正に帯電した磁性ナノ粒子を使用して、超低濃度で細菌を捕獲する

背景

感染症は、世界で最も差し迫った健康上の課題の1つです。水資源の微生物汚染は、公衆衛生に対する大きな脅威です。 大腸菌 （ E.coli ）、グラム陰性菌は、汚染された水や食品に非常によく見られます。 Eのいくつかの株。コリ 深刻な細菌感染症を引き起こすことさえあります。低濃度の細菌は検出が難しく、通常、さらに分析する前に事前濃縮プロセスが必要です。培養ベースの微生物学的方法は骨の折れるものであり、数日かかる場合があります。さらに、一部の細菌株は、生存可能であるが培養不可能な状態に入る可能性があり、通常の寒天では生存可能であるが培養可能ではないため、培養ベースの方法による検出が妨げられます[1]。逆に、細菌性病原体の迅速な捕獲と除染は、感染症の発生を軽減するためのリアルタイムの結果を提供する可能性があります。

汚染源からバクテリアを迅速に捕獲して除去するために、さまざまな材料が開発されています。カーボンナノチューブと樹脂結合オリゴアシルリジンビーズは、水からバクテリアを除去するために使用されてきました[2、3]。磁性プロセスを採用することでさまざまな資源から便利に分離できる磁性ナノ粒子は、有機分子で機能化された後の細菌の検出と除染に広く使用されていました[4、5、6]。磁気ベースの技術には、時間の節約（1時間以内の一般的な分離時間）、高い回収率、可能な自動化、およびスケールアップ分離によるターゲットキャプチャの利点があります[7]。磁気分離の効率と選択性はリガンドに大きく依存しますが、ターゲットに対して高い親和性と特異性を持つリガンドを得るのが難しい場合があります。したがって、特に低濃度で細菌を捕獲するには、リガンドに依存しない磁性ナノ粒子を使用した細菌捕獲システムを開発する必要があります。

多くの科学者がバクテリアの電荷の性質を調査しました。 Bechhold（1904）は、細菌細胞が負の電荷を帯びているという事実を最初に発見した[8]。細菌細胞の大集団が負の電荷を維持する傾向があることはすでに知られていましたが、単一細胞のレベルでの細菌の電気生理学についてはほとんど知られていません。 2011年に、コーエン等。 Eで電気的スパイクが明らかになった。コリ 蛍光電圧表示タンパク質を使用して最大1Hzで[9]。多くの種類の細菌の細胞壁は負に帯電しているため、正に帯電したナノ粒子は、静電相互作用を介して広範囲の細菌と強く相互作用することができます。

磁性ナノ粒子と個々の細菌の負電荷を利用して病原体を迅速に検出するために、低濃度で細菌を捕獲するシステムを設計しました。正に帯電した磁性ナノ粒子は、豊富なアミン基で構成されるポリエチレンイミン（PEI）によって製造されました。次に、 Eに対するPEI官能化ナノ粒子の親和性を調査しました。コリ 。この革新的な方法は、静電相互作用による細菌への効率的な結合を提供します。

材料と方法

ナノマテリアル

塩化鉄（III）水和物（FeCl ₃ ・6H ₂ O）、水酸化アンモニウム（NH ₄ OH、28 wt％）、塩酸（37 wt％水溶液）、エチレングリコール、および酢酸ナトリウムは、Shanghai（China）ReagentCompanyから購入しました。オルトケイ酸テトラエチル（TEOS）、（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）、およびフルオレセインテトラメチルローダミン（TRITC）は、Sigma-Aldrich（USA）から購入しました。分岐ポリ（エチレンイミン）（PEI、99％、 Mw =10,000）はAlfaAesarから購入しました。すべての溶液は、Milli-Q脱イオン水（25°Cの抵抗率で18.2MΩcm）を使用して調製されました。

NP合成

Fe ₃ O ₄ ナノ粒子はソルボサーマル反応によって調製されました[10]。簡単に説明すると、0.081gのFeCl ₃ ・6H ₂ Oを磁気攪拌下で30mLのエチレングリコールに溶解しました。次に、0.3 gのポリアクリル酸（PAA）と1.8gの尿素をこの溶液に加えました。 30分間撹拌した後、テフロンで裏打ちされたステンレス鋼のオートクレーブを使用して、溶液を200℃で12時間加熱した。室温まで冷却すると、黒色の生成物、すなわち磁性ナノ粒子コアが磁石によって収集された。その後、エタノールと脱イオン水で3回ずつ洗浄し、Fe ₃ O ₄ ナノ粒子を超音波処理下で0.15M HClで15分間処理した後、加水分解とTEOSを介してシリカでコーティングしました。

負に帯電した蛍光磁性ナノ粒子（NP-）を調製するために、APTES-TRITC（C33H44N3O6Si）複合体を最初に暗条件下でエタノール中で一晩反応させました。次に、複合体をFe ₃ にグラフトしました。 O ₄ APTESとFe ₃ のヒドロキシル基との反応によるナノ粒子 O ₄ @SiO ₂ ナノ粒子。続いて、30μLのTEOSを添加し、暗所で24時間反応させました。その後、エタノールと脱イオン水で3回ずつ洗浄すると、蛍光NP-が生成されました。ポリカチオンポリマーPEIでNP-を修飾することにより、正に帯電した磁性ナノ粒子（NP +）が完成しました。

NPの特性評価

透過型電子顕微鏡（TEM）研究は、TECNAI F ^{− 30} によって実施されました。 300kVで動作する高分解能透過型電子顕微鏡。 NPの粒子サイズとゼータ電位は、Malvern Zeta Sizer Nanoシリーズ（マサチューセッツ州ウェストボロー）によって決定されました。 Carl Zeiss LSM5 EXITERレーザー走査型共焦点顕微鏡（Zeiss、イエナ、ドイツ）を使用して蛍光を調べました。

バクテリアの準備

グラム陰性菌 E。コリ モデル細菌としてBL21を使用した。 E。コリ 100mLのルリアブロス増殖培地で培養されました[11]。バクテリアはサーモスタットインキュベーター内で200rpm、37°C​​で16時間培養されました。続いて、100μLの細菌培養物を除去し、培地1×10 ⁵ で希釈しました。 寒天にコーティングし、37℃で24時間培養しました。コロニー形成単位の数を数えた。残りの細菌細胞を5000rpmで5分間の遠心分離により回収し、1×PBS（10 mM、pH 7.4）で3回洗浄し、約1×10 ³ の濃度に希釈しました。 コロニー形成単位（CFU）/ mL。安全上の理由から、すべての細菌サンプルを121°Cのオートクレーブに入れて20分間殺菌し、廃棄前に細菌を死滅させ、細菌と接触するすべてのガラス器具を使用前と使用後に滅菌しました。

バクテリア捕獲実験

すべてのバッチキャプチャー研究は、滅菌済みの1×PBSバッファーで実施しました。 40マイクロリットルのNP（1μg/μL）を10分間の超音波処理下で滅菌生理食塩水に分散させ、次に1 mLの細菌溶液（約10 ³ ）を分散させました。 CFU / mL）を懸濁液に加えた。 10分間のインキュベーション後、NPに結合した細菌を永久磁石を介してバイアルの壁に捕捉し、遊離細菌を洗浄液で除去しました。捕捉されたバクテリアは磁石を取り除くことによって放出され、PBSに再懸濁されました。顕微鏡分析のために、細菌のアリコートをスライド上に広げ、Hema-3（Fisher Diagnostics）で染色しました。免疫蛍光分析のために、細菌のアリコートをスライド上に広げ、4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色しました。

さまざまな濃度でのNPの細菌捕獲効率

1ミリリットルの細菌懸濁液（約2×10 ² CFU / mL）をさまざまな量（5、10、20、30、40、50、75、および100μg/ mL）のNP +またはNP-と10分間インキュベートしました。ナノ粒子による磁気分離後、全溶液をサンプリングし、プレートカウント法によって細菌濃度を分析しました。 NPの細菌捕獲効率は、LB寒天プレート上のCFUの数を数えることによってテストされました。

低濃度でバクテリアを捕獲するNPの能力

40マイクログラムのNP +またはNP-を、非常に低濃度（10および10 ² ）の1mLの細菌懸濁液とインキュベートしました。 CFU / mL）。ナノ粒子による磁気分離後、全溶液をサンプリングし、プレートカウント法によって細菌濃度を分析しました。 NPの細菌捕獲効率は、LB寒天プレート上のCFUの数を数えることによってテストされました。

統計分析

結果は、図の凡例に示されているように、平均±標準偏差（SD）として表されました。 P を備えたGraphPadPrismソフトウェアを使用して、適切な事後分析を伴う二元配置分散分析（ANOVA）を計算しました。 値<0.05は統計的に有意と見なされます。

結果

磁気NPの特性評価

表面帯電磁性複合ナノ粒子の調製の概略図を図1に示します。Fe ₃ O ₄ ナノ粒子はAPTESと結合して、SiO ₂ の薄層を形成します TEOSおよびNH ₄ との反応によるナノ粒子表面のシェル ああ。捕捉された細胞を直接視覚化および定量化するために、APTES-TRITC複合体が最初に反応し、続いてFe ₃ の表面にグラフトされます。 O ₄ 古典的なゾル-ゲル反応による@シリカ複合材料。豊富なSiOH基がこの製品の表面全体を支配し、強い負の表面電荷、つまり負に帯電した磁性ナノ粒子（NP-）を示します。正に帯電した磁性ナノ粒子（NP +）の場合、PEI分子を使用してNP-の表面を覆い、修飾します。アミン基が豊富に存在するため、修飾された生成物は強い正の表面電荷を示します。

ナノ粒子の設計。表面帯電した蛍光性の超常磁性複合ナノ粒子（NP）の設計を示す概略図

図2aに示すように、TEMは、磁性複合ナノ粒子の直径が450 nmであり、均一なSiO ₂ で構成されていることを示しました。 コーティング（60 nmのサイズ）。図2bの粒子の動的光散乱（DLS）は、表面機能化後に平均直径が増加した狭いサイズ分布を示しました。正電荷と負電荷を持つ複合ナノ粒子の最大サイズは、それぞれ620nmと700nmです。 DLSで測定されたナノ粒子は、通常、TEMで測定されたものよりも大きくなります。これは、DLSで評価されたサイズがブラウン運動の影響を受け、周囲温度、ナノ粒子の動的半径、および衝突の発生を介して静的環境によって引き起こされるナノ粒子の凝集の程度に依存するためです[12]。図2cは、負および正のナノ粒子のゼータ電位分布を示しています。脱イオン水（pH 7.0）では、NP-およびNP +のゼータ電位はそれぞれ-26.6mVおよび+ 28.1mVです。 NP +のゼータ電位のpH依存性は、追加ファイル1：図S1に示されています。これらの結果は、表面に帯電したナノ粒子が中性条件下で水溶液によく分散していることを示しており、細胞の捕捉に適用できます。

ナノ粒子の特性評価。 a 正に帯電したナノ粒子（NP +）と負に帯電したナノ粒子（NP-）の透過型電子顕微鏡（TEM）画像。 b 動的光散乱サイズとNPの分布。 c NPのゼータ電位分布

磁気NPが Eをキャプチャする機能。コリ

図3は、バクテリア捕獲の一般的な実験手順を示しています。 NPを細菌の溶液と混合し、室温で10分間インキュベートしました。続いて、永久磁石を使用して、「磁化された」バクテリア（細胞表面に結合した磁性ナノ粒子）をチューブの壁に捕捉しました。残りの溶液を除去し、PBS（外側に磁石を使用）で骨材を洗浄した後、顕微鏡分析のために骨材をスライドに移しました。スキームに示されているように、NP +は、 Eを迅速に濃縮するのに十分な静電応答性を提供します。コリ 。逆に、NP-実験ではPBSをすすぐことでバクテリアを除去します。

バクテリア捕獲の手順の図解。 E。コリ 懸濁液中はそれぞれNP +およびNP-と混合され、その後10分間インキュベートされます。 「磁化された」バクテリアは、磁石によってバイアルの壁に引き付けられました。残りの溶液を除去した後、細菌をNPで捕捉し、PBSを使用して洗浄し、細菌コロニーの数からカウントしました

ナノ粒子の光学画像を図4に示します。NP-の光学画像は、単分散で均一に分布した粒子を示しています。ただし、NP +は凝集する傾向がありました。 NP +のサイズ分布は明らかにNP-のサイズ分布よりも広いです。これらの結果は、NP +とNP-が Eとの相互作用のパターンが完全に異なることを示しました。コリ 。 NP +の細菌親和性をさらに調査するために、 Eにおける局在化NP +。コリ 蛍光分析を使用して調べた。図5aは、キャプチャされた Eを示しています。コリ DAPI（青色）とTRITC（赤色）の両方で陽性です。細菌に対するNP +の親和性を明確に確認するために、TEM技術を使用しました。図5bでは、多数のNP +が細菌の細胞壁に凝集しているのが観察されました。これらの結果は、NP +がバクテリアに対して強い親和性を持っていることを示唆しています。

Eの比較。コリ NP +およびNP-の結合能力。左の画像は、NP +と結合する細菌の位相差フィールドです。右の画像にはナノ粒子のみが含まれており、 Eに結合する能力のないNP-を示唆しています。コリ セル

Eの蛍光およびTEM画像。コリ NP +との結合。 a 上のパネルは Eの蛍光画像を示しています。コリ NP +と結合する細胞。 DAPIは細胞核を染色するために使用されます。 TRITCはNPでラベル付けされています。 b 下のパネルは、NP +および Eを示す代表的なTEM画像です。コリ 複合体

Eの低濃度の検出。コリ

細菌のダイナミクスとNP +相互作用をさらに特徴づけるために、 Eをインキュベートしました。コリ 一定数（2×10 ² CFU / mL）5〜100μg / mLの範囲のさまざまな濃度のNP。次に、NPに結合した細菌を磁気的に捕捉して分離しました。 NP +およびNP-による細菌の磁気捕捉効率を図6に示すようにプロットします。 Eの数。コリ NP-によって捕捉されるのは、100μg/ mLの高濃度でもわずか12％です。 NP-とは対照的に、NP +は有意な細菌捕獲能力を示し、40μg/ mL（ P ）で81％の捕獲効率を達成しました。 <0.001）。 LB寒天プレートからわかるように、NP +による細菌コロニーの用量依存的な増加が実証されました。

Eの効率をキャプチャします。コリ 示された様々な濃度でのNP +またはNP-による。左の画像は、 EでコーティングされたLB寒天プレートの写真です。コリ NP +およびNP-によってキャプチャされます。右の画像は、示されたさまざまな濃度でのNPの細菌捕獲効率を示しています。 E。コリ （2×10 ² NPインキュベーションなしの1mLPBS溶液中のCFU）を100％としてカウントし、コントロールとして使用しました。 * P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001

Eに対するNP +親和性を確認するため。コリ 超低濃度で、40μgのNPを10および100CFUの Eのみを含む1mlのPBS溶液と混合しました。コリ 。図7は、すべてのサンプルの寒天プレートで得られたコロニーの写真を示しています。予想通り、NP +は確かに Eをキャプチャしました。コリ 超低濃度では、NP-を使用したプレートでは細菌コロニーは明らかではありませんでした。プレート内のいくつかのコロニーは、ナノ粒子の非特異的親和性に起因する可能性があります。さらなる分析により、NP +を使用して超低濃度（10および100 CFU / mL）で90％を超える細菌捕獲効率が得られたことが示されました。対照的に、同じ条件でNP-を使用した場合のキャプチャ効率は4％未満であり、大きな違いがあります（ P <0.001）。これらの結果は、NP +が細菌に対して強い親和性を持っていることを示唆しており、これは静電引力によって説明できます。広域スペクトルの細菌捕獲特性を調査するために、3つのグラム陽性菌（枯草菌）を使用しました。 、黄色ブドウ球菌 、および Lactococcus lactis ）モデルとして。追加ファイル1：図S2に示されているように、NP +は、バクテリア（ E. coli ）に対してより高い吸着能力を持っています。 および B。枯草菌 ）ブドウ球菌（S。aureus ）および連鎖球菌（ L.lactis ）。さらに、3-ブロモピルビン酸（3-BP）やDNAなどの負に帯電した分子が、細菌の捕獲効果を妨げる可能性があることもわかりました。死んだ E.coli そのようなシステムでは無効です（追加ファイル1：図S3）。

Eの効率をキャプチャします。コリ 超低濃度でのNP +またはNP-による。左の画像は、 EでコーティングされたLB寒天プレートの写真です。コリ NP +およびNP-によってキャプチャされます。右の画像は Eを示しています。コリ 超低濃度のバクテリアによるNP（40μg/ mL）の捕捉効率。 E。コリ NPインキュベーションなしの（1mLのPBS溶液中の10および100CFU）を100％としてカウントし、コントロールとして使用しました。 *** P <0.001

ディスカッション

両方のグラム陰性菌（ E.coli など）が知られています ）およびグラム陽性菌（ B. subtilis など） ）静電引力を介して負に帯電した粒子よりも正に帯電した粒子とはるかに簡単に相互作用します[13、14]。これは私たちの研究でも見つかりました。私たちの捕獲システムの利点の1つは、PEIで官能化されたナノ粒子がより多くのアミン基を持っていることです。これにより、超低濃度で細菌を捕獲することができました。現在までに、10 ² 未満の濃度で細菌を検出できる一般的で満足のいくアッセイがいくつかあります。 培養プロセスを介して細菌を事前に濃縮せずにCFU / mL。この研究は、10 CFU / mLの濃度で1時間以内にグラム陰性菌（生物は細胞膜、細胞壁、および無傷の外膜を持っています）を捕獲および検出するために磁性ナノ粒子を使用する簡単なアッセイを示しました。

私たちの実験では、NPの表面電荷が細菌の捕獲効率に影響を与える可能性があることを発見しました。ここでは、NPの表面の電荷が細菌の捕獲効率に及ぼす影響を E.coli を使用して調べました。 モデル細菌として。 NP +を捕捉アッセイに使用した場合、それらは細菌の効率的な吸着能力を示しました。細菌の捕獲効率は、NP +の投与量とともに増加しました。 TEM顕微鏡は、ナノ粒子と細菌細胞で構成される巨視的な凝集体を示しています。対照的に、NP-は、高濃度であっても、低い細菌捕捉能力を示しました。全体として、これらの観察結果は、NP +がNP-よりも有意に高い捕獲能力を持っていることを示しました。

グラム陽性菌とグラム陰性菌は膜構造に違いがありますが、生理的pH値で培養するとほとんどの細菌が負電荷を帯びます[15、16]。細菌細胞の細胞表面電荷は、静電相互作用クロマトグラフィー（ESIC）によって特徴付けられています[17]。グラム陽性菌の細胞壁は主に、テイコ酸が埋め込まれたペプチドグリカンの厚い層で構成されています。一方、グラム陰性菌は、外面にリポ多糖の層があり、その後にペプチドグリカンの薄層が続きます。タイコ酸とリポ多糖は、細菌細胞の表面に負の電荷を与えます[18]。以前は、正に帯電した銀ナノ粒子（AgNP）は、 Eを含む微生物に対して顕著な効果を示しました。コリ [19]。彼らは、より小さな粒子がより大きな抗菌活性を持っていることがわかった。粒子が大きいほど、バクテリアの吸収性の利点が異なる可能性があると考えました。第一に、より大きな粒子は細胞の核含有量に到達しにくく、細菌に毒性を引き起こします。第二に、それらはより大きな表面積を提供し、したがってより強い細菌相互作用を提供することができます。そのため、バクテリアを捕獲するための「スポンジ」剤として、より大きな正に帯電したナノ粒子を設計して適用しました。

結論

結論として、PEI磁性ナノ粒子により、 Eを可能にする簡単で高速なアッセイを実証しました。コリ キャプチャして分析します。バクテリアの光学プロファイルとTEMプロファイルの既存のアーカイブにより、捕獲されたバクテリアを簡単に識別できます。正に帯電した磁性ナノ粒子によって提供される高い回収率により、超低濃度の他の細菌株の検出が可能になります。

略語

APTES：

3-アミノプロピルトリエトキシシラン

CFU：

コロニー形成単位

DLS：

動的光散乱

E。コリ ：

大腸菌

NP：

負に帯電した磁性ナノ粒子

NP +：

正に帯電した磁性ナノ粒子

NP：

ナノ粒子

PAA：

ポリアクリル酸

PEI：

ポリエチレンイミン

SD：

標準偏差

TEM：

透過型電子顕微鏡

TEOS：

オルトケイ酸テトラエチル

TRITC：

テトラメチルローダミン