シスプラチンとテトラドリンの組み合わせの抗腫瘍効果を高めるためのプラットフォームとしての生体適合性ナノ粒子

はじめに

腫瘍の包括的な治療法の開発に伴い、白金化合物はさまざまな癌の治療に重要な役割を果たしており、その中でもシスプラチン（CDDP）は診療所で広く使用されています[1、2]。今日、CDDPは腫瘍免疫療法と組み合わせた場合でも依然として重要であり、非小細胞肺癌（NSCLC）などの悪性腫瘍に対して好ましい効果を示しています[3]。しかし、これらの化学療法剤は、望ましくない毒性を犠牲にして常に抗腫瘍活性を達成するため[4]、毒性を低減し、化学療法の有効性を高めることができる治療剤が絶え間なく探求されてきました[5、6]。テトランドリン（Tet）はビス-ベンジルイソキノリンアルカロイドのメンバーであり[7]、化学療法に対する感作に十分な効果を示します。私たちの以前の研究は、TetとCDDPの組み合わせが、除去修復交差補完グループ1（ERCC1）、チミジル酸合成酵素（TS）、β-を含む化学療法剤関連遺伝子の発現を阻害することにより、顕著な相乗的抗癌活性を有することを示しました。チューブリンIIIなど[8]。しかし、Tetの臨床応用は、水溶性が低く、経口バイオアベイラビリティが低いという欠点があります[7]。さらに、親水性CDDPは細胞外マトリックス（ECM）に最も容易に分布しますが、疎水性Tetは脂質膜に浸透するため、2つの薬剤は実際には一緒に機能しません。したがって、2つの薬剤を同時に効果的に送達し、副作用を減らして抗腫瘍効果を改善できる方法を見つけることが不可欠です。

ナノテクノロジーの分野における最近の進歩は、癌の診断と治療のための新しいアプローチを管理しています[9、10]。両親媒性共重合体、特にポリエチレングリコール（PEG）で構築されたナノ粒子（NP）は、血清タンパク質の付着を減らし、細網内皮系（RES）による取り込みを防ぐ能力で知られています[11]。疎水性薬物を運ぶために使用される場合、ナノキャリアは溶解性を巧みに増加させ、延長するだけでなく、血液循環および腫瘍における薬物の滞留性を増加させます[12]。共重合体NPの臨床使用により、NPの生体適合性がますます注目を集めています。たとえば、最近の調査結果では、注入された二酸化チタン、シリカ、および金のナノ粒子の一部が、動物モデルの癌細胞の血管内侵入および血管外遊出を加速することが明らかになりました[13]。優れた生体適合性と安全性を備えたナノ材料から調製されたNP、特にFDAによって承認されたものは、薬物担体のより良い候補です。

事前に、ポリエチレングリコール-ポリ（カプロラクトン）（PCL-PEG）[16]を使用して、CDDPをロードしたNP [14、15]とTetをロードしたNPを構築することができました。これらは、両方ともinvivoでの抗腫瘍効果が実証されています。この研究では、CDDPとTetの同時配信にPEG-PCLを使用しました。ほぼ中性の電荷を持つPEGは、ナノ粒子の親水性シェルを形成し、抗原性エピトープを隠して免疫反応を防ぎます[14]。蛍光顕微鏡からの画像は、細胞がNPによって送達される親水性および疎水性の両方の薬剤を取り込むことができることを示した。さまざまな腫瘍細胞株だけでなく腫瘍組織についてのinvitro研究の結果は、CDDP-TetNPが遊離薬物よりも効果的に腫瘍増殖を阻害することを明らかにしました。インビボで研究した場合、抗腫瘍効果の増加および副作用の減少がNP群で観察された。さらに、 ¹⁸ FDG-PET / CTイメージングは​​、NPグループで腫瘍の代謝率が最も低いことを示し、それによってCDDP-TetNPが腫瘍の成長を遅らせる能力を示しています。

メソッド

資料

試薬とセル

CDDP（分子式PtCl ₂ （NH ₃ ） ₂ ）はShandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd.（中国済南）から購入しました[15]。テトランドリン（分子式C ₃₈ H ₄₂ N ₂ O ₆ ）は、Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company（Jiangxi、China）から純度> 98％の粉末として入手しました[16]。メトキシポリエチレングリコール[MePEG;重量平均分子量（Mw =4 kDa; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. China]は、トルエンを用いた共沸蒸留によって脱水し、使用前に50°Cで12時間真空乾燥しました。ε-カプロラクトン（ε-CL; Aldrich 、USA）をCaH ₂ で乾燥することにより精製した。 室温で、続いて減圧下で蒸留する。ポリビニルアルコール（PVA;重合度=500、アルコール化度=88％; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd.、China）およびオクタン酸第一スズ（分子式SnCl2）（Sigma）を受け取ったまま使用しました。 RPMI 1640培地（Gibco、米国）、子牛血清（Lanzhou Minhai Bioengineering、中国）、およびジメチルチアゾリー-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT; Amersco、米国）を受け取ったまま使用しました。

ヒト高分化型胃がん細胞株MKN ₂₈ 、ヒト結腸直腸腺癌細胞株LoVo、ヒト子宮頸癌細胞株Hela、およびマウス肝癌細胞株H ₂₂ Shanghai Institute of Cell Biology（Shanghai、China）から入手しました。すべての細胞株は、10％ウシ血清、ペニシリン（100 U / mL）-ストレプトマイシン（100 g / mL）、ピルビン酸、グルタミン、およびインスリンを添加したRPMI 1640培地で、37°C​​の水飽和雰囲気で増殖させました。 5％CO ₂ 。

共重合体の合成

以前に説明したように[16、17]、mPEG-PCLおよびHO-PCLコポリマーは、開環共重合によって合成されました。簡単に説明すると、所定量のε-CLを、PEGと少量のオクタン酸第一スズ（0.1％wt / wt）を含む重合チューブに添加しました。次に、チューブを真空システムに接続し、密閉して、130°Cの油浴に48時間入れました。 HO-PCL共重合体を合成するために、所定量のε-CLとオクタン酸第一スズを乾燥せずに重合管に添加しました。重合が完了した後、粗コポリマーをクロロホルムで溶解し、過剰量の冷メタノールに沈殿させて、未反応のモノマーおよびオリゴマーを除去した。次に、沈殿物を濾過し、水で数回洗浄した後、減圧下で完全に乾燥させた。

CDDP-Tetをロードしたナノ粒子の調製

所定量のCDDPおよびTetをロードしたナノ粒子は、ダブルエマルジョン（DE）法によって調製されました[14、18]。 CDDPとTetは、氷浴（溶液W1）で15秒間（15 W）超音波処理することにより、5mgのmPEG-PCLと15mgのHO-PCLを含む1mLのジクロロメタン（DCM）溶液で乳化しました。次に、4 mLの3％（w / v）PVA溶液W2を添加し、30秒間超音波処理して、W1 / O / W2エマルジョンを作成しました。ダブルエマルジョンを50mLの0.3％（w / v）PVA水溶液で希釈し、DCMを真空下で蒸発させました。得られたナノ粒子を収集し、洗浄し、凍結乾燥しました（図1）。

CDDP-TetNP調製のスキーム

薬物の読み込みコンテンツとカプセル化の効率

薬物負荷量を決定するために、凍結乾燥したCDDP-Tet負荷NP粉末をジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し、この溶液30Lを2mmol / LHCL30Lと混合してから2.94mLを添加しました。 0.2ミリモル/ LのSnCl ₂ 2 mmol / LHCLの溶液。 Shimadzu UV-1205分光光度計（京都、日本）を使用して、検量線を参照して1時間後に403nmでの吸光度を測定しました。次に、NP内の薬物の総量を計算できます。薬物負荷量とカプセル化効率は、それぞれ、式（1）によって得られました。 （1）および（2）：

ナノ粒子のinvitro細胞毒性と生体適合性研究

細胞取り込み研究

以前の研究[15]に基づいて、LoVo細胞を約5×10 ⁵ の6孔プレートのカバーに配置しました。 各細孔の細胞を24時間インキュベートしました（37°C、5％CO ₂ ）。ローダミンB（21μg/ mL）を含むNPを細孔に追加しました。 2時間のインキュベーション後、パテを4°Cおよび37°CのPBSでそれぞれ3〜4回洗浄しました。次に、カバーガラス上のLoVo細胞を蛍光顕微鏡にかけました。

細胞毒性アッセイ

薬物のinvitro細胞毒性は、MKN28およびH ₂₂ を使用した標準的なMTTアッセイによって決定されました。 細胞株。簡単に説明すると、アッセイの24時間前に、細胞を96ウェルプレートにウェルあたり5000細胞の密度で播種しました。次に、細胞を一連の用量の遊離CDDP、遊離Tet、遊離CDDPとTet、およびCDDP-Tetをロードしたナノ粒子に曝露しました。インキュベーション後、20μLの5 mg / mL MTT溶液を各ウェルに添加し、プレートを4時間インキュベートして、生細胞が黄色のMTTを紺色のホルマザン結晶に変換し、200μLのジメチルに溶解しました。スルホキシド（DMSO）。各ウェルの光学密度（OD）は、ELISAリーダー（ELX800 Biotek、USA）によって、それぞれ490nmと630nmのテスト波長と参照波長を使用して測定されました。細胞生存率は次の式で決定されました：

ブランクナノ粒子のinvitro適合性は、MKN ₂₈ を使用したMTTアッセイによっても決定されました。 およびH ₂₂ 細胞株。 MTTアッセイから得られたすべての結果は、少なくとも3回の独立した機会に実験を繰り返し、毎回3回テストすることによって確認されました。

アポトーシスアッセイ

アネキシンV-FITCキット（Bender MedSystem、USA）を採用して、細胞アポトーシス率の変化を調べました。 MKN ₂₈ 細胞を6cmの培養皿に24時間さらしました。培地は、それぞれ1μg/ mLの遊離CDDP、1μg/ mLのCDDPをロードしたNP、および200μg/ mLのブランクNPに交換しました。対照群は、薬物を含まない培地に置き換えられました。 48時間の培養後に酵素を添加しました。次に、細胞を収集し、PBSで2回洗浄し、100μLのバッファーに再懸濁しました。アネキシンV5μLとPI1μLを順番に加えて混合し、光を当てずに室温で15分間静置しました。 400 mLのバッファーを追加し、細胞アポトーシス率分析のためにFCM（BD FACS CantoTM、USA）プロセスを実行しました。

組織培養薬物応答アッセイ（HDRA）

HDRAは、以前の研究[14、19]に従って実行されました。簡単に説明すると、オスのICRマウスに、両方の腋窩腔に4–6×10 ⁶ を皮下注射しました。 H ₂₂ 生理食塩水中の細胞。腫瘍が400〜600mmに達したとき ³ 体積で、マウスは頸椎脱臼によって犠牲にされ、新鮮な標本がサンプリングされ、生理食塩水で2回洗浄され、ハンクス溶液に浸され、約15mgの重さの断片に分割されました。組織サンプルを24ウェルプレートに入れ、1 cmの大きさの正方形のゼラチンスポンジを、20％ウシ胎児血清と遊離CDDPまたはCDDP-を含む硫酸アミカシン（100 IU / mL）を添加したRPMI1640培地に浸しました。 2つの異なる濃度でNPをロードしました。対照として、4つの腫瘍標本を薬物なしでインキュベートした。次に、組織を37°C、5％CO ₂ で7日間培養しました。 。 100 mg / mLコハク酸ナトリウム中のI型コラゲナーゼ（100 L、0.6 mg / mL）とMTT（100 L、5 mg / mL）の混合溶液を添加しました。さらに24時間インキュベートした後、MTTホルマザンを1 mL DMSOで抽出し、各ウェルから100Lの溶液を96ウェルマイクロプレートのウェルに移しました。マイクロプレートの各ウェルのODは、ELISAリーダーを使用して、それぞれ490nmと630nmのテスト波長と参照波長で測定されました。組織の生存率は、次の式（4）に従って計算されました。

In Vivo Antitumor Efficacy

腫瘍体積の測定

体重が18〜20 gのオスのICRマウスに、マウス肝細胞癌細胞株H ₂₂ を移植しました。 CDDP-TetをロードしたNPの相対的な有効性を認定するために使用されます。特定病原体除去（SPF）環境下で飼育されたマウスは、ドラムタワー病院の動物管理委員会によって承認されたガイドラインに従って実施されました。 4–6×10 ⁶ を含む0.2mLの細胞懸濁液 H ₂₂ マウスの左腋窩腔に細胞を皮下注射した。マウスを6つのグループに分けました：コントロールグループ（生理食塩水）、ブランクNPグループ、遊離CDDP（3 mg / kg）グループ、遊離CDDP + Tet（CDDP 3 mg / kg + Tet 7.2 mg / kg）グループ、およびCDDP- TetをロードしたNP（CDDP 3 mg / kg + Tet 7.2 mg / kg）グループ。各グループは6匹のマウスで構成されていました。移植の7〜8日後に治療を開始し、その日を「0日目」と指定しました。報告されたmg / kg用量を達成するために用量を調整できるように、治療時に各動物の体重を測定した。実験中、動物の体重も1日おきに測定しました。

蛍光抗体法

対照群のマウスからの腫瘍組織、および遊離のCDDPとTetおよびCDDP-Tet NPを投与された腫瘍組織を、治療後21日目の組織学的観察のために選択した。腫瘍を解剖し、10％中性緩衝ホルマリンで固定し、通常はパラフィンに加工し、厚さ5mmで切片化しました。サンプルを（40,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）（DAPI、青）および末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング（TUNEL、緑）で染色した後、組織切片をZeiss LSM510Meta共焦点顕微鏡で観察しました[20]。 。

¹⁸ FDG-PET / CTイメージング

次に、遊離CDDPとTetグループおよびCDDP-TetをロードしたNPグループのマウスに、治療後6日目にPET / CTイメージングを行いました。トレーサー注射の前に4時間の絶食を行った。 ¹⁸ の14.8MBq（400 lCi） F-FDGは、放射性トレーサーとして尾静脈から注入されました。画像は、PET / CTスキャナー（Jemini JXL、フィリップス、米国）を組み合わせて作成されました。 ¹⁸ の投与から45分後に、高解像度のPET画像と同じ視野のCTビューがマウスで取得されました。 F-FDG。 PET画像は、CTデータに基づいて減衰と散乱が補正されました。画像融合は、ベンダー提供のソフトウェアを使用して、自動画像融合システムによって実行されました。腫瘍における最大FDG取り込み値は、体重と注入された活動の補正を適用して、標準取り込み値（SUV）の計算で得られました。

統計メソッド

データの統計分析は、学生の t を使用して行われました。 テスト。データは平均±SD、および P の値としてリストされています <0.05は統計的に有意な差として受け入れられました。

結果

共重合体の合成と特性評価

以前の調査によると、PEG-PCLとHO-PCLを使用してNPを合成しました（最適な比率は1：3でした）[14]。最適なPEG-PCL共重合体NPの直径、多分散度、数平均分子量（Mn）、および重量平均分子量（Mw）を追加ファイル1：表S1に示します。 CDDPとTetをロードした場合、薬物のロード内容とカプセル化効率も測定されました（追加ファイル1：表S2）。これは、CDDPをロードしたPEG-PCL共重合体NPと同様です。ただし、Tetの薬物負荷量と負荷効率は、HO-PCLコンポーネントと関係がある可能性があるTet負荷のPEG-PCL共重合体NPよりも低くなります。

動的光散乱（DLS）により、CDDP-TetをロードしたPEG-PCL共重合体NPの直径は359.1±5.3 nmで、多分散度は約0.231でした。 TEMおよびAFM（追加ファイル1：図S1aおよびS1b）で観察した場合、NPは、DLSからのデータと一致する、規則的な球形および同様のサイズを示しました。また、小さな液滴がナノ粒子に分散しており、ナノ粒子が実際にダブルエマルジョンの構造であることを確認しています。

CDDP-TetをロードしたNPの細胞取り込み

蛍光色素をロードする粒子は、視覚的およびリアルタイムの検出を実現する細胞取り込みを調査するための一般的な方法として適用されています。色素をロードしたNPがエンドサイトーシスを介して細胞に侵入できることを実証しました。この研究では、ローダミン-Bは親水性であり、CDDPのシミュレーションに使用されるPI蛍光チャネルで検出できます。 Tetのシミュレーションとして、クマリン-6は疎水性であり、その信号はFITC蛍光チャネルで受信できます。クマリン-6とローダミン-BをロードしたNPと2時間共培養した後、蛍光顕微鏡と光学レンズ（200×）でLoVo細胞を検出しました。図2に示すように、蛍光シグナルは、PI蛍光チャネル、FITC蛍光チャネル、およびPI / FITC二重蛍光チャネルで検出できます。その結果、NPはクマリン-6とローダミン-Bの両方を同時に腫瘍細胞に運ぶことができることが確認されました。これに基づいて、CDDPとTetをNPにロードし、腫瘍細胞に同時に吸収できることが推測できます。

ローダミンBとクマリン-6（200×;バー：50 um）をロードしたNPで2時間染色した後のLoVo細胞の写真。 a 光学顕微鏡下での細胞形態、 b 蛍光顕微鏡下での細胞形態（PI蛍光チャネル）、 c 蛍光顕微鏡下での細胞形態（FITC蛍光チャネル）、および d 蛍光顕微鏡下での細胞形態（PI / FITCデュアル蛍光チャネル）

ナノ粒子のinvitro細胞毒性

遊離CDDP、遊離Tet、遊離CDDPとTet、およびCDDP-TetをロードしたNPの細胞毒性を、胃細胞株MKN28で比較しました。テトの濃度はCDDPの濃度の2.4倍でした。図3に示すように、CDDP-TetをロードしたNPの細胞毒性は、4つのグループの中で最も強力でした。遊離TetとNPsグループおよび他の3つの遊離薬物グループとの間の細胞毒性の違いは、濃度が増加するにつれて顕著になりました。同様の結果が、ヒト子宮頸がん細胞Helaおよび肝細胞がん細胞H ₂₂ で観察されました。 （追加ファイル1：図S2a、S2b）。

ナノ粒子のinvitro細胞毒性。 a 薬物と48時間共培養した後のMKN28の細胞生存率。テトの濃度はCDDPの濃度の2.4倍でした。 b 薬物と48時間共培養した後の光学顕微鏡（200×）でのMKN28細胞の写真

ブランクNPの毒性研究は、以前の研究で実施されました。以前の研究では、NPのブランクは腫瘍細胞株に対してほとんど毒性がなく、ブランクNPは十分な生体適合性があることを示していました[14、16]。

CDDP-TetをロードしたNPのinvitroアポトーシス分析

1μg/ mLの遊離CDDP、2.4μg/ mLの遊離Tet、遊離CDDPとTet（1μg/ mL +2.4μg/ mL）、およびCDDP-TetをロードしたNP（1μg/ mL +2.4μg）の影響を測定しました。 / mL）48時間共培養した後のMKN28細胞のアポトーシス率。細胞アポトーシス率はQ2 + Q4として計算されました（図4に示されています）。細胞のアポトーシス率の変化は、遊離CDDPとTet、遊離CDDP、および遊離Tetグループ間で類似していた（図4a–c）。ただし、CDDP-TetをロードしたNPによって誘導されたMKN28細胞のアポトーシス率は、他の3つのグループよりも有意に高かった（図4d）。

フローサイトメトリーによるinvitroアポトーシス分析 a 無料のCDDP、 b 無料のTet、 c 無料のCDDP + Tetおよび d CDDP-Tet NP

組織培養薬物応答アッセイ（HDRA）

NPの抗腫瘍効果をより包括的に評価するために、H ₂₂ に対する遊離CDDP、遊離CDDPとTet、およびCDDP-TetをロードしたNPの抗腫瘍効果を評価しました。 HDRAを使用した細胞株。化学感受性を予測する臨床的方法として、HDRAは細胞学的実験よりも本物の腫瘍組織の実際の状態をシミュレートします[19]。その結果は、薬物の浸透、細胞外pH値、間質液などの腫瘍組織の微小環境と微細構造によって影響を受ける可能性があります。液圧など

Tetの濃度はCDDPの濃度の2.4倍です。図5に示すように、最低濃度では、遊離CDDPおよびTetグループの抗腫瘍効果はCDDPのそれよりも優れていましたが、効果は薬物濃度の増加と同様でした。アポトーシス分析と一致して、CDDP-TetをロードしたNPは、テストしたすべての濃度で3つのグループ間でかなり優れた抗腫瘍効果を示しました。

組織培養薬物応答アッセイ

InVivo抗腫瘍効果分析

有効性と副作用の評価

H ₂₂ によって形成されたマウスモデル 細胞株の生着は、3 mg / kgの遊離CDDP、遊離CDDPとTet（CDDP 3 mg / kg + Tet 7.2 mg / kg）、CDDP-TetをロードしたNP（CDDP 3 mg / kg + Tet 7.2 mg / kg）、それぞれ。腫瘍は薬物治療の12日後に得られました。腫瘍のサイズを2日ごとに検出して、ドラッグデリバリーの最適な内容を決定しました。腫瘍増殖曲線（図6）に示されているように、対照群とブランクナノ粒子群の腫瘍増殖傾向は類似していましたが、他の3つの群では薬物送達による腫瘍の顕著な抑制が見られました。無料のCDDPグループと比較して、無料のCDDPとTetグループは、最初の6日間でより優れた抗腫瘍効果を示しました。しかし、6日後、2つのグループ間の腫瘍抑制率の差は狭まり始め、10日後、遊離CDDPとTetの併用はさらに悪い抗腫瘍効果を示しました。

確立されたH ₂₂ の腫瘍体積 異なる治療下での治療中のICRマウスにおける異種移植片。図に示すように、0日目にマウスをさまざまな戦略で治療しました。3mg/ kgの遊離CDDP、遊離CDDPとTet（CDDP 3 mg / kg + Tet 7.2 mg / kg）、およびCDDP-TetをロードしたNP（ CDDP 3 mg / kg + Tet 7.2 mg / kg）、それぞれ。平均±SD（ n =6）各グループの測定値

最初の6日間は、無料のCDDPとTetおよびCDDPTetをロードしたNPグループの抗腫瘍効果は同様でした。したがって、CDDP-TetをロードしたNPを投与されたマウスは、治療後6日目以降、より優れた抗腫瘍効果を示しました。追加ファイル1：図S3aは、各グループの異なる腫瘍サイズを示しています。 CDDP-TetをロードしたNPsグループの腫瘍体積は最小であり、これは顕著な抗腫瘍効果の直接的な反映と見なすことができます。腫瘍抑制能力に加えて、遊離CDDPまたは遊離CDDP + Tetグループと比較して、腫瘍の表面に位置する血管が少なかった）。同様に、追加ファイル1：図S3bに示されているように、血管密度は、対照群および遊離CDDPとTet群と比較してNP群で最低でした。

インビボでの腫瘍組織におけるアポトーシス細胞の比率をさらに調査するために、アポトーシス細胞の検出のためにTUNELアッセイを実施した。図7に示すように、腫瘍のアポトーシス細胞は緑色の蛍光で染色され、アポトーシスを示します。マージされた画像は、コントロールグループとFree CDDP plus Tetグループの緑色蛍光領域が少ないことを示しており、アポトーシス細胞の存在が少ないことを示しています。さらに、CDDP-Tet NPで処理したグループでは、多数の緑色蛍光領域が観察され、大量のアポトーシス細胞を示しています。結果は、CDDP-TetNPがinvivoで腫瘍アポトーシスを促進できることを確認しました。

アポトーシス細胞はTUNELアッセイ（緑）で検出され、核染色DAPI（青）で共染色されました

遊離CDDPおよび遊離CDDPプラスTetグループよりも優れた抗腫瘍効果に加えて、CDDP-TetをロードしたNPは副作用も少なかった。図8aに示すように、遊離CDDPおよび遊離CDDPとTetは、対照群と比較して有意な体重減少を引き起こし、直接薬物送達による毒性を示しています。ブランクNP群の体重変化曲線は対照群のそれと類似しており、ブランクNPの毒性は無視できることを示唆している。 CDDP-TetをロードしたNPと対照群によって引き起こされた体重減少は、最初の6日間で同等でした。 6日目から12日目まで、NP群のマウスの体重レベルは対照群よりわずかに低かったが、遊離CDDPまたは遊離CDDPとTet群よりも高かった。無料のCDDPとTetのグループが、最初の4日間で明らかな体重減少に寄与し、マウスの食欲を低下させたことは注目に値します。これは、薬物の吸収が全身に有害であることを示しています。対照的に、CDDP-TetをロードしたNPは組織内でゆっくりと放出され、濃度を安定した程度に維持します。したがって、副作用は直接ドラッグデリバリーと比較して明らかに低下しました。次に、治療の副作用も肝生検によって評価されました（図8b）。対照群と比較して、二剤裸薬群の肝細胞間の境界はぼやけており、一部の肝細胞は膨らんだ変化、細胞体の収縮、核濃縮、および好酸球増加（黄色の矢印）を持っていますが、二剤はナノ粒子グループ。幹細胞の構造は正常であり、細胞間空間は明確であり、明らかな病理学的変化はありません。これらの結果は、NPの送達によって引き起こされる障害がほとんどないことを示唆していました。

副作用の評価 a 確立されたH ₂₂ の体重 異なる治療下での治療中のICRマウスにおける異種移植片。 b HEで染色された肝臓標本は光学顕微鏡観察（400×）でした

PET–CT

各グループのinvivo治療効果をよりよく比較するために、マウスは治療後6日目にCT、PET / CTスキャンを受けました。 CTとPETスキャンの融合画像を図9に示します。PET/ CTは、 ¹⁸ による代謝変化を反映する効率的な方法です。 FDG取り込み検出[21]。 CTスキャン（図9）に示されているように、遊離CDDP + TetグループとCDDP-TetをロードしたNPグループの腫瘍体積は同等でした（図9a）が、遊離CDDP + Tetグループの腫瘍代謝率はNPグループ（図9b）。 CDDP-TetをロードしたNPを投与されたマウスの腫瘍部位での強度の低下は、腫瘍の代謝率が低いことを示しており、それによってNPが腫瘍の成長を遅らせる能力を示しています。

皮下H ₂₂ を有するオスのICRマウス 左腋窩の腫瘍（矢印）。 CT、PET、および融合PET / CT画像は、図の左から右に配置されています。遊離CDDPとTetグループ（青い矢印）の腫瘍代謝率は、NPグループ（黄色の矢印）よりも有意に高かった

ディスカッション

腫瘍の不均一性と複雑さを考慮すると、併用療法は腫瘍の臨床治療における標準的な戦略になっています[22]。それにもかかわらず、2つの薬剤の物理化学的および薬物動態学的特性が異なるため、2つの個別の治療法の単純な組み合わせが必ずしも期待される効果に達するとは限りません[23]。相乗的な比率で腫瘍細胞に異なる薬剤を送達するために、この研究では併用療法媒体が設計されました。 CDDPは親水性ですが、Tetは疎水性であるため、ローディング方法に問題が生じます。この研究では、疎水性コアとしてPCLを、親水性コロナとしてPEGを使用した両親媒性コポリマーを使用しました[14]。油層に配置されたTetと水層に配置されたCDDPの改良されたダブルエマルジョン法により、独特の構造により、NPにTetとCDDPを同時にカプセル化してNPを形成する能力が与えられます。 CDDPとTetはNPの異なる層に配置されているため、干渉効果が低く、安定性が高くなっています[24]。

CDDPとTetを搭載した併用療法ビヒクルは、CDDP-Tet併用の有効性を高めることができます。細胞実験だけでなく、CDDP-Tet NPは、HDRAアッセイで腫瘍組織の生存率を有意に阻害し、腫瘍微小環境を考慮したモデルでのNPの抗腫瘍効果を検証します[19]。インビボ研究に関しては、抗腫瘍効果が腫瘍体積変化において観察され、これは、CDDP-TetNPがより低い増殖レベルで腫瘍増殖を効果的に抑制したことを示した。 ¹⁸ FDG-PET / CTイメージングにより、CDDP-Tetグループの腫瘍のグルコース代謝は、腫瘍のより高いアポトーシスレベルを誘導することにより、より顕著かつ早期に阻害されることが明らかになりました。これは、免疫蛍光アッセイで確認されました[21]。無料のCDDPとTetを併用した場合と比較して、CDDP-Tet NPはより速く、より安全に有効になります。これは、次の3つのメカニズムによって説明できます。

第一に、脂溶性薬物として、TetはECMにほとんど分布できないため、腫瘍細胞の周囲に拡散することはめったにありません[9]。 NPの油相に位置するTetは、より優れた溶解性とバイオアベイラビリティを備えており、CDDPと同じ相乗効果で腫瘍部位に到達します。さらに、かつては全身性の副作用を持っていたCDDPは、ナノ粒子によって運ばれると、漏れやすい腫瘍血管から腫瘍組織の間質に容易に到達し、貧弱なリンパドレナージによる圧力のために腫瘍内に保持されます[25]。 CDDP腫瘍組織が多く保持されるほど、正常な臓器への損傷は少なくなります。受動的ターゲティング戦略の結果として、CDDP-Tet NPは、マウスの体重変化や肝生検で観察できる遊離CDDP + Tetよりもはるかに安全です。

薬剤耐性は、単一細胞レベルでの遺伝的変化だけでなく、腫瘍組織や微小環境による癌治療の最大の課題の1つと見なされています[26]。一方、Tetはアルカリ性であるため、酸性の腫瘍微小環境でプロトン化されるため、pH誘発性の生理的薬剤耐性と呼ばれる電気陰性の腫瘍細胞膜を通過できません[27]。一方、固形腫瘍の血管間の距離が大きく、間質液圧が高いと、CDDPとTetの分布が制限されます[28]。ナノビークルによって運ばれるTetは、腫瘍の微小環境の影響を受けることなくエンドサイトーシスを介して腫瘍細胞に侵入し、pHによって誘発される生理学的薬剤耐性を克服することができます。ナノキャリアのサイズが小さいため、腫瘍の血管系に入り、in vivoで腫瘍部位に優先的に蓄積します[29、30]。

要約すると、この研究は、化学療法薬と化学増感剤を同時に送達する例を表しています。 NPによって運ばれ、両方の薬は受動的に腫瘍部位を標的とし、全身毒性を低減します。さらに、NPは、化学療法剤が腫瘍細胞にますます速く入るのを助けることにより、生理学的薬剤耐性に対する解決策を提供します。これは、腫瘍化学療法の有効性を改善する上で重要な役割を果たします。したがって、このPEG-PCLブロック共重合体NPは、併用化学療法の有望な担体になる可能性があると考えました。

結論

私たちの以前の研究[8、14、16]に基づいて、この論文は、異なる物理化学的特性を持つ2つの薬物の組み合わせの送達のためのPEG-PCL / HO-PCLNPの適用を調査しました。インビトロ研究では、NPは優れた生体適合性を備えた優れた抗腫瘍効果を示しました。腫瘍体積の変化および ¹⁸ で、抗腫瘍効果の増強が観察されました。 マウスモデルでのinvivo研究に関するFDG-PET / CTイメージング。 NPsグループのマウスも副作用の減少を示しました。さらに、腫瘍細胞のアポトーシス率は、invitroおよびinvivo研究の両方でNPによって促進されました。要約すると、このブロック共重合体NPは、癌の治療のために、抗腫瘍効果を高め、毒性を低減した、シスプラチンとテトラドリンの組み合わせおよび他の組み合わせの送達のための有望な担体となる可能性があります。

データと資料の可用性

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

略語

Tet：

テトラドリン

CDDP：

シスプラチン

NP：

ナノ粒子

PEG–PCL：

ポリ（エチレングリコール）–ポリカプロラクトン

HO-PCL：

ポリカルプロラクトン

ECM：

細胞外マトリックス

PEG：

ポリエチレングリコール

RES：

細網内皮系

DMF：

ジメチルホルムアミド

SPF：

特定病原体除去

Mn：

数平均分子量

Mw：

重量平均分子量

DLS：

動的光散乱