ブファリンをロードしたPEG化リポソーム：抗腫瘍効果、急性毒性、および組織分布

はじめに

Venenum Bufonis から抽出されたブファリン（BF;3β、14-ジヒドロキシ-5β、20（22）-ブファジエノライド、5β、20（22）-ブファジエノライド-3β、14-ジオール） 、抗炎症、強心、抗ウイルス、アセソジン、および抗腫瘍活性があります[1、2]。私たちのグループはまた、BFが肝細胞癌、黒色腫、結腸癌、神経膠腫、および上皮性卵巣癌に対して治療効果があることを明らかにしました。これは、細胞増殖の阻害および細胞アポトーシスの誘導に起因する可能性があります[3,4,5,6,7]。 。

Lan etal。 [8]以前にヌードマウスで神経膠腫異種移植モデルを確立し、腹腔内（i.p 。を介してBFを毎日投与した。 ） 注入。 BF治療群では、二核核と有糸分裂はほとんど観察されませんでした。さらに、核小体はより小さく、細胞形態は対照群よりも規則的でした。 BFには多くの潜在的な薬理効果があり、これまでに得られた結果は有望ですが、単剤としてのBFはまだ臨床応用にはほど遠いです。さらに、BF治療は、免疫反応、正常組織の損傷、高毒性などの望ましくない副作用や副作用を伴います[9]。

脂質エマルジョン、ナノ粒子、リポソームなどのいくつかのドラッグデリバリーシステムは、BFの溶解性、薬理学的活性、およびバイオアベイラビリティを促進するために採用されてきました[10、11]。さらに、凝集誘導放出（AIE）活性機能性高分子自己組織化は、生物学的イメージングや細胞内薬物送達を含むさまざまな生物医学的応用に大きな可能性を示しています[12、13]。これらの薬物送達システムの中で、リポソーム調製物は、静脈内（i.v.）送達システムとして使用するためのいくつかの利点を有する。リポソーム製剤は、水溶性を改善し、負荷された薬剤の副作用を軽減するだけでなく[14]、脳腫瘍をより効果的かつ効率的に治療するために、血液脳関門（BBB）を越えて薬剤を運ぶことができます[15]。 。 BBBは、脳の毛細血管内皮細胞とそれらの間の密着結合、星型細胞、グリア細胞、および基底膜で構成されており、脂溶性の高い薬物のみが脳組織を通過して分散することができます[16]。それにもかかわらず、リポソーム調製物にはいくつかの欠点がある。血漿タンパク質による吸収と単核食細胞系による認識は、ロードされた薬物の血液からの急速なクリアランスを引き起こします。しかし、PEGによるリポソームの表面修飾はこれらの問題を解決する可能性があります[17]。

以前の研究では、上記の課題を克服し、薬物送達の有効性を高め、毒性を低減するために、ブファリンをロードしたPEG化リポソーム（BF / PEG-LP）を調製し、その細胞毒性と薬物動態プロファイルを含めて同じ特性を示しました。その研究を拡張するために、BF / PEG-LPの物理的および化学的特性、抗腫瘍効果、急性毒性、および組織分布プロファイルをさらに評価しました。

材料と方法

化学薬品および試薬

BFおよびシノブファギン（CBG）は、BaoJi Chenguang Technology Development Co.、Ltd。（BaoJi、China;純度98％、HPLCで同定）から購入し、DMSOに溶解して、-20°Cでストック溶液として保存しました。内部標準（IS）としてCBGを使用しました。ドキソルビシン（DOX）は、Beijing Solarbio Science＆Technology Co.、Ltd。（北京、中国、純度98％、HPLCで同定）から購入し、DMSOに溶解して、-20°Cでストック溶液として保存しました。 BF / PEG-LPは私たちの研究室で調製されました（粒子サイズ、155.0±8.46 nm;ゼータ電位–18.5±4.49mV;捕捉効率、76.31％±4.23％、HPLCで検出）[6]。 HPLCグレードのギ酸はTediaCompany Inc.（Fairfield、OH、USA）から購入しました。細胞計数キット-8（CCK-8）は、同仁堂研究所（熊本県）から購入しました。 HPLCグレードの酢酸エチルはTianjinKermel Chemical Reagents Development Center（Tianjin、China）から購入しました。 HPLCグレードのアセトニトリルはMerck（ダルムシュタット、ドイツ）から購入しました。他のすべての試薬は分析グレードでした。

動物

オスのSprague-Dawleyラット、体重は約230〜250g。昆明マウス、体重18〜22 g; 6週齢の裸のBalb / cマウスは、第4軍事医科大学（中国、西安）の実験動物研究センターから提供されました。動物は個別に換気されたケージ（IVC）システムで別々に飼育され、標準的な実験用餌と水を5日間自由に与えられました。実験前にすべての動物（水を除く）を一晩絶食させた。動物を含む実験手順は、第4軍事医科大学の施設内動物管理使用委員会によってレビューおよび承認されました（承認2017-0603-R）。

標準サンプルの準備

検量線は、100μLの組織ホモジネートに各20μLの作業溶液をスパイクして、20、50、200、500、および2000 ng / mLのBFを含むサンプルを生成することによって作成されました。スパイクされた標準ホモジネートサンプルは事前に準備され、未知のサンプルの各分析バッチで評価されました。

リポソームの安全性

RBC溶血テスト

ラットから8ミリリットルの血液を採取し、続いてヘパリン化し、10 mLの0.9％生理食塩水で希釈しました。次に、全血サンプルを100μLのBF溶液または1mLのBF / PEG-LP懸濁液と混合しました。 37°Cに維持されたウォーターバスに40分間浸漬した後、サンプルを750 g で遠心分離しました。 RBCとその断片を除去するために5分間。上澄みを2mLのエタノール/塩酸溶液（39：1; 99％エタノール（ v / v ）で沈殿させました。 ）：37％塩酸（ w / v ））。上清を750 g で遠心分離しました 5分間、その後、UV分光光度計で398nmの吸光度を測定しました。蒸留水からなるポジティブコントロールと0.9％生理食塩水からなるネガティブコントロールを同じ方法で調製し、測定しました。

ナノ粒子懸濁液の溶血率（HR％）は次のように計算されました：

ここで A _サンプル はサンプルの吸光度です。 A _{ネガティブ} はネガティブコントロールの吸光度であり、 A _{ポジティブ} はポジティブコントロールの吸光度です。

ブランクリポソームの細胞毒性

CCK-8は、ヒト肝細胞癌HepG2細胞およびヒト結腸癌HCT116細胞におけるブランクリポソームの細胞毒性を検出するために使用されました。中断されたHepG2セルとHCT116セル（1×10 ⁴ 細胞/ウェル）を96ウェルプレートに接種し、RPMI-1640培地で対数増殖期まで培養しました。異なる濃度のブランクリポソームを培地に加えた。各濃度に対して6つの複製ウェルを準備しました。 24時間のインキュベーション後、培地を廃棄し、100μLのCCK-8作業溶液（CCK-8：RPMI-1640培地、10：100）を添加しました。 2時間のインキュベーション後、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad 680、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）によって450 nmで吸光度を検出し、定量化しました。

リポソームの安定性に対する環境pHの影響

BF / PEG-LPは、それぞれpH7.4およびpH5.0のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で水和することにより調製しました。リポソームは暗条件下で4℃で保存された。 296 nmでのサンプルの吸光度は、0、5、15、30、60、および120分で測定されました。

インビトロ実験

細胞増殖は、CCK-8増殖アッセイによって評価されました。 HepG2、HCT116、A549、およびU251細胞は、1×10 ⁴ の密度で個別に播種されました。 細胞/ウェル、96ウェルプレート、37°C​​、5％（ v / v ）CO ₂ 。 24時間後、さまざまな濃度のBF / PEG-LPをウェルに添加しました。さらに24時間培養した後、細胞培地を廃棄し、100μLのCCK-8ワーキング溶液を添加しました。 2時間のインキュベーション後、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad 680）によって450nmで吸光度を検出および定量しました。生細胞とIC ₅₀ の割合 値は用量反応曲線から推定されました。各サンプルとコントロールの値は、6つの複製ウェルの平均によって決定されました。

腫瘍異種移植実験

U251セル（1×10 ⁷ ）0.15 mLのPBSをヌードマウスの皮下に接種し、7日間成長させて、50mmを超える腫瘍サイズに到達させました ³ 。次に、マウスをランダムに2つのグループに分け、それぞれ6匹のマウスを使用しました。治療群では、0.5、1.0、または2.0 mg / kg /日のBFまたはBF / PEG-LPが腹腔内投与されました。 21日間連続して注射。 0.1％DMSOを含むPBSをビヒクル対照群に注射し、2 mg / kgのシスプラチン（DPP）を陽性対照群に注射しました。

マウスの体重は2日ごとに測定されました。 BFおよびBF / PEG-LPで治療されたすべてのマウスは、皮膚と髪の状態、食物と水の摂取量、糞便の特徴、および行動の変化について注意深く観察されました。実験の終わりに、マウスを犠牲にし、腫瘍異種移植片を取り出して秤量した。次に、移植された腫瘍を4％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィンに包埋しました。 5ミクロンの厚さの切片を作成し、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色しました。腫瘍細胞の成長と壊死、および周囲の組織の浸潤が光学顕微鏡で観察されました。

薬理学的評価

一般的な行動と独立した活動

50匹の昆明マウスをランダムに5つのグループに分けました（ n =グループあたり10）i.p。単回投与で以下を投与した：対照群に投与された量の生理食塩水、陽性対照群として20 mg / kgペントバルビタールナトリウム、および低、中、高として1.0、1.5、および2.0 mg / kg -BF / PEG-LPグループを投与します。次に、一般的な行動、姿勢、歩行、唾液分泌、筋原線維形成、眼振、およびマウスの分泌物を観察した。投与の1時間後、マウスをオープンフィールドボックスに入れました。ボックス内を移動するマウスの数は、マウスを1分間順応させた後、10分間カウントしました。

協調運動テスト

マウスをランダムに5つのグループに分けました（ n =グループあたり10、半分は男性、半分は女性）i.p。以下を投与した：ブランク対照群に投与された量の生理食塩水、陽性対照群として2.5 mg / kgの塩酸クロルプロマジン。低用量、中用量、および高用量のBF / PEG-LPグループとして、それぞれ1.0、1.5、および2.0 mg / kgのBF / PEG-LP。

滑らかな金属棒（直径1.27 cm、長さ80 cm）を地面に対して垂直に配置し、直立を保つために下部に固定しました。 1週間の治療後、クライミングテストをそれぞれ30分、60分、120分実施しました。マウスを金属棒の上に置き、自然に這うようにした。金属棒を降りるときのマウスの協調が観察され、採点された。採点基準は次のとおりです。0ポイント、段階的な下降。 1ポイント、スライディング降下; 2ポイント、下降不能。と3ポイント、反射は観察されませんでした。

急性毒性

半数致死濃度（LD ₅₀ ）急性毒性を評価するためにBFおよびBF / PEG-LPの計算を行った。合計110匹の昆明マウス（オスの半分とメスの半分）をランダムに11のグループに分けました（ n =10）。 5つのグループが単一の静脈内投与を受けました。 1.0、0.37、0.14、0.05、または0.02 mg / kgのBFの用量、および5つのグループが単一の静脈内投与を受けました。 4.0、2.83、2.0、1.41、または1.0 mg / kgのBF / PEG-LPの用量。注入量は0.2mLでした。 BFは最初に1％DMSOを含む生理食塩水に溶解しました。次に、BFおよびBF / PEG-LPを通常の生理食塩水で希釈して、所望の濃度を得た。対照群には、1％DMSOを含む生理食塩水を投与しました。治療後、マウスの一般的な行動を14日間観察し、死亡率を記録しました。 i.v 。後のマウスの病理学的変化 投与は光学顕微鏡（NIKON Eclipse ci、東京、日本）で観察されました。

HPLCを使用した組織分布の研究

Sprague-Dawleyラットはランダムに2つのセクションに割り当てられました（各セクションに4つのグループ、 n =グループあたり6）。これらの2つのセクションはi.p でした。 それぞれ0.5mg / kgBFおよびBF / PEG-LPを投与した。心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳などの主要組織のサンプルは、投与後5、15、45、90分に採取されました。組織サンプルを生理食塩水（0.9％）ですばやくすすぎ、必要に応じて血液と内容物を除去しました。洗浄後、ろ紙を使用してサンプルを吸い取りました。サンプルを秤量し、0.9％生理食塩水でホモジナイズしました（組織サンプルから生理食塩水へ、1：2、 w / w ）。得られたホモジネートは、分析まで–80°Cで保存しました。

標的化合物を抽出し、液液調製法により内因性タンパク質の干渉を排除しました[18]。酢酸エチルが抽出回収率を改善し、内因性干渉を最小限に抑え、BFの検出の感度と選択性を向上させることを発見しました。その結果、酢酸エチルがサンプル調製の最適な溶媒として利用されました。 20マイクロリットルのISワーキング溶液を、組織ホモジネートの100μLアリコートに添加しました。次に、サンプルを30秒間ボルテックス混合し、2.5mLの酢酸エチルで2分間抽出しました。 3500 gで10分間遠心分離した後、上部の有機層を別のチューブに移し、穏やかな窒素流下で45℃で蒸発させました。残留物を100μLの移動相で再構成しました（アセトニトリル：0.1％ギ酸/水溶液、65：35、 v / v ）5分間ボルテックス混合し、12000gで10分間遠心分離します。次に、上清の10μLアリコートをHPLCシステム（Waters 2995/2996、Waters Corporation、米国マサチューセッツ州ミルフォード）に注入しました。 BFおよびISを検出するために最適化されたクロマトグラフ条件は以前に提示されました[6]。

統計分析

すべての結果は平均±SD（ n ）として表されました。 =3）、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析（ANOVA）によって配合間の差異を比較しました。 P <0.05はすべての場合の有意性を示します。

結果と考察

BF / PEG-LPの物理的および化学的性質

透過型電子顕微鏡（TEM）により、追加ファイル1：図S1Aに示すように、BF / PEG-LPが均一な球形であることが明らかになりました。 BF / PEG-LPの構造はFT-IRによって特定されました。追加ファイル1：図S1Bに示すように、特徴的なピークは3495 cm ^-1 です。 および3436cm ^-1 は、アミド結合のN–H伸縮振動を表し、1079 cm ^-1 にピークがあります。 BF / PEG-LPのエーテル結合のC–O–C伸縮振動を表しています。インビトロでの製剤の安全性を評価するために、ブランクリポソーム、BF、およびBF / PEG-LPの溶血速度をRBC溶血試験によって決定し、ブランクリポソームで処理したHepG2およびHCT116細胞の細胞生存率をCCKによって測定した。 -8アッセイ。 BFグループは明らかな溶血を示しました。ただし、BF / PEG-LPグループの溶血率は、同じ濃度（ P ）で有意に低かった。 <0.01）。 BF / PEG-LPの濃度を200μg/ mLに上げると、溶血速度はブランクリポソームの溶血速度よりも明らかに高くなりました（ P <0.01、図1a）。 CCK-8アッセイの結果は、ブランクリポソームがHepG2およびHCT116細胞に対して無毒であることを示しました（図1b）。

BF / PEG-LPの物理的および化学的性質。 a ブランクリポソーム、BF、およびBF / PEG-LPの赤血球溶血率。データは\（\ overline {x} \）±s（ n として表示されます =3）。 ** P <0.01vs 。 同じ濃度のBF / PEG-LPグループ。 b HepG2およびHCT116細胞におけるブランクリポソームの細胞毒性。データは\（\ overline {x} \）±s（ n ）として表示されます =6）。 c さまざまなpH条件でのBF / PEG-LPの安定性。データは\（\ overline {x} \）±s（ n ）として表示されます =6）。 ** P <0.01vs 。 同じ時点でpH7.4グループ。略語：BF、ブファリン; BF / PEG-LP、ブファリンをロードしたPEG化リポソーム

BF / PEG-LPの安定性に対する環境pHの影響は、UV分光光度法によって評価されました。図1cは、pH 5.0グループのサンプルの吸光度が保存時間とともに増加したことを示しています。これは、BF / PEG-LPがpH7.4（ P ）のPBSでより安定していることを示しています。 <0.01）。

インビトロ腫瘍細胞アポトーシス

BF / PEG-LPによって誘発されたHepG2、HCT116、A549、およびU251細胞のアポトーシスは、CCK-8アッセイによって決定されました。 IC ₅₀ テストしたすべての細胞のBF / PEG-LPの値を表1に示します。BF/ PEG-LPは、用量依存的にすべての細胞タイプの生存率を大幅に低下させました（図2）。 BF / PEG-LPの阻害効果は、40 ng / mLを超える濃度でのDOX（陽性対照、50μg/ mL）の阻害効果と同様でした。さらに、IC ₅₀ に基づく 値、BF / PEG-LPに対する細胞の感度は次のようにランク付けされました：HCT116> HepG2> U251> A549。

HepG2におけるBF / PEG-LPの細胞毒性（ a ）、HCT116（ b ）、A549（ c ）、およびU251（ d ）セル。データは\（\ overline {x} \）±s（ n として表示されます =6）。 * P <0.05、 ** P <0.01vs 。 各細胞株の対照群。略語：BF / PEG-LP、ブファリンをロードしたPEG化リポソーム。 DOX、ドキソルビシン

一般的な薬理学的評価

BF / PEG-LPの投与後、マウスの一般的な行動はブランクグループのそれとは異なっていた。特に、高用量BF / PEG-LP群のマウスは振戦と唾液分泌を示した。投与後、マウスはオープンフィールドボックスに10分間留まり、アクティブなグリッドの数が記録されました。陽性対照（ペントバルビタール）群では、アクティブグリッドの数はわずか342±35であり、対照群（725±127、 P ）よりも有意に少なかった。 <0.05）。図3aに示すように、中用量および高用量のBF / PEG-LPグループのアクティブグリッドの数は、コントロールグループとは大幅に異なっていました。ロッドクライミングテストでは、BF / PEG-LPが、対照群（ P ）と比較して、1週間の投与後のマウスの協調運動に一定の促進効果があることが示されました。 <0.01）、クロルプロマジンは陽性対照群（ P ）に対して有意な促進効果を示しました。 <0.05）、図3bに示すように。

自発運動に対するBF / PEG-LPの薬理学的効果（ a ）および協調運動（ b ）マウスで。データは\（\ overline {x} \）±s（ n ）として表示されます =10）。 * P <0.05、 * ^* P <0.01vs 。 各時点での対照群; ^＃ P <0.05対低用量BF / PEG-LPグループ。略語：BF / PEG-LP、ブファリンをロードしたPEG化リポソーム

腫瘍異種移植実験

長期投与により、陽性対照、BF、およびBF / PEG-LP群のマウスは、精神遅滞、食物摂取の減少、反応の遅さ、および鈍い毛皮を示した。マウスの死亡は、BFグループとBF / PEG-LPグループの両方で発生しました。陽性対照群の抗腫瘍率は36.5％でした。高用量BF群のそれは27.6％でした。低用量、中用量、および高用量のBF / PEG-LPグループのそれはそれぞれ11.4％、28.9％、および38.7％でした。低用量のBF群を除いて、薬物治療群と陰性対照群の抗腫瘍率には有意差がありました（ P <0.05）、図4aに示すように。低用量BF群と比較して、高用量BF / PEG-LP群の腫瘍抑制率は有意に高かった（ P <0.01）、図4bに示すように。

ヌードマウスにおける神経膠腫異種移植片の増殖に対するBFおよびBF / PEG-LPの阻害効果。腫瘍重量の比較（ a ）および腫瘍抑制率（ b ）各グループで。データは\（\ overline {x} \）±s（ n ）として表示されます =10）。 * P <0.05、 ** P <0.01 対 対照群; ^＃ P <0.05、 ^## P <0.01vs 。 高用量BF / PEG-LPグループ。 c 担癌マウスの腫瘍組織のH＆E染色。略語：BF、ブファリン; BF / PEG-LP、ブファリンをロードしたPEG化リポソーム。 DPP、シスプラチン; H＆E、ヘマトキシリン、エオシン

担癌マウスの異種移植片は結節状であった。 H＆E染色は、対照群では、腫瘍細胞の核が大きく、細胞質が小さく、細胞の成長が活発であることを示しました。図4cに示すように、高用量BF / PEG-LP群では、壊死性腫瘍組織の広い領域が観察され、壊死の程度は用量依存的でした。

急性毒性

単一の静脈内投与の急性毒性。 昆明マウスにおける製剤の用量を決定した。 LD ₅₀ BFおよびBF / PEG-LPの値はそれぞれ0.156および3.03mg / kgでした。 BFと比較して、BF / PEG-LPの急性毒性は有意に低かった（ P <0.01）;この効果は、血中へのBF放出を制御するリポソーム製剤に起因していました。

i.v 。後のマウスの病理学的変化 投与は光学顕微鏡で観察されました（図5）。心臓、肝臓、腎臓などのいくつかの臓器で病理学的変化が観察されました。心臓心筋線維の溶解と出血を伴う骨折は明らかでした。肝細胞と肺内皮細胞で壊死が観察されました。

1.0 mg / kgBFおよび4.0mg / kgBF / PEG-LPの静脈内投与後に死亡したマウスで観察された病理学的変化。組織切片をH＆Eで染色し、光学顕微鏡で観察しました。注：光学顕微鏡：NIKON Eclipse ci;イメージングシステム：NIKON Digital Sight DS-FI2（東京、日本）;倍率：×200。略語：BF、ブファリン; BF / PEG-LP、ブファリンをロードしたPEG化リポソーム。 H＆E、ヘマトキシリン、エオシン

組織分布研究

追加ファイル1に示すように、BFおよびCBG（IS）のリテンションタイムで有意な干渉がないことを示す、ブランク組織ホモジネートとスパイクホモジネートのクロマトグラムの比較を使用して、メソッドの選択性をアッセイしました。図S2。検量線は、相関係数 R を使用して、BFとIS（Y）のピーク面積比と20〜2000 ng / mLの範囲の組織ホモジネート濃度から作成されました。 ² > 0.9977（表2）。生物学的サンプル中のBFの精度、精度、および回収率の実験は追加ファイル1：表S1に示され、安定性実験の結果は追加ファイル1：表S2に示されました。

組織分布実験の生データは、追加ファイル1：表S3に示されています。 i.v 。の後 BF / PEG-LPの注入では、その組織分布は、組成、粒子サイズ、ゼータ電位などのいくつかの変数の影響を受けます[19]。図6に示すように、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳などのさまざまな組織のBF濃度を、5、15、45、および90分で定量化しました。iv。 投与すると、両方のグループのBFの濃度は、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓などの一部の組織で非常に低く、BFの分布と除去が迅速に行われたことを示しています。脳内のBFの濃度は、他の組織ではありませんが、i.v 後90分でも検出できました。 両方のグループでの投与は、BFの分布と除去が他の組織よりも脳内で比較的遅いことを示しています。

ラット臓器におけるBFの組織分布。 A ブファリンの分子式（ a ）およびcinobufagin（ b 、 は）。 B BF / PEG-LPまたはBFを0.5mg / kgで単回静脈内投与した後のラットにおけるBFの組織分布プロファイル。データは\（\ overline {x} \）±s（ n ）として表示されます =6）。略語：BF、ブファリン; BF / PEG-LP、ブファリンをロードしたPEG化リポソーム。 IS、内部標準

一方、BF / PEG-LP群の脳組織では、BF群に比べて1.20倍高いBF（5分で333±92.5 ng / g）が検出されました。さらに、BF / PEG-LP群では、肝臓、脾臓、脳組織で高濃度のBFが検出されました。 BFの有意な蓄積が肝臓で検出され、BF / PEG-LPグループで187±31.0ng / g、BFグループで163±35.0 ng / gの濃度でした（ P <0.01）。同様の現象は、主に代謝と排泄前の血中BFの劇的な増加によって引き起こされ、以前の研究で観察されました[20、21]。

組織分布実験の結果によると、BF自体は、おそらくその高い脂質溶解度、低分子量（386.52 g / mol）、およびコレステロールと同様の化学構造のために、BBBを通過する可能性があります。同じ母核構造を共有します。しかし、BFの臨床応用は、その脂質溶解度が高く、水溶性が低いために制限されています。 BFの生物学的利用能は、別の形で投与されない場合は低いです。以前の研究[6]で、BF / PEG-LP製剤が水溶性を改善し、血液循環期間を延長し、半減期を延長し、静脈内投与を含むBFの適用範囲を拡大できることを示しました。化学療法。現在の研究では、BF / PEG-LPの投与により、脳内のBF濃度が上昇し、それがより長い期間（90分）持続しました。さらに、45分でBFグループとBF / PEG-LPグループの間でBF濃度に有意差がありました（167.59±54.52 vs。 71.52±48.35ng / g、 P <0.01）。

以前の研究では、BFは心臓にジギタリスのような効果を発揮し、ラットの心拍数と心筋収縮力を増加させることが実証されました[22]。したがって、大量投与でのBFの心毒性は、心臓への蓄積によって引き起こされる可能性があります。この研究の生体内分布実験は、心臓におけるBFの蓄積がBFグループよりもBF / PEG-LPグループで低かったことを示しました（95.0±18.5 vs 。 5分で134±17.8ng / g、 P <0.01; 15.32±5.56 対 15分で63.79±28.21ng / g、 P <0.01）。 Whether cardiac toxicity can be attenuated with a lower dose of BF requires further verification. Nevertheless, the antitumor effect of BF was sufficiently strong in this study (the IC₅₀ values for glioma cells were nanomolar). For in vivo application, it is critical to decrease the toxicity (especially heart toxicity) and increase the water solubility of BF, which was our focus in this study.

In general, PEGylated liposomes are considered to have no or low immunogenicity. However, according to recent studies, when PEGylated liposomes were repeatedly injected into the same animal, an immune response was triggered [23]. In fact, a second injection of PEGylated liposomes resulted in reduced blood circulation time and increased hepatic and splenic accumulation, which is known as the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon. Such immunogenicity of PEGylated liposomes presents major challenges in the research of liposomal formulations and their clinical application. However, liposomal formulations that do not display the ABC phenomenon have been reported, such as a long-circulating DOX-loaded liposomal formulation (Doxil, Sequus pharmaceuticals, Inc., San Francisco, CA, USA), which has been commercialized. DOX was released from the liposomes and entered the spleen, damaging spleen cells and thereby reducing the production of anti-PEG IgM, which could selectively bind with PEG on the surface of the liposomes administered at the second injection. Whether BF/PEG-LP exhibits the ABC phenomenon remains unknown and requires further study. If so, mitigating the ABC phenomenon will require in-depth investigation.

Conclusion

In the present study, we evaluated hemolysis induced by BF/PEG-LP and the cytotoxicity of blank liposomes to verify the safety thereof. Moreover, the effect of environmental pH on the release of BF from liposomes was investigated to assess the stability of BF/PEG-LP. BF encapsulation in a liposomal suspension might affect its antitumor activity in vitro and in vivo and general behavior, acute toxicity, and tissue distribution in vivo. Nonetheless, we believe that the development of the liposomal formulation described in this study has laid a foundation for the future clinical application of BF. Intensive investigation of the relevance of the ABC phenomenon to BF/PEG-LP is warranted in the future.

データと資料の可用性

この調査中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された記事とその補足情報ファイルに含まれています。

略語

ABC:

Accelerated blood clearance

AIE:

The aggregation-induced emission

BBB:

Blood-brain barrier

BF：

Bufalin

BF/PEG-LP:

Bufalin-loaded PEGylated liposomes

CBG:

Cinobufagin

CCK-8：

細胞計数キット-8

IC ₅₀ ：

Half-maximal inhibitory concentration

i.p.:

Intraperitoneally

IS:

内部標準

i.v. ：

Intravenously

LD₅₀ ：

Median lethal concentration

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

RBC:

Red blood cell