DNA担体としてキトサン、N-アシル化キトサン、およびキトサンオリゴ糖を含む金ナノ粒子

背景

遺伝子治療は、さまざまな目的で遺伝物質を細胞に導入する方法、それらの間の遺伝病の治療として簡単に定義することができます[1]。遺伝子治療用のDNAベクターの2つの主要なタイプであるウイルス性と非ウイルス性の中で、最後の1つは、免疫原性がなく、コンプライアンスが良好で、非感染性[2]、保管中の安定性、および製造が容易であるという利点があります。一方、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターは、トランスフェクション率が高く、転写が速い場合でも、循環からの迅速なクリアランス、毒性、免疫原性、容量の低下などの欠点があります。大量の情報を運ぶため[3,4,5]。通常、非ウイルス性担体の場合、外来DNAはプラスミドにロードされ、コンジュゲートまたは複合体の形成を通じて保護および安定化されます。特に、キトサン（CO）は、高いトランスフェクション率と低い毒性を示し、細胞間輸送中に核酸からDNAを保護するため、非ウイルスDNAベクターの開発について研究されてきました[4]。自然界に広く存在するこのポリマー（甲殻類の殻の主成分として、また多くの真菌の細胞壁の一部として見られる[6]）は、キチン変換（2-アミノ-2-デオキシを取得）後に得られる多糖類です。 -β-D-グルコピラノース反復単位ですが、少量の2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコピラノース残基を保持しています[7]）（図1a）。天然キトサンの医療用途では、ほとんどの場合、ポリマーのいくつかの修飾が必要です。克服すべき主な欠点の中には、生理的pHへの不溶性と希酸溶液への高粘度があります[8]。一部の研究者は、細胞トランスフェクションのダイナミクスは車両のサイズと形状に依存することを指摘しています[1、8、9、10、11、12]。たとえば、Huoet。 al。これらの特性が金ナノ粒子の場合の浸透効率とどのように相関するかを報告しました[10]。

キトサンの溶解度は、鎖に残っているアセチル基の分布とアセチル化の程度を変えることで変更できます[13]。キトサンの物理的特性を制御するもう1つの方法は、アシル化です（図1b）。アミノ基の利用可能性とアセチル化の程度に応じて、キトサンのいくつかの生体相互作用を制御し、脂肪酸によるアシル化によって疎水性を高めることができます[7]。 Le Tienet。 al。 [7]は、医薬品の徐放性マトリックスに対するキトサンのN-アシル化を報告しています。 Bhattaraiet。 al。 [14]は、生理学的条件での用途向けにN-アシル化キトサン安定化金ナノ粒子を取得し、非アシル化キトサンの利点を示しています。キトサンのもう1つの有用な修飾は、ポリマー鎖の長さの短縮です（キトサンオリゴ糖、COS）[15]。キトサンから得られる多くの種類のCOSの特性の中で、粘度が低く、水への溶解度が高いことは、多くの用途に非常に役立ちます[16]。低分子量のキトサンは、主に鎖長が短く（2〜10 D-グルコサミン単位）（図1c）、遊離アミノ基があるため、細胞への取り込みが増加する可能性があることが報告されています[17、18、19]。さらに、還元剤としてキトサンオリゴ糖を使用した金ナノ粒子の合成には、有毒な試薬は含まれていません[20]。

a の化学構造 キトサン、 b アシル化キトサン、および c キトサンオリゴ糖

金ナノ粒子（AuNPs）は、新しい種類のナノ材料の開発につながり、その光学的特性と高い物理的安定性を利用して、いくつかのアプリケーションで非常に実行可能なオプションになりました[21、22、23、24、25]。これにより、密度が高くなり、取り込み時間が短縮されるため、リポ複合体やポリマーよりも細胞トランスフェクションが改善されます[12]。金はアミノとの親和性が高いため（-NH ₂ ）、シアノ（-CN）、およびチオール（-SH）官能基、多くの種類の官能化のための膨大な機会が開かれています[9、26]。カチオン性単分子層は、例えば、金ナノ粒子にカチオン性ポリマーを添加し、核酸相互作用と静電吸着を改善することによって得られます[27、28]。このように、キトサンと金を組み合わせたナノ複合体は、生物学的応用のために両方の材料を利用し[29、30、31、32、33]、DNAキャリア開発のための有望な材料を表します[5、10、12、14]。

とりわけ炭水化物、微生物、酵素、ビタミン、および生体高分子の使用を含む、AuNPを合成するための多種多様な生物学的方法があります[34]。いわゆるグリーン合成[35]の間に、還元剤および安定剤としてキトサンを使用するワンポット合成法の使用は、生物医学的用途に対してより調整可能で安全であることが証明されています[36、37]。従来の合成方法と同様に、ワンポット合成の場合、得られる粒子サイズは還元剤の濃度に依存します。このように、キトサンオリゴ糖の特定のケースでは、キトサンの分子量がナノ粒子のサイズと形状分布の重要な要素である、異なる粒子サイズを得るためにキトサン/金の比率を制御する必要があります。この研究は、同様のアプリケーションで報告されているものよりも低分子量である5 kDaキトサンオリゴ糖を用いたグリーン/ワンポット合成を含む、DNAトランスフェクション用のさまざまなキトサン-AuNPベースのナノ複合体の評価を目的としています[36、38]。

トランスフェクションテストは、HEK-293細胞株（ホモサピエンス）で実施されました。 （ヒト）-上皮形態-胎児腎臓-胎児）pSV-β-GalおよびpIRES2-EGFPプラスミドを使用。これらのテストは、細胞型に依存するトランスフェクション効率と細胞毒性に基づいて選択されました。 al。 [4]、トランスフェクションは、MG63および間葉系幹細胞と比較して細胞株HEK-293にとってより有利です。

メソッド

ナノコンポジット合成

各実験は、修飾キトサンと非修飾キトサンを含む金ナノ粒子を使用して実行されました。 2つの主要な合成方法が使用されました。1つは単純な形のキトサンを含む金ナノ粒子（CO-AuNPs）とアシル基を含む疎水性修飾キトサン（Acyl-CO-AuNPs）の化学合成を含み、もう1つはグリーン/ワン-短鎖キトサン（キトサンオリゴ糖、COS @ n-AuNPs）を使用したポット合成。図2は、各合成の概略図を示しています。対応する実験手順を以下に説明します。

各合成の概略図： a – b 単純な形のキトサン（CO-AuNPs）と、疎水的に修飾されたアシル基（Acyl-CO-AuNPs）および c を使用した金ナノ粒子の化学合成 – f 短鎖キトサン（キトサンオリゴ糖、COS @ n-AuNPs）のグリーン/ワンポット合成

資料

塩化金（III）三水和物（HAuCl ₄ ∙3H ₂ O）、水素化ホウ素ナトリウム（NaBH ₄ ）、低分子量キトサン（50-190 kDa、75％脱アセチル化度）、およびキトサンオリゴ糖（低分子量、5 kDa）はSigmaAldrichから入手しました。すべてのガラス器具を洗浄し、新たに調製した王水（HCl：HNO ₃ ）の浴に入れました。 、3：1 v / v ）24時間、使用前にMili-Q水で十分にすすいで、金属の痕跡をすべて取り除きます[39]。

キトサン-金ナノ粒子（CO-AuNPs）

キトサン-金ナノ粒子の合成は、Huanget。 al。 [9]の方法論。このために、20 mgの低分子量キトサン溶液（2 mg / ml）を10 mlの1％酢酸に加え、完全に溶解するまでボルテックスと混合し、一晩保存しました。得られた溶液2ミリリットルを0.22μmポリエーテルスルホンシリンジフィルターを使用してろ過し、1mlの10mM HAuCl ₄ と混合しました。 ∙3H ₂ 30分間強く攪拌することによるO溶液。 0.4mlの新たに調製した100mM NaBH ₄ 還元剤として冷溶液を使用した。攪拌しながら滴下して添加すると、黄色からワインレッドへの急速な色の変化が観察された。その後、合計2時間攪拌を続けました（図2a）。

アシル化キトサン-金ナノ粒子（Acyl-CO-AuNPs）

塩化カプロイル（C ₆ H ₁₁ ClO、Sigma Aldrich）は、アシル化キトサン-金ナノ粒子の合成に使用されました。

ゲル化

キトサン（低分子量）アシル化は、Remant Bahadur etal。によって報告された方法に従って実施されました。 [6]わずかな変更があります。このために、0.83gのキトサンを100mlの1％酢酸溶液にマグネチックスターラーで加え、24時間続けました。この溶液5ミリリットルを0.22μmポリエーテルスルホンシリンジフィルターでろ過し、激しく攪拌しながら0.1 M水酸化ナトリウム（NaOH）溶液をゆっくりと加えてpHを7.2に調整しました。この最後の溶液5mlに1ミリリットルの塩化カプロイルを加え、得られた混合物を5時間撹拌した。混合物のpHは、水酸化物溶液で6.8〜7に調整されました。得られたゲルをアセトンで沈殿させ、5000rpmで20分間4℃で遠心分離しました。過剰なカプロン酸は、メタノール（50〜60°C）で3回洗浄し、デカンテーションして、ストーブで3日間乾燥させることで除去しました。このゲルはナノコンポジット合成に使用されました。

ナノコンポジット

1ミリリットルの10mM HAuCl ₄ ∙3H ₂ 0.1 M HCl溶液で0.33％に希釈した2 mlのゲルにO溶液を加え、1時間撹拌しました。最後に、これに0.1 M NaBH ₄ の最後の0.4mlを追加します 攪拌しながら新たに調製した冷溶液では、2時間の連続攪拌が完了する前にピンク/赤色に変化する金ナノ粒子の形成が明らかでした（図2b）。

キトサンオリゴ糖-金ナノ粒子（COS @ n-AuNPs）

COS @ n-AuNPは、Manivasagan etalによって報告された修正された方法論に従って準備されました。 [20]。キトサンオリゴ糖（COS）を10mlのHAuCl ₄ に添加しました。 ∙3H ₂ O溶液を加え、80℃で60分間撹拌した。 COSの量（100および200 mg）とHAuCl ₄ 中の金の濃度を変化させることにより、4つの合成を実行しました。 ∙3H ₂ O溶液（0.003および0.017 wt％）。表1は、各実験のAuNP合成で使用されるパラメーターを示しています。金のナノ粒子の形成は、ワインレッド/ピンクレッドの色の変化で明らかであり、還元剤と金の前駆体の量に応じて、それぞれの場合で異なる時間に色の変化を記録しました。得られたナノコンポジットは、12,000 g で遠心分離して精製しました。 30分間（図2c–f）。

ナノコンポジットの特性評価

赤外線分光法

CO-AuNPに使用されるキトサン、Acyl-CO-AuNPにアシル化キトサン、一連のCOS @ n-AuNPにアシル化キトサンをFTIR分光法（Spectrum One、Perkin Elmer）で特性評価し、アシル-COポリマーのアシル化を確認しました。サンプル間の官能基からの特徴的なバンドの強度。 Remant Bahadur et。によると、置換度（SD）はIRスペクトル情報から推定されました。 al。 [6]。

ξ-可能性

Zetasizer（Nano Z、Malvern）を使用して、複合材料の表面電位を評価しました。 DNAへの接着を成功させて複合体を形成するナノコンポジットには、プラスの可能性が期待されます。 ξ- DNA接着後の変化を確認するために、複合体形成の前後に電位を評価しました。キャピラリーセル（DTS 1060、Malvern）を使用して、1.5mlの適切な希釈サンプルを表面電位測定に使用しました。

UV-Vis分光法

530 nm付近の表面プラズモン共鳴バンドによる金ナノ粒子形成の予備確認のために、400〜700 nmの範囲のUV-Visスペクトル（UV-1800 m、島津製作所）を取得しました。補足として、新たに調製されたナノコンポジットからのスペクトルを使用して、サンプルの光安定性を定性的に評価しました。これは、合成の150日後に同じサンプルから得られたスペクトルと比較し、表面プラズモン共鳴バンド周辺の変化を追跡し、メソッドごとに1つのサンプルを選択し、COS @ n-AuNPの最も代表的なものとしてCOS @ 2-AuNPを使用することによって行われました。シリーズ。石英セルをサンプルの容器として使用し、脱イオン水をブランクとして使用しました。

透過型電子顕微鏡（TEM）

形状および粒子サイズ分布の決定には、TEM顕微鏡法（JEM 1010、JEOL）を使用しました。 TEM画像の場合、ナノコンポジットサンプルは、formvarで覆われた200メッシュの銅グリッドサポート上に10μlの溶液を堆積させ、室温で15分間乾燥させることによって調製されました。 Matlab®ソフトウェアで開発された自家製の画像処理プログラムを使用して、サンプルごとに3つの画像を選択し、分析しました。

複雑な形成と接着の程度

Nanocomposite-pDNA

pSV-β-Gal（6.82 kb）およびpIRES2-EGFP（5.3 kb）（pDNA）は、形質転換されたDH5α Escherichia coli から分離されました。 。プラスミド精製は、MoBio®UltraCleanMicrobialDNA IsolationKitを使用したアルカリ溶解によって行いました。アガロースゲル電気泳動を使用して、高性能紫外線トランスイルミネーターを使用し、コダックゲルロジック100デジタルイメージングシステムで画像を取得して、プラスミドの構造的完全性を検証しました。プラスミドDNAの濃度と純度は、Gen5プログラムを使用したSynergy™2マルチ検出マイクロプレートリーダーで検証されました。複合体は、プラスミドDNA（pDNA）を、血清ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Sigma-Aldrich）を含まない各タイプの金キトサンナノ粒子ナノコンポジットと、200〜400ngのプラスミド量で混合することによって得られました。ナノコンポジットへのpDNAの接着は、0.8％のアガロースゲルと90Vの電圧を60分間使用した電気泳動によって評価されました。

キトサン-金ナノ粒子-HEK-293細胞へのpDNA複合体トランスフェクション

細胞培養

HEK-293 ホモサピエンス （ヒト）-上皮形態-胎児腎臓-胎児細胞を、ウシ胎児血清（SFB、Sigma-Aldrich）を含むダルベッコ改変イーグル培地で37°C、5％CO ₂ で培養しました。 -含有雰囲気。 pDNAトランスフェクションでは、HEK-293細胞を96ウェルプレートにウェルあたり12,000細胞で播種し、5％CO ₂ で37°Cで24時間インキュベートしました。 -大気を含み、90％のコンフルエンスが得られます。

pIRES2-EGFPによるトランスフェクション効率

In vitro pDNAナノコンポジットの機能化は、ウェルから細胞をかろうじて覆うまで培地を注ぎ、各ウェルに複合溶液（15μlのナノコンポジットと200 ngのDNA）を加え、同じ培養条件で2時間インキュベートすることによって行いました。その後、500μlの完全DMEMを添加して48時間インキュベートしました。 pIRES2-EGFPトランスフェクションは、蛍光顕微鏡（Axio Vert.A1、Carl Zeiss）によって直接評価されました。

pSV-β-Galによるトランスフェクション効率

X-gal組織化学を使用して、HEK-293細胞株でのpSV-β-Galプラスミド発現を改変することにより、β-ガラクトシダーゼ活性を評価しました。この方法では、トランスフェクトされた細胞は青色に変わりました。同じ培養条件で2時間インキュベートしながら、上記で説明したようにin vitropDNAナノコンポジットの機能化を行いました。その後、500μlの完全DMEMを加えて24時間培養し、培地を交換してさらに24時間培養しました。培養液を除去した後、ウェルを50μlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、次に細胞を2％ホルムアルデヒドと0.2％グルタルアルデヒドの混合物で5分間固定しました。その後、50μlのPBSで1回2回洗浄しました。定着液を除去した後、50μlのPBS 1xで2回洗浄し、次に0.4 mg / mlのX-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド、Sigma-Aldrich）の混合物で2回洗浄しました。 5 mMフェロシアン化カリウム（Meyer）および塩化マグネシウム2 mM（Meyer）中のPBS1x。次に、細胞を室温で24時間インキュベートしました。 β-ガラクトシダーゼの発現は、明視野顕微鏡（AE2000、Motic）で観察され、トランスフェクトされた細胞が青色に変わることを期待して、ウェルあたり5つの視野を×40の対物レンズで取得しました。トランスフェクション効率は、β-ガラクトシダーゼ発現（青色に変化）した細胞をフィールドあたりの総細胞数と比較することで評価しました。 LipofectAMINE ^TM 2000（30μl）をすべてのテストのポジティブコントロールとして使用しました。

色素排除法による細胞生存率

細胞継代の24時間後にマイクロカルチャーを使用しました。培地を除去し、細胞をPBSで1回洗浄した後、40μlの複合溶液を添加しました。その後、細胞を5％CO ₂ で37℃で2時間インキュベートしました。 -含有雰囲気。色素を排除するために、複合溶液を50μlのPBS 1xで細胞から洗浄し、20μlのトリパンブルー（PBS 1xで0.2％）を組み込みました。この最後の混合物で、細胞を37°Cおよび5％CO ₂ で10分間インキュベートしました。 -含有雰囲気。この最後のインキュベーション後、色素をウェルから除去し、50μlのPBS1xで2回洗浄することにより洗浄しました。細胞を明視野顕微鏡で観察し、視野あたりの総細胞数に対して青色に染色された細胞（死んだまたは損傷した）を数えました。細胞生存率試験は、0.1mMから3mMまでの水中のさまざまな複合体濃度、3mMでのCO-AuNPsおよびAcyl-COについて得られました。 COS @ 3-AuNPsおよびCOS @ 4-AuNPs、0.5 mM; COS @ 1-AuNPsおよびCOS @ 2-AuNPsの最低濃度（0.1 mM）。

ソフトウェア Image J （オープンソースソフトウェア （ OSS ）ライセンス ）プラグイン Nucleiをカウントするための画像ベースのツール-ICTN トランスフェクションおよび生存率テストのために細胞をカウントするために使用されました。

結果と考察

ナノコンポジットの合成と特性評価

この研究で合成された3種類の複合体の中で、COS @ n-AuNPは、水素化ホウ素ナトリウムや臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）などの有毒な試薬を使用せずに合成されたため、特に注目に値します。キトサンは、反応時間、温度、キトサンの脱アセチル化の程度とその分子量などの複数の要因に応じて、AuNP複合体を望ましいサイズと形状で合成するための還元および安定剤および最適濃度として適していることが報告されています[38 、40]。この考慮事項の下で、キトサンの分子量は、HAuCl ₄ を使用して、4つのCOS @ n-AuNP合成で5kDaで一定に保たれました。 ∙3H ₂ 異なる濃度のOおよびキトサン溶液。

図3は、この作業で合成されたAuNPs-キトサンナノコンポジットからのUV-Vis吸収スペクトルを示しています。キトサン（CO-AuNPs）では534 nm、アシル化キトサン（Acyl-CO-AuNPs）では507 nm、さまざまなキトサンオリゴ糖では533 nm（COS @ 1-AuNPs）、530 nm（COS @ 2）を中心とするプラズモンバンド-AuNPs）、535 nm（COS @ 3-AuNPs）、および536 nm（COS @ 4-AuNPs）は、金ナノ粒子の存在を確認します。この図の挿入図は、得られたナノコンポジットの写真を示しています。色は、ナノ粒子の濃度、サイズ、形状、および表面の機能化によって異なります。

ナノコンポジットのUV-Visスペクトル。挿入図の値は、局在表面プラズモン共鳴の最大波長に対応しています。これらの最大値は次のとおりです。534nmでのCO-AuNPの場合（0.1 M NaBH ₄ ）（ a ）、507 nmのアシル-CO-AuNPの場合（ b ）、およびCOS- @ n-AuNPキトサンオリゴ糖（533、530、535、536 nm）の場合、それぞれ1〜4の異なる厚さのナノコンポジット調製物（ c ） ）

ナノコンポジットの安定性

図4は、新たに合成されたナノコンポジットからのUV-Vis吸収スペクトルと合成後150日との比較を示しています。観察できるように、各ケースの2つのスペクトルは本質的に同じままであり、共鳴バンドの最大値の有意なシフトはなく、追加のピークの証拠もありません。これらの結果は、得られたナノコンポジットの高い安定性を定性的に示唆しています。

合成の150日後に得られたUV-Vis吸収スペクトルによる金ナノ粒子ナノコンポジットの安定性：化学合成されたCO-AuNP（ a ）およびアシル-CO-AuNP（ b ）およびCOS @ 2-AuNPのグリーン/ワンポット合成（ c ）

3つの異なるキトサンサンプルの赤外線分光法を図5に示します。この手法は、赤外線（IR）領域内の吸収帯（化学構造の特性）をIRと比較することにより、アシル化キトサンの識別に使用されました。データベース。いくつかの特徴的なIRバンドは、指摘する価値があります。1656cm ^-1 のキトサン（50〜190 kDa、75％の脱アセチル化度）バンド 、1593 cm ^-1 、および1373 cm ^-1 アミド基に対応します（それぞれ、アミドI、II、およびIII）。 2895 cm ^-1 のバンド C-H結合に対応し、3200〜3500 cm ^-1 の結合に対応します。 N-HおよびO-H結合に。アシル化キトサンの場合、1651 cm ^-1 でIRバンドが得られました。 、1591 cm ^-1 、および1369 cm ^-1 アミド基（それぞれアミドI、II、III）に対応し、3200〜3500 cm ^-1 内の基に対応します。 N-HおよびO-H結合に対応します。キトサンのアシル化は、IR分光法データ[7]に従って確認されました：1591 cm ^-1 のバンド アシル化キトサン上の二級アミドの数が多いため、天然キトサンと比較してアシル化キトサンの方が低かった。 3200〜3500 cm ^-1 内のバンド 、天然キトサンのN-HおよびO-H振動に特徴的な、アシル化キトサンおよびキトサンオリゴ糖では、一次アミド還元により消失します。

キトサン、アシルキトサン、およびキトサンオリゴ糖のFT-IRスペクトル。 1591 cm ^-1 のバンド 二級アミドに対応します。 3200–3500 cm ⁻¹¹ 領域はN-HおよびO-H振動に対応します

Bahadur et al。によれば、アシル化キトサンの置換度が推定された。 al。 [6]、次の式で：

ここで A ₁₆₅₁ =1.973965および A ₃₃₅₀ =1.977278は、1631 cm ^-1 でのアシル化キトサンの吸光度（それぞれ、アミドIおよびOH振動の場合）に対応します。 および3350cm ^-1 、それぞれ、0.25は遊離アミンのグループに対応します。 75％のN-アシル化度が得られました。

ξの可能性

ξ-電位値は、各複合材料について次のように取得されました（表2、列「ξ-電位」）：43.3 mV（CO-AuNPs）、40.2 mV（Acyl-CO-AuNPs）、52.2 mV（COS @ 1-AuNPs） 、55.3 mV（COS @ 2-AuNPs）、51.6 mV（COS @ 3-AuNPs）、および46.3 mV（COS @ 4-AuNPs）。静電力によるDNA複合体形成を達成するために計画されたキトサンからのアミン基により、すべてのナノコンポジットの可能性は正でした。複合体形成後、ξ-電位値の低下により、DNAの接着が成功したことが確認されました（表2、列「ξ-電位/ DNA」）。

透過型電子顕微鏡（TEM）

図6は、各ナノコンポジットの代表的なTEM顕微鏡写真と、サイズ分布計算用のナノ粒子サイズのヒストグラムを示しています。各ナノコンポジットのサイズ分布は次のように取得されました。各サンプルの3つのTEM画像が取得され、Matlab®で開発された自家製の画像処理ソフトウェアで分析されました。ナノ粒子数はAcyl-CO-AuNPで500、CO-AuNPで1000でした。 、およびCOS @ n-AuNPシリーズの場合は100。各サンプルの平均サイズは、表2の「平均TEM直径（nm）」の列にまとめられています。キトサンオリゴ糖で合成されたAuNPは球状になり、文献で報告されている他のグリーン合成方法で得られた同様のものと比較して、サイズ分布が良好であることを指摘する価値があります[36、38、41、42、43]。

a のTEM顕微鏡写真 4.7 nmのアシル化キトサンAuNP、 b 3.5 nmキトサンAuNP（0.1 M NaBH ₄ ）、 c 7.4 nmオリゴ糖キトサンAuNP（COS @ 1）、 d 15.6 nmオリゴ糖キトサンAuNP（COS @ 2）、 e 10 nmオリゴ糖キトサンAuNP（COS @ 3）、および f 14 nmオリゴ糖キトサンAuNP（COS @ 4）

複合体の形成と接着の程度：ナノコンポジット-pDNA

すべてのpDNA複合体と純粋なDNAのエレクトロフェログラムを、さまざまな濃度のプラスミドを使用して実行しました。結果を図7に示します。図7aは、純粋なプラスミドと、200および300ngのプラスミドを含むすべての複合体に対応するエレクトロフェログラムを示しています。これらのエレクトロフェログラムのナノコンポジットサンプルの分布は次のとおりです。レーン1および2のアシル-CO-AuNP（300および200 ng）、レーン3のCO-AuNP（300 ng）、COS @ 1-AuNP（300および200 ng） 4および5でCOS @ 2-AuNP（300および200 ng）6および7でCOS @ 3-AuNP（300および200 ng）8および9でCOS @ 4-AuNP（300および200 ng）10 11、レーン12に300 ngの純粋なpDNA。すべてのテストで、10μlの複雑な溶液を使用しました。この図は、pDNAのみがゲル内を移動し（レーン12で明らかなように）、他のpDNA複合体が対応するウェルに残っていることを示しており、この方法ですべての複合体へのpDNAの接着が確認されます。これは、金ナノ粒子表面に残っているキトサンのアミノ基の正電荷と、DNAヘリックスのリン酸基の負電荷の相互作用によるものです。

a pDNA濃度が200および300ngのナノ複合体のエレクトロフェログラム。レーン12は純粋なpDNAに対応します。 b レーン3に300ngのpDNA、純粋なpDNAを含むCO-AuNPおよびAcyl-CO-AuNP。 c COS @ 2-AuNPsナノコンプレックスと300および350ngのDNA、レーン3に400ngの純粋なpDNA。 d same CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs at 1:10 dilution, with respectively pure DNA control at lane 3

To evaluate the retention ability of COS@2 complexes, eletropherograms for the corresponding pDNA complex were carried out with the same COS@2 concentration but different pDNA concentrations (300 ng, 350 ng, and 400 ng); the results are shown in Fig. 7b. Lanes 1, 2, and 3 on this figure correspond to plasmid concentration of 300 ng, 350 ng, and 400 ng, respectively; results in lane 1 is in perfect agreement with the corresponding result in Fig. 7a (lane 7) and, both results in lane 2 and 3 of Fig. 7b, indicate that retention power of this complex is below 350 ng of the plasmid.

Chitosan-Gold Nanoparticle-pDNA Complex Transfection into HEK-293 Cells

As it was pointed out before, two different tests were made in order to evaluate pDNA transfection, taking advantage of the X-galactosidase activity of the pSV-β-Gal plasmid and the fluorescence activity for the case of the piRES2-EGFP plasmid. Figure 8 shows the micrographs of transfection test in HEK-293 cells by X-galactosidase activity on pSV-β-Gal; blue cells in this figure (pointed out by arrows) are some of the transfected cells, according to the corresponding methodology. On the other hand, Fig. 9 shows the fluorescence micrographs of transfected HEK-293 cells; this technique was used to evaluate transfection efficiency with pIRES2-EGFP plasmid. For both figures, (a) shows pure cells and (b) shows cells using LipofectAMINE ^TM 2000 as a positive control. Corresponding transfections rates with each conjugate are shown as follows:(c) CO-AuNP, (d) Acyl-CO-AuNPs, (e) COS@1-AuNPs, (f) COS@2-AuNPs, (g) COS@3-AuNPs, and (h) COS@4-AuNPs. Transfection efficiency percentages obtained with the different complexes were as follows:CO-AuNP 27%, Acyl-CO-AuNP 33%, COS@1-AuNP 48%, COS@2-AuNP 60%, COS@3-AuNP 45%, and COS@4-AuNP 52%. Figure 10 shows the histograms for the transfection percentages obtained with each complex. Transfection efficiency was evaluated by comparing cells presenting pDNA expression against total cells per well. The highest transfection efficiencies were obtained with conjugates from COS@2-AuNP complexes; this can be explained by the highest chitosan/gold ratios used for this green method of synthesis. These results may complement those reported by Köping-Höggård et. al。 [40], which suggests that the use of DNA conjugates with chitosan oligomers of different length affects the stability and transfection efficiency. The present work deserves additional consideration since the transfection efficiencies were improved in this case using low molecular weight chitosan oligosaccharides complexed with gold nanoparticles.

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pSV-β-Gal). a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pIRES2-EGFP).a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

Transfection efficiency percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293-transfected cells

Dye Exclusion Test

Figure 11 (inset) shows the micrographs for cell viability evaluation. Blue dyed cells (dead or damaged) were compared against total cells per field. The highest cell viability was obtained with COS@1-AuNPs and COS@2-AuNPs, with 93.53% and 93.46%, respectively. It is interesting to note that COS@2-AuNPs also showed the best transfection efficiency. Among COS@n-AuNP series, COS@4-AuNPs showed lower viability (78.23%). As expected, tests with LipofectAMINE ^TM 2000 and CO-AuNPs presented the lowest viability (61.45% and 77.85% respectively). Finally, viabilities with Acyl-CO and COS@3-AuNPs were 90.75% and 92.08 % respectively.

Cell viability percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293 cells

Conclusions

Chitosan, acylated chitosan, and chitosan oligosaccharide nanocomposites with gold nanoparticles, featuring positive charges, were synthesized. They presented good stability in colloidal solution; this confirms the viable use of chitosan as a stabilizer and chitosan oligosaccharide as both reducing agent and stabilizer, and positive charges by its amino groups improved affinity with plasmid DNA. Size distributions of the synthesized gold nanoparticles were in a range of 3 to 15 nm. Gel electrophoresis and ξ-potential studies showed that plasmid DNA was successfully incorporated to the nanoparticles by interaction with the positive charges from chitosan at the surface of the nanocomposites. The best transfection efficiency, with 93.46% viability, was obtained with the COS@2-AuNP complexes, possibly due to its relatively high chitosan/gold ratio (1.96/0.003); this means larger effective surface for the anchoring of the plasmids by means of the electrostatic interaction of its phosphate groups with the chitosan amine functional groups. The COS@n-AuNP complexes obtained by the green/one-pot synthesis described in this work showed high transfection efficiency, as compared with those obtained with traditional chemical synthesis (CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs), and can be proposed as promising green route-synthesized pDNA vehicles without the inconvenience of using toxic chemical reagents. Moreover, chitosan oligosaccharide as a reducing agent can be considered as a green synthesis method for AuNPs and renders spherical nanoparticles with good size distribution. This kind of safe and non-toxic routes of synthesis for nanocomplexes, like the ones proposed in this work, deserve further research in the search of obtaining more safe plasmid carriers for gene therapy applications.

データと資料の可用性

All datasets on which the conclusions of the manuscript rely are presented in the main paper.

略語

Acyl-CO:

Acylated chitosan

AuNPs：

金ナノ粒子

CO:

キトサン

COS:

Chitosan oligosaccharide

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

FTIR：

フーリエ変換赤外

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

pDNA:

Plasmid Deoxyribonucleic acid

TEM：

透過型電子顕微鏡