ビオチン修飾・酸化還元応答性キトサンオリゴ糖ナノ粒子にフィコシアニンをコーティングした標的型クルクミン送達システム

概要

本研究では、クルクミン（CUR）の生体適合性を高めるため、フィコシアニン（PC）で機能化し、クルクミンを担持したビオチン-キトサンオリゴ糖-ジチオジプロピオン酸-クルクミン（BCSC）ナノ粒子（CUR-BCSC@PCs）を設計しました。BCSCの構造は¹H-NMRで確認されました。平均流体動力学直径160.3±9.0 nmのCUR-BCSC@PCsでは、生体模倣タンパク質コロナがナノ粒子に優れた安定性と血液循環中のタンパク質吸着回避能を付与しました。インビトロ放出実験により、酸化還元応答性シェルを持つCUR-BCSC@PCsが高濃度グルタチオンに感受性を示すことが検証されました。さらに、CUR-BCSC@PCsはA549細胞へのCUR取り込みを促進し、増殖抑制活性を高めました。これらの結果は、CUR-BCSC@PCsが効果的な薬物送達キャリアとしてがん治療への応用展望が大きいことを示唆しています。

背景

キトサンオリゴ糖（COS）は、β-(1→4)結合したD-グルコサミン構造を持ち、節足動物の外骨格や菌類の細胞壁由来のキチン・キトサンを脱アセチル化・酵素分解して得られる重合分解産物です。キトサンおよびその誘導体は重金属や染料の吸着剤として機能し、COSには抗がん、抗炎症、抗酸化、免疫賦活などの生物学的特性があることが報告されています。生体適合性、高水溶性、化学修飾の容易さから、COSは無毒な薬物送達キャリア材料として注目されています。

疎水性抗がん剤の溶解性向上と正常組織への毒性低減のため、自己集合してミセルを形成する両親媒性ブロック共重合体の研究が進められてきました。ミセルは疎水性薬物を内包するコアと、薬物動態を制御する外殻（コロナ）で構成されます。王らはデオキシコール酸をCOS鎖にグラフトし、低コスト有機溶媒で自己集合するミセルを作製し、ケルセチンを内包させて水溶性とバイオアベイラビリティを向上させました。

クルクミン（CUR）はウコンの主要成分で、多様なシグナル経路を介して腫瘍細胞増殖を抑制し、免疫系を賦活する抗がん特性が確認されています。また光感受性物質として光線力学療法（PDT）への応用も期待されています。しかし、溶解性・安定性・バイオアベイラビリティの低さが臨床応用の障壁となっています。これを克服するため、陳らは二重pH感受性キャリアを開発し、CURの水溶性と抗腫瘍効果を改善しました。

フィコシアニン（PC）はシアノバクテリア由来の水溶性光捕集色素タンパク質で、抗がん・抗炎症・抗酸化作用を持ち、食品・医薬分野で注目されています。PCは非小細胞肺がん細胞の増殖をTIRAPダウンレギュレーションで抑制し、副作用のないPDT薬剤としても利用されています。PCを蛍光プローブとして用いるには、ビオチン、抗体、ストレプトアビジンなどの特定認識要素との結合が必要です。ビオチンは水溶性ビタミンで腫瘍標的性を持ち、その受容体タンパク質（アビジン、ニュートラビジン、ストレプトアビジン）は多くのがん細胞表面で過剰発現しています。したがって、ビオチン修飾ナノ粒子は受容体媒介性エンドサイトーシスによる薬物送達として広く研究されています。

本研究では、PC機能化ナノキャリアを新規に構築し、CUR-BCSC@PCsの調製過程を図1に示します。COSとCUR間のジスルフィド結合がキャリアに還元感受性を付与します。CURはCOS/PCシェルに保護された疎水性コアに位置します。ビオチンとPCの相互作用、および陽性帯電COSと陰性帯電PCの静電相互作用を利用して、CUR-BCSCs表面にPCを修飾しました。CUR-BCSC@PCsは透過性向上、EPR効果、ビオチン受容体標的効果により腫瘍組織へ到達すると期待されます。腫瘍微小環境では正常細胞よりグルタチオン濃度が高く、チオール-ジスルフィド交換反応でCUR-BCSC@PCsが分解し、高濃度の薬物を腫瘍細胞内に放出します。本ナノ送達システムはCURのバイオアベイラビリティを向上させ、臨床的腫瘍治療への有効性が期待されます。

材料と方法

材料

CURはZhanyun Chemical Co.（上海）、COSは山東維康生物医薬科技（山東）、PCは浙江浜美生物技術（浙江）、3,3'-ジチオジプロピオン酸はAdamas Reagent（上海）、EDCI、DMAP、THF、シュウ酸クロリド、ビオチンはAladdin Chemistry、L-グルタチオンとHoechst 33342はSigma-Aldrich（上海）、透析バッグ（MWCO 300 Da）は北京Biotopped Technology、ホルムアミドは天津福宇精細化学、脱イオン水は自作を使用しました。

A549細胞株（ヒト肺癌細胞）（Bena Culture Collection、北京）を細胞毒性評価に用いました。培地はDMEM（賽爾西生物技術、山東煙台）、胎児牛血清（FBS）はHyclone（米国ユタ州）、ペニシリン・ストレプトマイシンとMTTはSigma-Aldrich（上海）製です。

CUR-BCSC@PCsの合成

合成ルートを図2に示します。詳細手順は以下の通りです。

COS-S-S-CURの合成

3,3'-ジチオジプロピオン酸を酸クロリド触媒でエステル化し、2段階反応でCOSに導入しました。

工程1：3,3'-ジチオジプロピオン酸（42.05 mg, 0.25 mmol）と無水THF（4 mL）を褐色丸底フラスクに入れ、撹拌溶解後、THFで希釈したシュウ酸クロリド（0.3 mmol）を氷冷下で添加。35℃で3時間撹拌後、未反応シュウ酸クロリドをロータリー蒸発で除去し、生成物1を得ました。CURをTHF（3 mL）とトリエチルアミン（34 μL）を含む溶液に溶解し、氷冷下で生成物1に滴下添加後15分撹拌、さらに窒素気流下50℃で6時間撹拌。トリエチルアミンとTHFをロータリー蒸留で除去し、カラムクロマトグラフィーで精製してHOOC-S-S-CURを得ました。

工程2：HOOC-S-S-CURをEDCI（1.2当量）とDMAP（1.2当量）でホルムアミド中2時間活性化。ホルムアミド（4 mL）に溶解したCOSを添加し、55℃で12時間撹拌。反応後、透析バッグ（MWCO 300 Da）で透析し、凍結乾燥（12時間）しました。

BCSCとビオチン-COSの合成

ビオチン、EDCI、DMAPをホルムアミド（3 mL）に溶解し、褐色丸底フラスクに移し、30℃で2時間撹拌。COS-S-S-CURをホルムアミド（3 mL）に溶解し滴下添加、45℃で2日間反応。生成物を透析（MWCO 300 Da、脱イオン水）、遠心分離、凍結乾燥して酸化還元感受性BCSCを得ました。ビオチン-COSも同法で合成しました。

¹H-NMR（DMSO-d₆/D₂O混合溶媒）でCOS-S-S-CUR、BCSC、ビオチン-COSを測定しました。

CUR担持BCSCミセル（CUR-BCSCs）の調製

自己集合法で調製。BCSC 10 mgをホルムアミド4 mLに溶解し、CUR溶液（1 mg/mL、ホルムアミド）1 mLと混合。透析バッグ（MWCO 300 Da）で脱イオン水中24時間透析（水は2時間ごと交換）。ミリポア膜（800, 450, 220 nm）でろ過しました。

CUR-BCSC@PCsの調製

調製したCUR-BCSCsをPC水溶液（1.0 mg/mL）と混合し、4℃で30分インキュベート。100 kDa遠心フィルターでPCを除去し、水で3回洗浄。最終生成物（CUR-BCSC@PC）を遮光下4℃で保存しました。

特性評価

動的光散乱（DLS、Particle Analyzer Delsa Nano C、Beckman Coulter）で粒子径、ゼータ電位、分散指数（PI）を測定。透過型電子顕微鏡（TEM、H-600、日立）でCUR-BCSCsとCUR-BCSC@PCsの形態を観察しました。

包接効率（EE）と薬物担持量（DL）

HPLC（Agilent 1260GB12C）で測定。CUR-BCSCsまたはCUR-BCSC@PCs 2 mLにアセトニトリル3 mLを加え超音波脱乳化、アセトニトリルで10 mLに調整。フェノメネックスC18カラム（250×4.6 mm, 5 μm）、カラム温度25℃、流速1.0 mL/min、移動相0.5%酢酸/アセトニトリル=40:60（v/v）、検出波長425 nm、注入量20 μLで測定。以下の式でEEとDLを算出：

EE% = （ナノ粒子中のCUR重量 / 供給CUR重量）× 100%

DL% = （ナノ粒子中のCUR質量 / ナノ粒子質量）× 100%

インビトロ安定性試験

GSH（0, 20 μM, 10 mM）を含むPBSを調製し、CUR-BCSC@PCsを37℃で4時間処理して粒子径変化を観察。また、PBS中でのCUR-BCSC@PCsの流体動力学直径を37℃で経時的（4, 8, 12, 24時間）に測定しました。

インビトロCUR放出試験

透析法で実施。GSH（20 μM, 1, 5, 10 mM）を含むPBSに0.5% Tween 80を添加。50 mL遠心チューブに放出培地45 mLを入れ、CUR-BCSC@PCs 1 mLを含む透析バッグを浸漬、37℃で振盪。所定時間（0.2, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72時間）に2 mL回収し、同種の新鮮培地を補充。HPLCでCUR濃度を測定しました。

細胞培養

A549細胞を10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン含有DMEMで培養、37℃、5% CO₂条件下で維持。

インビトロ細胞増殖抑制試験

MTT法でフリーCUR、BCSCミセル、CUR-BCSCs、CUR-BCSC@PCsのA549細胞に対する細胞毒性を評価。96ウェルプレートに5000細胞/ウェル播種、24時間接着後、培地を交換し、各製剤（CUR換算で0.1, 1, 5, 10, 15, 20 μg/mL）含有培地100 μLを添加、24時間培養。未処理をブランク対照とし、MTT溶液（5 mg/mL）20 μL添加後4時間インキュベート、DMSO 150 μLでホルマザンを溶解、570 nmで吸光度測定。

インビトロ細胞取り込みと局在

蛍光顕微鏡（Eclipse E400、ニコン）で観察。24ウェルプレートに4×10⁴細胞/ウェル播種、CUR-BCSCsとCUR-BCSC@PCs（CUR濃度20 μg/mL）を共培養（1, 2, 4時間）。PBSで3回洗浄後、4%パラホルムアルデヒドPBSで20分固定、再度PBS洗浄。Hoechst 33342で核染色（15分）し、倒立蛍光顕微鏡で観察。

統計解析

全実験を3回以上繰り返し、平均±SDで表示。Studentのt検定で解析、p<0.05を有意、p<0.01を高度に有意としました。

結果と考察

COS、COS-S-S-CUR、ビオチン-COS、BCSCの特性評価

¹H-NMRスペクトルでCOS-S-S-CURにはCURとCH₂-S-S-CH₂の特徴的共鳴が現れ、COS鎖へのCUR結合が確認されました。COS（図3A）と比較して、COS-S-S-CUR（図3B）では6.7-7.5 ppmおよび3.75 ppm（-OCH₃）にCUR由来シグナル、2.5 ppmにCH₂-S-S-CH₂共鳴が観察されました。ビオチン-COS（図3C）では0.99 ppm（-CH₂–）と3.39 ppm（-CH-S-）にビオチン由来ピークが出現。BCSC（図3D）ではCUR共鳴（a, e）、CH₂-S-S-CH₂（b, 2.5 ppm）、ビオチン由来シグナル（c, d, 0.09と3.39 ppm）が確認され、両親媒性物質BCSCの合成成功が裏付けられました。

CUR-BCSCsとCUR-BCSC@PCsの特性評価

TEM観察（図4A, B）では、CUR-BCSCsは滑らかな球状（図4Aa）、CUR-BCSC@PCsは周囲に開花層を持つ準球状（図4Bb）で、PCがCUR-BCSCs表面を覆いタンパク質コロナ構造を形成していることが示唆されました。明確なチンダル現象（図4C）から豊富なナノ粒子存在が確認されました。粒子径、PI、ゼータ電位、DL%、EE%を表1にまとめました。図5に示す通り、CUR-BCSCsとCUR-BCSC@PCsの平均径はそれぞれ97.8±4.2 nmと160.3±9.0 nm、PIは0.181±0.014と0.114±0.024（ともに0.2未満で均一）。ゼータ電位はそれぞれ21.57±0.53 mVと12.90±1.93 mVで、陰性帯電PCコーティングによりCUR-BCSC@PCsの方が低くなりました。EEはCUR-BCSC@PCsの方が高値を示しました。

CUR-BCSC@PCsの安定性

図6aの通り、PBS中10 mM GSHではジスルフィド結合が切断され、CUR-BCSC@PCsがポリマー断片に分解・凝集して粒子径が増大。一方、20 μM GSHではGSH無添加PBSと同様に粒子径変化は微小でした。図6bの経時測定では、PBS中でCUR-BCSC@PCsの粒子径が緩やかに増大することが確認されました。

CUR-BCSC@PCsの還元応答性

ジスルフィド結合は腫瘍の還元環境で不安定になることが知られています。インビトロ薬物放出試験でCUR-BCSC@PCsの期待される放出特性を検証しました。図7に示す通り、細胞外環境を模倣した20 μM GSH（pH 7.4）ではCUR放出は極めて緩やかでしたが、10 mM GSH（pH 7.4）では顕著に促進されました。1, 5, 10 mM GSHでは20 μM GSHと有意差があり、GSH濃度上昇に伴いCUR放出が促進されることから、薬物放出がGSH濃度に応答することが確認されました。

インビトロ細胞毒性

MTT法でフリーCUR、BCSCs、CUR-BCSCs、CUR-BCSC@PCsのA549細胞に対する細胞毒性を評価（図8）。全製剤で用量依存的な増殖抑制を示しました。24時間培養後、フリーCURの抑制能はCUR-BCSC@PCsとCUR-BCSCsよりやや低く、CUR-BCSC@PCsがBCSCsおよびCUR-BCSCsより高い抗がん活性を示しました。これは優れた細胞取り込みによるものと考えられます。また、CUR-BCSC@PCsはCUR-BCSCsより高い細胞毒性を示し、PC自体がA549細胞増殖抑制効果を持つ可能性が示唆されました。

インビトロ細胞取り込み試験

図9aに示す通り、CUR-BCSCsとCUR-BCSC@PCs（CUR 20 μg/mL）ともにA549細胞への取り込みが時間依存的に観察されました。がん細胞表面のビオチン受容体過剰発現により、ビオチン担持ミセルはA549細胞への親和性を持ちます。4時間時点でCUR-BCSC@PCsの蛍光シグナルが最も強く、高い取り込み率を示しました。図9bでは、1時間群で細胞質に緑色蛍光、4時間群で核内への蛍光移行が見られ、カベオラ媒介性エンドサイトーシスによる取り込みが示唆されました。

結論

本研究では、縮合反応、自己集合、PCとCUR-BCSCsの相互作用を通じてタンパク質機能化COSナノ粒子を調製しました。酸化還元感受性両親媒性キャリア（BCSC）が合成され、¹H-NMRで確認されました。CUR-BCSCs表面はフィコシアニンコロナで修飾され、細胞取り込み効率向上と血漿タンパク質吸着からの保護を実現しました。細胞毒性と取り込み解析により、CUR-BCSC@PCsがA549細胞へCURを輸送し、優れた抗増殖特性を持つことが確認されました。PCとCURのPDT効果を考慮し、次段階では光照射下での光力学特性と抗がん活性を評価予定です。本研究は抗がん剤効力向上と機能的タンパク質コロナ導入の道を開き、多機能COSベースのナノ医薬キャリアであるCUR-BCSC@PCsが腫瘍治療の新戦略となり、大きな応用展望を示すものです。