生体適合性ナノ粒子デリバリーによるシスプラチン・テトラドリン併用療法の抗腫瘍効果増強

概要

併用療法は臨床腫瘍治療の標準戦略となっています。我々はテトラドリン（Tet）とシスプラチン（CDDP）の併用が顕著な相乗的抗癌活性を示すことを実証しましたが、避けられない副作用が治療濃度を制限しています。2薬剤の異なる物理化学的および薬物動態特性を考慮し、改良二重エマルション法で両薬剤をナノベヒクルに共封入しました。ナノ粒子（NP）はポリ（エチレングリコール）-ポリカプロラクトン（PEG-PCL）とポリカプロラクトン（HO-PCL）の混合物から調製され、CDDPとTetを同時にNP内に局在化させ、低干渉効果と高安定性を実現しました。蛍光顕微鏡画像により、NPによって親水性と疎水性の両薬剤が細胞取り込みされることが明らかになりました。異なる腫瘍細胞株と腫瘍組織でのin vitro試験で、腫瘍抑制率とアポトーシス率の増加が観察されました。in vivo試験では、NP群で優れた抗腫瘍効果と副作用軽減が観察されました。さらに、¹⁸FDG-PET/CTイメージングにより、NPが腫瘍の代謝活性をより顕著に低下させることが実証されました。本結果は、PEG-PCLブロック共重合体NPが、確かな効果と軽微な副作用で併用化学療法の有望なキャリアとなり得ることを示唆しています。

はじめに

腫瘍包括療法の発展に伴い、白金化合物は様々な癌治療で重要な役割を果たしており、中でもシスプラチン（CDDP）が臨床で広く使用されています。現在、CDDPは腫瘍免疫療法と組み合わせても重要であり、非小細胞肺癌（NSCLC）などの悪性腫瘍に好ましい効果を示しています。しかし、これらの化学療法薬は常に望ましくない毒性と引き換えに抗腫瘍活性を達成するため、毒性を低減し化学療法効果を高める治療薬が絶えず探求されています。テトラドリン（Tet）はビスベンジルイソキノリンアルカロイドの一種で、化学療法感受性向上に満足できる効果を示します。我々の先行研究で、TetとCDDPの併用が、切除修復相補グループ1（ERCC1）、チミジレートシンターゼ（TS）、β-チューブリンIIIなどの化学療法薬関連遺伝子発現を阻害することで、顕著な相乗的抗癌活性を持つことを実証しました。しかし、Tetの臨床応用はその難水溶性と低経口バイオアベイラビリティで困難を伴います。さらに、親水性CDDPは細胞外マトリックス（ECM）に最も容易に分布し、疎水性Tetは脂質膜を透過して細胞内輸送されるため、2薬剤を真に協働させることはできません。したがって、2薬剤を同時に効果的にデリバリーし、副作用を軽減しながら抗腫瘍効果を改善する方法を見つけることが不可欠です。

ナノテクノロジー分野の最近の進歩は、癌診断と治療のための新規アプローチを提供しています。両親媒性共重合体、特にポリエチレングリコール（PEG）で構築されたナノ粒子（NP）は、血清タンパク質付着の低減と網内系（RES）による取り込み防止能力で知られています。疎水性薬物を運ぶ場合、ナノキャリアは溶解性を巧みに高め、血中および腫瘍内での薬物滞在時間を延長・増加させます。共重合体NPの臨床使用に伴い、NPの生体適合性がますます注目されています。例えば、最近の知見では、注射された二酸化チタン、シリカ、金ナノ粒子が動物モデルで癌細胞の血管内侵入と血管外遊出を加速することが明らかになりました。優れた生体適合性と安全性を持つナノ材料、特にFDA承認済みのもので作られたNPは、薬物キャリアとしてより良い候補です。

予備的に、我々はCDDP担持NPと、ポリエチレングリコール-ポリ（カプロラクトン）（PCL-PEG）を用いたTet担持NPを構築し、それらのin vivo抗腫瘍効果を実証してきました。本研究では、PEG-PCLを用いてCDDPとTetの共デリバリーを行いました。近中性電荷を持つPEGはナノ粒子の親水性シェルを形成し、抗原エピトープを隠蔽し免疫学的反応を防止します。蛍光顕微鏡画像により、NPによって親水性と疎水性の両薬剤が細胞取り込みされることを実証しました。in vitro試験結果は、異なる腫瘍細胞株だけでなく腫瘍組織でも、CDDP-Tet NPが遊離薬剤より効果的に腫瘍増殖を抑制することを明らかにしました。in vivo研究では、NP群で抗腫瘍効果増強と副作用減少が観察されました。さらに、¹⁸FDG-PET/CTイメージングでNP群の腫瘍代謝率が最も低く、CDDP-Tet NPの腫瘍増殖抑制能力を示唆しました。

方法

材料

試薬と細胞

CDDP（分子式PtCl₂(NH₃)₂）を山東博源製薬有限公司（中国済南）から購入。テトラドリン（分子式C₃₈H₄₂N₂O₆）を純度>98%の粉末として江西宜博医薬開発公司（中国江西）から入手。メトキシポリエチレングリコール（MePEG；重量平均分子量Mw=4 kDa；南京ウェル化学有限公司、中国）をトルエンとの共沸蒸留で脱水し、50℃で12時間真空乾燥してから使用。ε-カプロラクトン（ε-CL；アルドリッチ、米国）を室温でCaH₂乾燥後、減圧蒸留で精製。ポリビニルアルコール（PVA；重合度=500、けん化度=88%；上海東倉国際貿易有限公司、中国）とスズ(II)オクタエート（分子式SnCl₂）（シグマ）をそのまま使用。RPMI 1640培地（Gibco、米国）、子牛血清（蘭州民海生物工程、中国）、ジメチルチアゾール-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（MTT；アマスコ、米国）をそのまま使用。

ヒト高分化胃癌細胞株MKN₂₈、ヒト結腸腺癌細胞株LoVo、ヒト子宮頸癌細胞株Hela、マウス肝腫瘍細胞株H₂₂を上海細胞生物学研究所（中国上海）から入手。すべての細胞株を10%牛血清、ペニシリン（100 U/mL）-ストレプトマイシン（100 µg/mL）、ピルビン酸、グルタミン、インスリン添加RPMI 1640培地で、37℃、水飽和雰囲気、5% CO₂で培養しました。

共重合体合成

先行研究で記載した通り、mPEG-PCLとHO-PCL共重合体を開環共重合で合成しました。簡単に言うと、所定量のε-CLをPEGと少量のスズ(II)オクタエート（0.1% wt/wt）を含む重合管に添加しました。管を真空系に接続、密封し、130℃の油浴で48時間加熱しました。HO-PCL共重合体合成では、所定量のε-CLとスズ(II)オクタエートを乾燥せずに重合管に添加しました。重合完了後、粗共重合体をクロロホルムで溶解し、過量の冷メタノールに沈殿させて未反応モノマーとオリゴマーを除去しました。沈殿物をろ過し、水で数回洗浄後、減圧で完全乾燥しました。

CDDP-Tet担持ナノ粒子調製

所定量のCDDPとTet担持ナノ粒子を二重エマルション（DE）法で調製しました。CDDPとTetを、5 mg mPEG-PCLと15 mg HO-PCLを含む1 mLジクロロメタン（DCM）溶液で、氷冷下15秒（15 W）超音波処理して乳化しました（溶液W1）。次に、3%（w/v）PVA溶液W2を4 mL添加し、30秒超音波処理してW1/O/W2エマルションを作製しました。二重エマルションを0.3%（w/v）PVA水溶液50 mLに希釈し、DCMを減圧蒸発させました。得られたナノ粒子を回収、洗浄、凍結乾燥しました（図1）。

薬物含有量と包接効率

薬物含有量を決定するため、凍結乾燥CDDP-Tet担持NP粉末をジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し、この溶液30 µLを2 mmol/L HCl 30 µLと混合し、さらに2 mmol/L HCl中の0.2 mmol/L SnCl₂溶液2.94 mLを添加しました。1時間後、検量線を参照して403 nmで吸光度を測定しました（島津UV-1205分光光度計、日本京都）。NP中の総薬物量を算出できます。薬物含有量と包接効率はそれぞれ以下の式で求めました：

薬物含有量（%）=（NP中の薬物重量）/（NP重量）×100%（1）

包接効率（%）=（NP中の薬物重量）/（投与薬物重量）×100%（2）

ナノ粒子のin vitro細胞毒性と生体適合性試験

細胞取り込み試験

先行研究に基づき、LoVo細胞を6ウェルプレートカバーに約5×10⁵ cells/wellで播種し、24時間インキュベートしました（37℃、5% CO₂）。ローダミンB（21 µg/mL）担持NPをウェルに添加しました。2時間インキュベーション後、プレートを4℃と37℃のPBSで各3-4回洗浄しました。カバーガラス上のLoVo細胞を蛍光顕微鏡で観察しました。

細胞毒性アッセイ

遊離CDDP、遊離Tet、遊離CDDP+Tet、CDDP-Tet担持NPのin vitro細胞毒性を、MKN28とH₂₂細胞株を用いた標準MTTアッセイで測定しました。簡単に言うと、細胞を96ウェルプレートに5000 cells/wellの密度で播種し、アッセイ24時間前に培養しました。次に、遊離CDDP、遊離Tet、遊離CDDP+Tet、CDDP-Tet担持NPの一連の用量に細胞を曝露しました。インキュベーション後、各ウェルに5 mg/mL MTT溶液20 µLを添加し、4時間インキュベートして生存細胞が黄色MTTを暗青色フォルマザン結晶に変換させ、200 µLジメチルスルホキシド（DMSO）で溶解しました。各ウェルの光学密度（OD）をELISAリーダー（ELX800 Biotek、米国）で測定し、試験波長490 nm、参照波長630 nmとしました。細胞生存率を以下の式で決定しました：

細胞生存率（%）=（OD（試験ウェル））/（OD（参照ウェル））×100%（3）

空白ナノ粒子のin vitro生体適合性もMKN₂₈とH₂₂細胞株を用いたMTTアッセイで測定しました。MTTアッセイから得られたすべての結果は、少なくとも3回の独立した実験で繰り返し、各回3重測定で確認しました。

アポトーシスアッセイ

アネキシンV-FITCキット（Bender MedSystem、米国）を用いて細胞アポトーシス率の変化を調べました。MKN₂₈細胞を6 cm培養皿で24時間培養しました。培地を1 µg/mL遊離CDDP、1 µg/mL CDDP担持NP、200 µg/mL空白NPでそれぞれ置換しました。対照群は薬物なし培地で置換しました。48時間培養後、酵素を添加しました。細胞を回収し、PBSで2回洗浄、100 µLバッファーで再懸濁しました。アネキシンV 5 µLとPI 1 µLを順次添加、混合し、遮光下室温で15分静置しました。400 mLバッファーを添加し、FCM（BD FACS CantoTM、米国）で細胞アポトーシス率を解析しました。

組織培養薬剤感受性試験（HDRA）

先行研究に従いHDRAを実施しました。簡単に言うと、雄ICRマウスを両腋窩に4-6×10⁶ H₂₂細胞を生理食塩水で皮下注射しました。腫瘍体積が400-600 mm³に達したら、マウスを頸椎脱臼で安楽死させ、新鮮検体を採取、生理食塩水で2回洗浄、ハンクス溶液に浸漬し、約15 mgの断片に分割しました。組織検体を24ウェルプレートに配置し、1 cm角ゼラチンスポンジを20%胎児牛血清とアミカシン硫酸塩（100 IU/mL）添加RPMI 1640培地に浸漬したものに、遊離CDDPまたはCDDP担持NPを2濃度で含ませました。4検体を薬物なしで培養し対照としました。組織を37℃、5% CO₂で7日間培養しました。I型コラゲナーゼ（100 µL、0.6 mg/mL）とMTT（100 µL、5 mg/mL）の混合液を100 mg/mLコハク酸ナトリウム中で調製し添加しました。さらに24時間インキュベート後、MTTフォルマザンを1 mL DMSOで抽出し、各ウェルから100 µL溶液を96ウェルマイクロプレートに移しました。各ウェルのODをELISAリーダーで試験波長490 nm、参照波長630 nmで測定しました。組織生存率を以下の式（4）で計算しました：

組織生存率（%）=（OD（試験）/重量（試験/mg））/（OD（対照）/重量（対照/mg））×100%（4）

in vivo抗腫瘍効果

腫瘍体積測定

体重18-20 gの雄ICRマウスにマウス肝腫瘍細胞株H₂₂を移植し、CDDP-Tet担持NPの相対効果を評価しました。特定病原体フリー（SPF）環境で飼育し、鼓楼病院動物ケア委員会承認ガイドラインに準拠しました。4-6×10⁶ H₂₂細胞を含む0.2 mL細胞懸濁液をマウス左腋窩に皮下注射しました。マウスを6群に分けました：対照群（生理食塩水）、空白NP群、遊離CDDP（3 mg/kg）群、遊離CDDP+Tet（CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg）群、CDDP-Tet担持NP（CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg）群。各群6匹ずつ。移植後7-8日で治療開始し、その日を「Day 0」としました。各動物を治療時に計量し、報告用mg/kg用量を達成するよう調整しました。実験期間中、隔日で体重測定しました。

免疫蛍光アッセイ

対照群、遊離CDDP+Tet群、CDDP-Tet NP群のマウス腫瘍組織を治療後21日目に組織学観察用に選択しました。腫瘍を剥離し、10%中性緩衝ホルマリンで固定、ルーチンパラフィン包埋、5 mm厚で切片化しました。組織切片を（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインダール）（DAPI、青）と末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング（TUNEL、緑）で染色後、ツァイスLSM510メタ共焦点顕微鏡で観察しました。

¹⁸FDG-PET/CTイメージング

遊離CDDP+Tet群とCDDP-Tet担持NP群のマウスを治療後6日目にPET/CTイメージングしました。トレーサー注射前4時間絶食しました。¹⁸F-FDG 14.8 MBq（400 µCi）を尾静脈から放射性トレーサーとして注射しました。ジェミニJXL（Philips、米国）結合PET/CTスキャナで画像を取得しました。¹⁸F-FDG投与45分後に高分解能PET画像と同視野CT画像を取得しました。PET画像をCTデータに基づき減衰補正と散乱補正しました。画像融合をベンダー供給ソフトウェアを用いた自動画像融合システムで実施しました。腫瘍での最大FDG取り込み値を取得し、体重と注射活性で補正した標準取り込み値（SUV）を算出しました。

統計手法

データの統計解析をStudentのt検定で実施しました。データを平均±SDで表示し、P<0.05を統計的有意差とみなしました。

結果

共重合体合成と特性評価

先行研究に基づき、PEG-PCLとHO-PCL（最適比率1:3）でNPを合成しました。最適PEG-PCL共重合体NPの直径、多分散性、数平均分子量（Mn）、重量平均分子量（Mw）を追加ファイル1: Table S1に示します。CDDPとTet担持時の薬物含有量と包接効率も測定しました（追加ファイル1: Table S2）、これらはCDDP担持PEG-PCL共重合体NPと類似しています。しかし、Tetの薬物含有量と包接効率はTet担持PEG-PCL共重合体NPより低く、これはHO-PCL成分に関連する可能性があります。

動的光散乱（DLS）により、CDDP-Tet担持PEG-PCL共重合体NPの直径は359.1±5.3 nm、多分散性約0.231でした。TEMとAFM観察（追加ファイル1: Fig S1a、S1b）では、NPが規則的な球形でDLSデータと一致する類似サイズを示しました。また、ナノ粒子内に微小液滴が分散しており、NPが確かに二重エマルション構造であることを確認しました。

CDDP-Tet担持NPの細胞取り込み

蛍光色素担持粒子を細胞取り込み探索の一般的手法として用い、視覚的リアルタイム検出を実現しました。色素担持NPがエンドサイトーシスで細胞内に入ることを実証しました。本研究では、ローダミンBは親水性でPI蛍光チャネルで検出可能で、CDDPを模倣しました。Tet模倣としてクマリン-6は疎水性で、その信号はFITC蛍光チャネルで受信可能です。クマリン-6とローダミンB担持NPと2時間共インキュベーション後、LoVo細胞を蛍光顕微鏡と光学レンズ（200倍）で検出しました。図2に示すように、PI蛍光チャネル、FITC蛍光チャネル、PI/FITC二重蛍光チャネルで蛍光信号が検出されました。結果は、NPがクマリン-6とローダミンBを同時に腫瘍細胞に運搬できることを確認し、これに基づきCDDPとTetがNPに担持され腫瘍細胞によって同時に取り込まれることを推測できます。

ナノ粒子のin vitro細胞毒性

胃癌細胞株MKN28で、遊離CDDP、遊離Tet、遊離CDDP+Tet、CDDP-Tet担持NPの細胞毒性を比較しました。Tet濃度はCDDP濃度の2.4倍としました。図3に示すように、4群中でCDDP-Tet担持NPの細胞毒性が最も強力でした。遊離TetとNP群、他3遊離薬剤群の細胞毒性差は濃度増加とともに顕著になりました。ヒト子宮頸癌細胞Helaと肝細胞癌細胞H₂₂でも類似結果が観察されました（追加ファイル1: Fig S2a、S2b）。

空白NPの毒性試験を先行研究で実施しました。先行研究では、空白NPが腫瘍細胞株にほとんど毒性を示さず、空白NPが満足のいく生体適合性を持つことを示しました。

CDDP-Tet担持NPのin vitroアポトーシス解析

1 µg/mL遊離CDDP、2.4 µg/mL遊離Tet、遊離CDDP+Tet（1 µg/mL + 2.4 µg/mL）、CDDP-Tet担持NP（1 µg/mL + 2.4 µg/mL）が、48時間共培養後のMKN28細胞アポトーシス率に及ぼす影響を測定しました。細胞アポトーシス率をQ2+Q4として計算しました（図4参照）。遊離CDDP+Tet、遊離CDDP、遊離Tet群間でアポトーシス率変化は類似していました（図4a-c）。しかし、CDDP-Tet担持NPによるMKN28細胞アポトーシス率は他3群より有意に高かったです（図4d）。

組織培養薬剤感受性試験（HDRA）

NPの抗腫瘍効果をより包括的に評価するため、HDRAを用いて遊離CDDP、遊離CDDP+Tet、CDDP-Tet担持NPのH₂₂細胞株に対する抗腫瘍効果を評価しました。化学感受性予測の臨床的手法として、HDRAは細胞実験よりも腫瘍組織の実践的条件をより本物らしくシミュレートし、その結果は薬物浸透、細胞外pH値、間質液圧などの腫瘍微小環境と微細構造の影響を受けます。

Tet濃度はCDDP濃度の2.4倍です。図5に示すように、最低濃度では遊離CDDP+Tet群の抗腫瘍効果が遊離CDDPより優れていましたが、薬物濃度増加とともに効果は類似しました。アポトーシス解析と一致して、CDDP-Tet担持NPはテストしたすべての濃度で3群中でかなり優れた抗腫瘍効果を示しました。

in vivo抗腫瘍効果解析

効果と副作用評価

H₂₂細胞株移植で形成したマウスモデルを、遊離CDDP 3 mg/kg、遊離CDDP+Tet（CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg）、CDDP-Tet担持NP（CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg）でそれぞれ治療しました。薬物治療12日後に腫瘍を採取しました。腫瘍サイズを2日ごとに検出し、最適薬物デリバリー含有量を決定しました。腫瘍増殖曲線（図6）に示すように、対照群と空白NP群の腫瘍増殖傾向は類似していましたが、薬物デリバリーを行った他3群で顕著な腫瘍抑制が見られました。遊離CDDP群と比較して、遊離CDDP+Tet群は最初の6日間でより良い抗腫瘍効果を示しました。しかし、6日後から2群間の腫瘍抑制率差は縮小し始め、10日後には遊離CDDP+Tet群の方が抗腫瘍効果が悪化しました。

最初の6日間、遊離CDDP+Tet群とCDDP-Tet担持NP群の抗腫瘍効果は類似していました。したがって、CDDP-Tet担持NP投与マウスは治療後6日目からより良い抗腫瘍効果を示しました。追加ファイル1: Figure S3aに各群の異なる腫瘍サイズを示します。CDDP-Tet担持NP群の腫瘍体積が最小で、顕著な抗腫瘍効果の直接的反映と見なせます。腫瘍抑制能に加え、遊離CDDPまたは遊離CDDP+Tet群と比較して、腫瘍表面の血管が少なかったです。同様に、追加ファイル1: Figure S3bに示すように、対照群と遊離CDDP+Tet群と比較してNP群で血管密度が最低でした。

in vivoで腫瘍組織中のアポトーシス細胞比率をさらに調査するため、TUNELアッセイでアポトーシス細胞を検出しました。図7に示すように、腫瘍内アポトーシス細胞が緑色蛍光で染色されアポトーシスを示しました。合成画像では、対照群と遊離CDDP+Tet群で緑色蛍光領域が少なく、アポトーシス細胞が少ないことを示しました。一方、CDDP-Tet NP治療群で大量の緑色蛍光領域が観察され、大量のアポトーシス細胞存在を示しました。結果は、CDDP-Tet NPがin vivoで腫瘍アポトーシスを促進することを確認しました。

遊離CDDPと遊離CDDP+Tet群より優れた抗腫瘍効果に加え、CDDP-Tet担持NPは副作用も少なく示しました。図8aに示すように、遊離CDDPと遊離CDDP+Tetは対照群と比較して有意な体重減少を引き起こし、直接薬物デリバリーの毒性を示しました。空白NP群の体重変化曲線は対照群と類似し、空白NP毒性は無視できることを示唆しました。CDDP-Tet担持NPと対照群の体重減少は最初の6日間で比較可能でした。6日から12日では、NP群マウス体重は対照群よりわずかに低かったが、遊離CDDPまたは遊離CDDP+Tet群より高かったです。特筆すべきは、遊離CDDP+Tet群が最初の4日間で明らかな体重減少と食欲低下を引き起こし、薬物吸収が全身に有害であることを示しました。対照的に、CDDP-Tet担持NPは組織内で徐放され濃度を安定維持できるため、直接薬物デリバリーと比較して副作用が明確に低減しました。次に、治療副作用を肝生検で評価しました（図8b）。対照群と比較して、二重遊離薬剤群では肝細胞境界が不明瞭、一部肝細胞に風船様変化、細胞体縮小、核濃縮、好酸球増加（黄色矢印）が見られました。一方、二重薬剤NP群では幹細胞構造が正常、細胞間隙明確、明らかな病理変化なし。これらの結果はNPデリバリーによる障害がほとんどないことを示唆しました。

PET-CT

各群のin vivo治療効果をより良く比較するため、治療後6日目にマウスでCT、PET/CTスキャンを実施しました。CTとPETスキャンの融合画像を図9に示します。PET/CTは¹⁸FDG取り込み検出による代謝変化反映に効率的な手法です。CTスキャン（図9）では、遊離CDDP+Tet群とCDDP-Tet担持NP群の腫瘍体積は比較可能でしたが（図9a）、遊離CDDP+Tet群の腫瘍代謝率はNP群より有意に高かったです（図9b）。CDDP-Tet担持NP投与マウスの腫瘍部位での強度低下は腫瘍の代謝率低下を象徴し、NPの腫瘍増殖抑制能力を示唆しています。

考察

腫瘍の異質性と複雑さを考慮すると、併用療法は臨床腫瘍治療の標準戦略となっています。しかし、2薬剤の異なる物理化学的および薬物動態特性により、単純な2個別治療薬の併用では必ずしも期待効果に達しません。相乗的比率で異なる薬剤を腫瘍細胞にデリバリーするため、本研究で併用療法ビークルを設計しました。CDDPは親水性、Tetは疎水性であり、担持法に問題を生じます。本研究では、PCLを疎水性コア、PEGを親水性コロナとする両親媒性共重合体を使用しました。改良二重エマルション法により、Tetを油層、CDDPを水層に局在化させ、独自構造がTetとCDDPの同時包接を可能にしNPを形成しました。CDDPとTetがNPの異なる層に局在するため、低干渉効果と高安定性が得られます。

CDDPとTet担持併用療法ビークルはCDDP-Tet併用効果を増強できます。細胞実験だけでなく、HDRAアッセイで腫瘍組織生存率も有意に抑制し、腫瘍微小環境を考慮したモデルでのNP抗腫瘍効果を検証しました。in vivo研究では、腫瘍体積変化で抗腫瘍効果が観察され、CDDP-Tet NPが低増殖レベルで腫瘍増殖を効果的に抑制することを実証しました。¹⁸FDG-PET/CTイメージングで、CDDP-Tet群腫瘍のブドウ糖代謝がより顕著かつ早期に抑制され、より高い腫瘍アポトーシスレベル誘導により確認されました。免疫蛍光アッセイで確認されました。遊離CDDP+Tetと比較して、CDDP-Tet NPはより速く安全に効果を発揮し、これは以下3機構で説明できます。

第一に、脂溶性薬物としてTetはECMに分布しにくく、腫瘍細胞周囲に拡散しにくいです。NP油相に局在することで、Tetはより良い溶解性とバイオアベイラビリティを得て、CDDPと同じ相乗的比率で腫瘍部位に到達できます。さらに、全身副作用を持っていたCDDPが、ナノ粒子により担持されると、漏出性腫瘍血管から腫瘍組織間質に容易に到達し、機能不全リンパ管排泄による圧力で腫瘍内に保持されます。腫瘍組織がより多くのCDDPを保持すれば、正常臓器へのダメージは少なくなります。受動的標的戦略の結果として、CDDP-Tet NPは遊離CDDP+Tetよりはるかに安全で、マウス体重変化と肝生検で観察できます。

薬物耐性は癌治療最大の課題の一つと見なされており、単一細胞レベルの遺伝的変化だけでなく、腫瘍組織と微小環境も原因です。一方、Tetはアルカリ性であるため、酸性腫瘍微小環境でプロトン化され、電気陰性腫瘍細胞膜を通過できなくなります。これはpH誘導生理的薬物耐性と呼ばれます。他方、固形腫瘍の血管間距離大と高間質液圧がCDDPとTetの分布制限に寄与します。ナノベヒクルにより担持されると、Tetはエンドサイトーシスで腫瘍細胞内に入り、腫瘍微小環境の影響を受けずにpH誘導生理的薬物耐性を克服できます。ナノキャリアの小さなサイズにより、腫瘍血管内に入りin vivoで腫瘍部位に優先的に蓄積できます。

要約すると、本研究は化学療法薬と化学感受性剤を同時にデリバリーする例を示しています。NPにより担持された両薬剤は腫瘍部位に受動的に標的化され、全身毒性を低減します。さらに、NPは化学感受性剤がより多く速く腫瘍細胞内に入るのを助け、生理的薬物耐性の解決策を提供し、腫瘍化学療法効果改善に重要な役割を果たします。したがって、このPEG-PCLブロック共重合体NPは、併用化学療法の有望なキャリアとなり得ると考えられます。

結論

先行研究に基づき、本論文では物理化学的特性の異なる2薬剤併用デリバリーへのPEG-PCL/HO-PCL NP応用を調査しました。in vitro研究では、NPが優れた生体適合性で優れた抗腫瘍効果を示しました。in vivoマウスモデル研究では、腫瘍体積変化と¹⁸FDG-PET/CTイメージングで抗腫瘍効果増強が観察されました。NP群マウスも副作用軽減を示しました。さらに、NPにより腫瘍細胞アポトーシス率がin vitroとin vivo両方で促進されました。まとめると、このブロック共重合体NPは、シスプラチン-テトラドリン併用および他の併用療法のデリバリーに、抗腫瘍効果増強と毒性低減で有望なキャリアとなり得ます。

データと材料の入手可能性

本研究で使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要請があれば責任著者から入手可能です。

略語

Tet:

テトラドリン

CDDP:

シスプラチン

NP:

ナノ粒子

PEG-PCL:

ポリ（エチレングリコール）-ポリカプロラクトン

HO-PCL:

ポリカプロラクトン

ECM:

細胞外マトリックス

PEG:

ポリエチレングリコール

RES:

網内系

DMF:

ジメチルホルムアミド

SPF:

特定病原体フリー

Mn:

数平均分子量

Mw:

重量平均分子量

DLS:

動的光散乱