（追加ファイル1：図S2）。 Fe ₃の倍率が異なるTEM画像 O ₄ NC / PAH / PSSハイブリッドナノ構造を図2cおよびdに示します。高分子電解質コーティング後、構造および形態に大きな違いは見られません。図2aおよびbと比較すると、明るいコントラストとFe ₃のサイズが観察できます。 O ₄ NC / PAH / PSSハイブリッドナノ構造は、PAHおよびPSS層のコーティングによりわずかに増加しています。合成された磁気ハイブリッドナノ構造は、DLS測定の結果によると、平均サイズが約84 nmのほぼ単分散の準球形を示しています（図2f）。

Fe ₃の潜在的なアプリケーションを評価するには O ₄ MRIにおけるNC / PAH / PSSハイブリッドナノ構造、プロトン横緩和率（1 / T ₂ ）Feイオン濃度の関数として、11.7TでBrukerAVANCE 500WB分光計を使用して決定しました。図3bに示すように、緩和率とFeイオン濃度の間に線形関係が観察されました。さらに、横緩和率（1 / T ₂ ）Fe ₃の濃度の増加とともに増加 O ₄ Fe ₃の高度な凝集によるNC O ₄ 磁気NPコア、磁気ハイブリッドナノ構造が効果的な T である可能性があることを示しています ₂ -加重MRI造影剤（図3a）。図3bのプロットの傾きに基づいて、横緩和度の値（ r ₂ ）は651.38 mM ^-1 であると決定されました S ^-1 、これは報告された研究のそれよりも高い[22]。商用の T との比較 ₂ 造影剤であるナノクラスターは、集合効果に基づいて磁気NPが自己組織化した後、Feのコントラスト能力を大幅に向上させることができるため、血管造影効果を大幅に向上させることができます。前の研究では、組み立てられたマグネタイトナノ結晶は、磁性ナノ結晶の集合効果により、個々のナノ結晶よりも高いレベルの飽和磁化を示しました[43、52]。

Fe ₃の薬物負荷容量を評価するには O ₄ ドラッグデリバリーキャリアとしてNC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造、水溶性抗がん剤（DOX）がモデル薬剤として選択されました。高効率のハイブリッドナノ構造におけるDOXの貯蔵は、溶液の色の変化によって最初に明らかにされました。 Fe ₃の溶液の色 O ₄ NC / PAH / PSSと純粋なDOX溶液は、それぞれ黄色がかった赤でした（図4aとb）。 Fe ₃の形成後 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造では、溶液の色がオレンジ色になりました（図4c）。 Fe ₃の存在により O ₄ 懸濁液中のDOXをロードしたナノ構造であるNPは、外部磁石によって分離でき、磁気標的化ドラッグデリバリーのために得られたハイブリッドナノ構造の大きな可能性を示唆しています（図4d）。 UV-vis吸収分光法を使用して、有効なDOXストレージ容量を決定しました。図4eは、Fe ₃との相互作用前後のDOX水溶液のUV-vis吸収スペクトルを示しています。 O ₄ NC / PAH / PSSハイブリッドナノ構造。遊離DOXと比較して、Fe ₃でも同様の吸収ピーク特性が観察されました。 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。これは、Fe ₃の再結合吸収ピークです。 O ₄ NCとDOX。 DOXを含まないサンプルは、Fe ₃の吸収ピークのみを示しています。 O ₄ NC。これらのデータは、薬物としてのDOXがハイブリッドナノ構造の表面にうまく吸収されることを示しています。ハイブリッドナノ構造の表面にロードされたDOXの吸着濃度には上限があることもわかっています。図4fは、Fe ₃のPLスペクトルを示しています。 O ₄ 異なる濃度のDOXをFe ₃に添加した場合の、遠心分離後のNC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造 O ₄ NC / PAH / PSSソリューション。 DOXの発光強度は、Fe ₃の濃度で上限（8 mg / mL）に達するまで、追加されたDOXの増加として増加します。 O ₄ NC / PAH / PSS（1.30×10 ⁻² mg / mL）変更なし。その後、Fe ₃の表面に吸着できない過剰なDOXのため、捕捉量が減少します。 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。 DOXの最も強い蛍光強度は、8 mg / mLの濃度に対応し、対応するサンプルは、生物医学実験を行うためのさらなる研究に使用されます。ハイブリッドナノ構造の確実な薬物負荷効率は、臨床応用にとって非常に重要です。ローディング効率は、DOXの標準曲線法を使用してDOX蛍光強度の面積積分によって計算されました[53、54]。負荷効率は、Fe ₃で最大24.39％と計算されました。 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。そのため、Fe ₃に基づいてセラノスティックプラットフォームが構築されています。 O ₄ 抗腫瘍薬DOXの効果的な吸収によるNC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。

Fe ₃のinvitro薬物放出プロファイル O ₄ さまざまな環境pH値でのNC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造を図5に示します。Fe₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、37°Cでリン酸緩衝液中の透析膜を介して透析されました。ハイブリッドナノ構造から放出されたDOXを収集し、次にDOXの放出量を上澄みの蛍光強度によって計算した。生理学的pH7.4では、観察された薬物放出は徐放プロセスです。 DOXの約20wt％が最初の5時間で放出され、その後、徐放の安定した段階に入りました。 pH 5.0では、放出プラトーに達する前の最初の15時間で、ハイブリッドナノ構造から約80 wt％のDOXが放出されました。 30時間にわたって観察されたDOX放出のプラトーパーセンテージは、pH5.0および7.4でそれぞれ80±3wt％および20±3 wt％でした。 Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、持続放出プロファイルと、pH7.4よりもpH5.0の方が高いDOX放出速度を示しています。低環境pHは、Fe ₃からのDOX放出を加速します O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。これは、–NH ₂のプロトン化によるものです。酸性条件下でのDOXのグループ。これにより、低pH値でのDOXとPSSポリマー間の静電相互作用が減少します[55]。薬物放出研究は、報告された研究[56,57,58]と同様に、生理学的pHでの静電的に結合した薬物分子の良好な安定性と酸性条件での誘発放出を示しています。したがって、得られたFe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、DOXドラッグデリバリー用のpH応答システムであり、固形腫瘍の特定の治療に適しています[59]。

細胞への取り込みと細胞毒性は、新しいドラッグデリバリーシステムの可能性を評価するための重要な要素です。 Fe ₃の細胞への取り込みと細胞毒性 O ₄ A549細胞株上のNC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造が研究されました。 Fe ₃の細胞間取り込み O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、主にDOXからの蛍光を監視することによって実現された光学および蛍光顕微鏡を使用して調査されました。 Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、DOXを癌細胞に送達するのに効果的であることが証明されています。図6に示すように、DOXからの強い赤色蛍光が24時間のインキュベーション後に癌細胞で観察されました。ハイブリッドナノ構造は、主にエンドサイトーシスによって内在化されました[60]。細胞取り込み後、ハイブリッドナノ構造はエンドソーム/リソソーム周辺の酸性環境でDOXを放出し、十分に低いpH（4.3）が効果的なDOX放出（pH 5.0、図5）を引き起こす可能性があります。 Fe ₃ O ₄ 図6に示すように、NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、A549癌細胞で時間依存的な取り込みを示しました。インキュベーション後0.5時間で、細胞の周囲に赤い蛍光が見られました。結果は、DOXを含むハイブリッドナノ構造が主にA549細胞の周りにとどまっていることを示しています。しかし、インキュベーション時間が24時間に増加すると、A549細胞からの細胞間蛍光シグナルが増加しました。明らかに、多くのハイブリッドナノ構造は時間の経過とともに癌細胞に侵入する可能性があります。これらの結果は、Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、DOXをA549細胞に効率的に移すことができます。細胞質のハイブリッドナノ構造から放出されたDOXは核膜を通過し、最終的に核に蓄積し、DNAコンフォメーションの変化を引き起こすことによって細胞を殺します[61]。

Fe ₃の薬理活性を評価するために O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造、invitroでのA549細胞に対する細胞毒性はMTT法によって決定されました。図7は、遊離DOX、Fe ₃の細胞活性を示しています。 O ₄ NC / PAH / PSS、およびFe ₃ O ₄ A549細胞と24時間インキュベートした後の濃度の異なるNC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。材料量は、DOXの濃度に従って計算されました。遊離DOX濃度は、Fe ₃のDOX濃度と同じでした。 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造、およびFe ₃の濃度 O ₄ NC / PAH / PSSハイブリッドナノ構造はFe ₃と同じでした O ₄ Fe ₃のNC / PAH / PSS濃度 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。各サンプルをA549細胞で24時間培養しました。 Fe ₃の濃度 O ₄ NC / PAH / PSSは0.1から2.0μMの範囲であり、細胞生存率は85％を超えました。これは、Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSSハイブリッドナノ構造は、癌細胞に対する明らかな細胞毒性がなく、良好な生体適合性を持っていました。ただし、癌細胞と24時間インキュベートした後、遊離のDOXとFe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は明らかな細胞毒性を示しました。細胞の生存率は、有効なDOX濃度の増加とともに徐々に減少しました。図7に示すように、有効DOX濃度が0.1から2.0μMに増加すると、相対的な細胞生存率は、遊離DOXの場合は約92％から約50％に、Fe <の場合は約89％から約40％に減少しました。 sub> 3 O ₄ それぞれNC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。

これらの結果は、遊離DOXとFe ₃の両方が O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、癌細胞に対して用量依存的な細胞毒性を持っています。細胞毒性は、Fe ₃ではなくロードされたDOXに由来します O ₄ NC / PAH / PSSハイブリッドナノ構造。遊離DOXの細胞取り込みは、DOXをロードしたハイブリッドナノ構造よりも高速です。この理由は、小さなDOX分子が細胞内に急速に広がる可能性がある一方で、Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、癌細胞に侵入するためにエンドサイトーシスでなければなりません。低酸素によって誘発される解糖の協調的アップレギュレーションのために、固形腫瘍の酸性細胞外環境は正常組織のそれよりも強い[62]。細胞レベルでは、ほとんどのハイブリッドナノ構造の内部移行はエンドサイトーシスによって起こります。 DOX濃度の増加に伴い、DOXがロードされたハイブリッドナノ構造が癌細胞にエンドサイトーシスされます。細胞エンドサイトーシス後、DOXをロードしたハイブリッドナノ構造は通常、初期エンドソームに入り、次に後期エンドソーム/リソソームに入り、最後にリソソームと融合します。さらに、エンドソーム（pH 5.0–6.0）とリソソーム（pH 4.5–5.0）はどちらも酸性の微小環境を持っています。私たちの研究では、pH応答性のFe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、酸性環境で薬物を分解および放出する可能性が高いため、副作用を効果的に低減し、薬物の半減期を延長し、より効果的で持続的な治療を提供します。 DOXの主な標的は細胞核であるため、DOXは二本鎖DNAに結合して、DNA付加体を形成し、トポイソメラーゼの活性を阻害し、細胞死（アポトーシス）を誘発します[63]。その結果、放出されたDOX分子は細胞核に位置していた。したがって、得られたFe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、癌化学療法の可能性が高い可能性があります。

上記のように、Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、水溶液中で高い緩和能を示し、A549細胞に効率的に取り込まれます。 Fe ₃の細胞内MRI O ₄ 次に、NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造を、A549細胞を異なるFe ₃のハイブリッドナノ構造とインキュベートすることによって調査しました。 O ₄ 濃度。図8は、 T を示しています。 ₂ -A549細胞の加重MRI。 Fe ₃の増加に伴い O ₄ Fe ₃の濃度 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造では、細胞のMRI信号が徐々に増加しました（図8）。現在、細胞標識は主にFe ₃のエンドサイトーシスによって達成されています O ₄ T としてのNC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造 ₂ -ネガティブ造影剤。これらの結果は、Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は細胞に内在化され、良好な T を示すことができます ₂ -細胞イメージング用の加重MRI造影。私たちの現在の研究は細胞レベルに限定されています。 Fe ₃の実用化には、将来のinvivo研究が必要となるでしょう。 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。動物実験で特定の部位を特別に標的化するには、乳酸や葉酸（どちらもカルボキシル基を含む）などの小さなリガンドを使用して、アミノ末端のFe ₃を結合させる必要があります。 O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造。

結論

多機能Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、効果的な癌化学療法とMRIのためのpHトリガードラッグデリバリーシステムとして開発されました。準球形Fe ₃ O ₄ NCは、Fe ₃と比較してMRIのコントラスト能力を大幅に向上させることができます。 O ₄ NP。 Fe ₃ O ₄ NC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、MRIを強化する造影剤として、また細胞イメージング用の蛍光プローブとして機能します。 DOXはFe ₃から解放できます O ₄ 酸性環境でのNC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、A549細胞に対して優れた細胞毒性効果を示します。 Fe ₃ O ₄ 多機能セラノスティックプラットフォームとしてのNC / PAH / PSS / DOXハイブリッドナノ構造は、MRI、蛍光イメージング、刺激応答性ドラッグデリバリーナノキャリアなどの生物医学的応用に大きな可能性を秘めています。