DNAから作られた強力な抗腫瘍免疫刺激性生体適合性ナノヒドロゲル

要約

非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドは、Th1型抗原特異的T細胞応答を誘導することにより、自然免疫系と獲得免疫系の両方を活性化する強力な免疫刺激モチーフですが、血清中の不安定性は免疫刺激効率に大きく影響します。ここでは、マルチプライム鎖増幅を介してCpG-MCAナノヒドロゲルと呼ばれるCpGユニットのタンデムリピート配列からなる新規免疫DNAナノヒドロゲルを構築しました。 CpG-MCAナノヒドロゲルは、分解に抵抗し、マウスマクロファージ様RAW264.7細胞の増殖と遊走を増加させることが証明されました。さらに、CpG-MCAナノヒドロゲルは、腫瘍壊死因子-αおよびインターロイキン-6の高発現を効果的に誘導し、U251細胞の増殖を著しく阻害し、CpG-MCAナノヒドロゲルが強力な抗癌免疫刺激剤として使用されることが期待されることを示唆しています。 / P>

はじめに

非メチル化CpGモチーフを含む細菌DNAは、非常に有望なワクチンアジュバント、抗アレルゲン、免疫防御剤および抗がん剤です[1]。樹状細胞（DC）、マクロファージ、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞などの免疫系細胞内のエンドソーム上の受容体によって認識される可能性があります[2]。これらの自然免疫細胞は、病原性微生物の病原体特異的分子に対する病原体関連分子パターン（PAMP）の認識を通じて、非メチル化CpGモチーフに応答することができます。 CpGオリゴデオキシドミン（CpG-ODN）は、トール様受容体9（TLR9）[3]によって認識され、Myd88依存性シグナル伝達経路を介してTh1型免疫応答を誘導することが確認されています[4]。しかし、CpG-ODNのこれらの欠点は、タンパク質吸着による未成熟、血清中のエンドヌクレアーゼによる消化[5]、およびin vivoでの不安定性のために、その臨床応用を妨げました。これらの問題は、一本鎖（ss）核酸をデリバリーキャリアにカプセル化するか、自己組織化してナノ構造にすることで解決することが期待されます。現在、カチオン性ポリマーポリエチレンイミン（PEI）[6]、リポソーム[7、8]、微粒子[9]などのさまざまな担体がCpG-ODNの送達に利用されています。細胞毒性、負荷率の制限など、まだ改善されていないいくつかの欠点があります。

核酸で構成されたDNA材料は、CpG-ODNを送達する担体として使用できる大きな可能性を示しています。 ssDNAと比較して、2次元または3次元構造のDNA材料は、細胞膜への容易な浸透やサイトカインを分泌するマクロファージの刺激など、さまざまな特性を示します[10]。 X字型DNAを利用して、CpGモチーフを送達し、細胞取り込みの増加によってCpG-ODNの免疫刺激活性を正常に増加させましたが、細胞取り込みの増加は、X字型構造に部分的に起因しています[11]。同様に、均一なサイズのナノ構造に自己組織化できる3次元DNA四面体は、非侵襲的かつ効率的にRAW264.7細胞に入力されて機能しました。さらに、このような四面体は、研究[12]によると、機械的に安定しており、細胞毒性がないことが証明されています。最近、ローリングサークル増幅（RCA）によって調製されたナノフラワー構造のCpG-RCAヒドロゲル（CpG-RCAゲル）は、免疫刺激シグナルを伝達し、ヌクレアーゼ分解に抵抗し、免疫サイトカインの分泌を増加させることができることが実証されました。ヒト急性リンパ性白血病Tリンパ球（CCRF-CEM）細胞の増殖を阻害します[13]。これらの上記の結果は、DNA材料の形状と構造が細胞への取り込みを促進し、免疫刺激効率を高める上で重要な役割を果たしていることを示唆しています。 CCRF-CEM細胞は、血液悪性腫瘍の一種であるヒトTリンパ芽球白血病に由来するため、血液悪性腫瘍とは異なります。固形腫瘍は、有効な抗腫瘍免疫を妨げる可能性のある免疫抑制微小環境に囲まれていることがよくあります[14]。このために、RCA [16]ではなくマルチプライムチェーン増幅（MCA）[15]を介して、CpG-ODNのコピーをはるかに多く含むDNA免疫賦活剤を構築しました。相補的な塩基対形成の原理を利用して、CpGが関与するプライマーと特別に設計されたテンプレート配列をリガーゼに混合し、遊離dNTPの存在下でphi29ポリメラーゼによって伸長させました。 RCA（R）またはMCA（M）が x に反応しましたまたは y RxまたはMyとして個別に表される時間（図1）。製品はアガロースゲル電気泳動で同定されました（図2a）。 MCA反応に基づいて、CpGモチーフのコピーが大幅に増加したために数百または数千のタンデムCpGを有するCpG-MCAヒドロゲル（CpG-MCAゲル）と呼ばれる得られた製品。 CpG-MCAゲルは、RAW264.7細胞からのサイトカインの分泌を有意に増加させ、ヒト神経膠腫U251細胞株の増殖を効果的に阻害する強力な免疫刺激剤でもありました。この研究は、DNA材料に基づく新しいナノヒドロゲル免疫刺激剤に伝導性があり、腫瘍免疫療法への応用を促進することを期待していました[17]。

メソッド/実験

資料

すべてのオリゴヌクレオチドはSangonBiotech（Shanghai）Co.、Ltd。から購入し、高速液体クロマトグラフィーで精製しました。 dNTPセット（各100 mM）、phi29 DNAポリメラーゼ（10 U /μL）、および10×phi29 DNAポリメラーゼ反応バッファー（330 mMトリスアセテート（37°CでpH 7.9）、100 mM酢酸マグネシウム、660 mM K酢酸塩）、1％（ v / v ）Tween 20、10 mM DTT）は、Thermo Fisher Scientific（米国、マサチューセッツ州ウォルサム）から購入しました。 T4 DNAリガーゼ（400 U /μL）、5'-トリフォサデニン（ATP）、および10×T4 DNAリガーゼ反応バッファー（50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl ₂ 、1 mM ATP、10 mM DTT、25°CでpH 7.5）は、New England Biolabs、Inc。（マサチューセッツ州、イプスウィッチ）から購入しました。シアニン5-dCTPは、PerkinElmer、Inc。（米国、マサチューセッツ州ウォルサム）から購入しました。 Amicon Ultra-0.5遠心フィルターデバイスは、Merck KGaA（ダルムシュタット、ドイツ）から購入しました。この論文で使用された水は、ミリポアシナジーUV超純水浄化システムによって浄化されました。ギブコウシ胎児血清（FBS）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、高グルコース、L-グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム、HEPESなし）、トリプシン-EDTA（0.25％）、およびペニシリン（10000 U / mL）-ストレプトマイシン（10000μg/ mL）はThermo Fisher Scientific（米国マサチューセッツ州、ウォルサム）から購入しました。 ELISAキットはR＆D Systems、Inc。から購入しました。CellCountingKit-8（CCK-8）はDojindo（熊本、日本）から購入しました。マウスマクロファージ様細胞株（RAW264.7細胞）は、中国科学院（上海、中国）の細胞バンクから入手しました。ヒト神経膠腫細胞株（U251細胞）は、中国科学院（上海、中国）の細胞バンクから入手しました。

環状DNAテンプレートの準備

5 '末端にリン酸化基を持ち、CpG-ODNプライマー（プライマー1）の比率が等しい長い一本鎖DNAを1×phi29反応バッファーで混合し、95°Cで5分間アニーリングし、ゆっくりと4°Cまで冷却しました。サーマルサイクラー（Bio-Rad T100、ドイツ）を使用した-1°C / sの速度。アニーリング後、ATPおよびT4DNAリガーゼ反応バッファーを含む20U /μLT4DNAリガーゼを添加し、4℃で一晩インキュベートしました。酵素は75°Cで10分間不活性でした。

CpG-MCAゲルおよびCpG-RCAゲルの調製

環状DNAテンプレート（10μL）を1×phi29 DNAポリメラーゼ反応バッファー、それぞれ4 mM dNTPと混合し、5 U phi29DNAポリメラーゼと滅菌DDWを合計50μL添加しました。混合物を30℃で12時間振とうしながらインキュベートした（R12）。 MCAゲルを形成するために、4時間のRCA反応後、500 pMのプライマー2とプライマー3をそれぞれ得られた混合物に加え、試薬（R4M4とR4M8）を追加せずに30°Cで残りの時間インキュベートしました。 phi29ポリメラーゼは65°Cで10分間不活化されました。 CpG-RCAゲルとCpG-MCAゲルは限外濾過によって精製されました。

CpG-MCAゲルとCpG-RCAゲルの濃度

CpG-MCAゲルとCpG-RCAゲルの濃度は、治療群のすべてのヒドロゲルに含まれるCpGコピーの数に基づいて測定されました。反応システムに追加されたdNTPはそれぞれ4mMであったため、1つの円形テンプレートには81ヌクレオチドと1コピーのCpGが含まれていました。 Absが260nmおよびεでのdNTPの吸光度である場合は260nmでのdNTPの吸光係数であり、反応で消費されたdNTPを測定し、CpGの総コピー数を次の式で計算できます。CpGコピー数=（4mM×4− Abs / ε ×1,000,000）/ 81 [13]。腹筋とε dNTPの量はNanoDrop2000cで測定されました。

アガロースゲル電気泳動

アガロースゲル電気泳動を使用して、CpG-MCAゲルの形成と分解、および円形テンプレートの形成を評価しました。ヒドロゲルは1％アガロースゲルで100 Vで60分間泳動し、円形テンプレートは3％アガロースゲルで100 Vで60分間泳動しました。

CpG-MCAゲルおよびCpG-RCAゲルの特性評価

透過型電子顕微鏡法（TEM、日立HT7700、日本）を使用して、CpG-MCAゲルの内部構造とおおよそのサイズを特徴付けました。 CpG-MCAゲルは、銅上に堆積して乾燥する前に、30分間超音波で検査しました。試験は、蓮司病院のセンターラボで実施されました。走査型電子顕微鏡（SEM、日立SU8020、日本）を使用して、CpG-MCAゲルの形態を取得しました。 CpG-MCAゲルは、超音波で30分間検査された後、きれいなシリコンウェーハ上に堆積され、サンプルはAuで金属コーティングされました。

共焦点顕微鏡イメージング

細胞の取り込みは、ライカ共焦点顕微鏡で画像化されました。 RAW264.7細胞を2×10 ⁵ の密度で共焦点ペトリ皿に播種しました細胞/ mL。リン酸緩衝液（PBS）で2回洗浄した後、細胞を100 nM Cy5標識CpG-ODN、CpG-RCAゲル、およびCpG-MCAゲルとともに、新鮮なDMEM培地で37°で2時間インキュベートしました。次に、細胞をPBSで3回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで30分間固定した後、細胞をFITC-ファロイジンとHoechst33342で染色しました。すべての画像はLeicaレーザー共焦点顕微鏡を使用して撮影しました。平均蛍光強度の半定量は、画像を分析するためのJavaベースのアプリケーションであるImageJによって計算されました。

ELISAアッセイ

RAW264.7細胞を7×10 ⁴ の密度で播種しました使用前に24時間培養した24ウェルプレートの細胞/ mL。細胞をCpG-MCAゲルおよび他のグループの存在下、37°CでTNF-αの場合は8時間、IL-6の場合は24時間インキュベートしました。上澄みを集めた。上清中のサイトカインのレベルは、メーカーが提案したプロトコルに従って、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によって検出されました。

遺伝子発現アッセイ

遺伝子発現レベルは、定量的リアルタイムPCR（Q-PCR）によって分析されました。 RAW264.7細胞を1×10 ⁶ の密度で播種しました使用前に24時間培養した6ウェルプレートの細胞/ mL。細胞は、CpG-MCAゲルおよびその他のグループの存在下、37°CでTNF-αおよびTLR9の場合は2時間、IL-6などの場合は8時間インキュベートされました。 TRIzol試薬（Thermo Fisher Scientific）を使用して、mRNAの単離と精製を行いました。抽出されたmRNAはNanoDrop2000cによって定量化されました。 PrimeScriptRT試薬キットとgDNAEraser（Takara Bio Inc.）を使用して、1マイクログラムのトータルRNAを逆転写しました。 TB Green Premix Ex Taq II（Takara Bio Inc）を製造元の指示に従って使用し、総反応量20μLで増幅を行いました。遺伝子のプライマーは次のとおりです。GAPDH：F：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG; R：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; TLR9：F：ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT; R：GAGGCTTCAGCTCACAGGG; TNF-α：F：GACGTGGAACTGGCAGAAGAG; R：TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG; IL-6：F：CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC; R：CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT; CD86：F：GAGCTGGTAGTATTTTGGCAGG; R：GGCCCAGGTACTTGGCATT; CD206（MRC1）：F：CTCTGTTCAGCTATTGGACGC; R：CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC。

スクラッチ創傷移行アッセイ

RAW264.7細胞を5×10 ⁵ の密度で70μLに播種しました使用前に24時間培養インサート中の細胞/ mL。次に、インサートを慎重に取り外し、細胞を2回洗浄してから、新しい培地で各グループで処理しました。写真は0時間、6時間、24時間に収集されました。傷の面積はImageJによって測定されました。各グループには3回の繰り返しがあり、実験は3回繰り返されました。

細胞毒性アッセイ

細胞毒性はCCK8を使用してアッセイされました。 RAW264.7細胞を96ウェルプレートに播種し、各グループで24時間処理しました。次に、10μLのCCK8溶液を各ウェルに加え、37℃で1〜2時間インキュベートしました。吸光度は450nmで測定され、各グループには3回の繰り返しがあり、実験は3回繰り返されました。

RAW264.7細胞と共培養されたU251細胞

RAW264.7細胞を上部チャンバーに播種し、U251細胞を下部チャンバーに別々に播種し、処理前に24時間インキュベートしました。 PBSで3回洗浄した後、新鮮な培地中の1μMGpC-ODN、CpG-ODN、CpG-RCAゲル、およびCpG-MCAゲルを、指定された時間、上部チャンバーと下部チャンバーの両方に添加しました。下部チャンバーのU251細胞を収集し、プレートクローニング実験を実施しました。

プレートクローン形成アッセイ

RAW264.7細胞と共培養したU251細胞増殖への影響をプレートクローニング実験で分析しました。下部チャンバーのU251細胞を収集し、15％FBSを含むDMEMで複数の比率で希釈し、6ウェル培養プレートで最終数200細胞/ウェルにし、クローンクラスターが観察されるまで2週間培養を続けました。裸眼（50細胞/クローン以上）。 PBSで穏やかに洗浄した後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで30分間固定し、クリスタルバイオレットで1時間染色しました。 50を超える細胞を含むクラスターは、成功したクローン形成としてカウントに含まれます。実験は3回繰り返され、各実験には3つの繰り返しウェルがありました：クローン形成率=（クローン形成数/接種細胞数）×100％。

CpG-MCAゲルおよびCpG-RCAゲルの安定性

凍結乾燥したCpG-MCAゲルまたはCpG-RCAゲルを、それぞれ10％ウシ胎児血清（10％FBS-DMEM）を含む400μLのDMEMに入れ、37°Cで24時間インキュベートしました。上清中のDNA濃度は、1000rpmで10秒間遠心分離した後、NanoDrop2000cで測定しました。残りのヒドロゲルは、上清中のDNA濃度に従って計算されました。残りのゲル=（ m − c × V ）/ m ×100％、ここで m 追加したゲルの質量、 c は上清中のDNA濃度であり、 V 上澄みの量です。 CpG-MCAゲルまたはCpG-RCAゲルをそれぞれ10％FBS-DMEMまたはPBSに入れ、37°Cで12時間または24時間インキュベートしました。インキュベーション後、ゲルを1％アガロースゲルで100Vで60分間泳動しました。

CpG-ODN

一本鎖CpG-ODNは、Sangon Company（北京、中国）によって合成され、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して精製されました。この研究で使用されたCpG-ODNはCpG-ODN1668 [18]：5'-TCCATGACGTTCCTGATGCTであり、非CpGオリゴヌクレオチドはGpC-ODN [18]：5'-TCCATGAGCTTCCTGATGCTと名付けられました。

統計分析

この研究のすべてのデータは、2回または3回の独立した実験からの平均値±標準偏差（平均±SD）として表されます。異なるグループ間の統計分析は、学生の t を通じて実行されました。テスト。統計的有意性は P に設定されました <0.05（95％信頼水準）。

結果と考察

DNA免疫賦活剤はMCA反応によって首尾よく構築されました[16]。この反応では、等温増幅の前の最初の重要なステップは、長い一本鎖（ss）テンプレートの環化反応です（スキーム1）。アガロースゲル電気泳動を使用して、アニーリングおよびプライマーとのライゲーション後の環状DNAの形成を確認しました（追加ファイル1：図S1）。テンプレートがサイクルになり、プライマーとライゲーションした後に構造が変化したため、プライマーと長いssDNAテンプレート間の移動距離が短くなりました。 MCA反応には一連の繰り返し単位が直列に含まれており、連続巻きによりナノフラワーが簡単に出現します（スキーム1）。アガロースゲル電気泳動の結果は、RCA反応（CpG-RCAゲルまたはR12）およびMCA反応（CpG-MCAゲルまたはR4M4 / R4M8）の生成物が正常に得られたことを示しています（図1a）。 CpG-RCAゲルおよびCpG-MCAゲルは、アガロースゲルを通過するのが困難であり、ホームポジションでの保持を維持しました。どちらのゲルも粘着性が強すぎたため、ピペッティング時にシルクとして引き抜かれました（追加ファイル1：図S2A–C）。これらの結果は、DNAテンプレートが遊離dNTPで指数関数的に増幅されてヒドロゲルを形成することを示唆しています[15]。移動距離は、CpG-RCAゲルとCpG-MCAゲルの間に有意差がなかったことは言及する価値があります。さらに、SEMおよびTEMの結果は、CpG-RCAゲル（図1b、e）およびCpG-MCAゲル（図1c、d、f、およびg）の直径がナノスケールからマイクロメートルスケールの範囲であることをさらに示しました。ナノフラワーの形態を示した。 CpG-ODNは、TLR9陽性免疫細胞に内在化され、免疫細胞内のエンドソームに局在するTLR9と相互作用して、免疫刺激活性を発揮する必要があります。このために、Cy5標識CpG-ODN、CpG-RCAゲル、およびCpG-MCAゲルを使用して、共焦点顕微鏡を使用してRAW264.7細胞への取り込みを調べました。図2aで観察されたように、Cy5標識CpG-MCAゲルは効果的に内在化され、RAW264.7細胞の細胞質に分布していました。測定された平均蛍光強度に基づいて、CpG-MCAゲルの取り込み効率は大幅に増加しました（ P <0.0001）CpG-ODNと比較して（図2b）、より強力な免疫刺激を発揮するのに有利なCpG-MCAゲルの効果的な取り込みを示しています。マウスマクロファージRAW264.7細胞によるDNAの取り込みは、さまざまなDNAナノ構造を設計することによって増加したことが報告されています。テトラポッドのような構造化されたDNA（テトラポドナ）、テトラヘドラルDNA（四面体）、正方晶DNA（テトラゴン）など[19]。同様に、X字型DNA、Y字型DNA、X-DNAヒドロゲルも、細胞によるDNAの取り込みを増加させることが証明されています[20、21]。これらの結果は、DNAの高次構造が機能化されたDNAフラグメントを送達するためのより効率的な形態であることを示唆しました。したがって、本発明者らは、ゲル形成によるCpG-MCAゲルの形状の変化に由来するCpG-MCAゲルの高い細胞取り込みが推測された。次に、CpG-MCAゲルの安定性をテストしました。 CpG-MCAゲルは、さまざまな溶液中で37°Cでさまざまな時間インキュベートされました。アガロースゲル電気泳動の結果は、CpG-MCAゲルがPBS溶液中で比較的安定しており、培地を含む血清で部分的に分解されたことを示しています（追加ファイル1：図S3A）。 CpG-MCAゲルは、不完全な分解を示唆する単一のバンドではなく、はしごのように見えました。その後、10％FBS-DMEMでのゲルの安定性を調査しました。 TEMの結果により、CpG-MCAゲルは部分的に消化され、花のようには見えなくなりましたが、形状は保持されていることが確認されました（追加ファイル1：図S2D–F）。 CpG-MCAゲルの分解曲線は、24時間以内に上清中のDNA濃度を検出することによってプロットされました（追加ファイル1：図S3B）。 10％FBS-DMEMで24時間培養した後、R12は80％近くを保持し、R4M4とR4M8は85％近くを維持し、アガロースゲル電気泳動の結果と一致することが実証されました。ゲルの分解を確認するために、CpG-MCAゲルを血清中で37°Cで最大48時間インキュベートし、分解の生成をアガロースゲル電気泳動で行いました（追加ファイル1：図S4）。ゲルは血清中の酵素によって断片に消化されて粘度を失い、一塩基多型になったため、もはやはしごのようには見えません。これは、CpG-MCAゲルがウシ胎児血清の存在下で消化できるため、生分解性であることを示唆しています（ FBS）。したがって、CpG-MCAゲルは、24時間以内に血清消化に効果的に抵抗し、最終的に完全に分解されます。分解に抵抗する高い能力は、その免疫刺激効率を改善するのに役立ちます。 RAW264.7細胞の上清におけるTNF-αとIL-6の発現レベルも、CpG-MCAゲルが細胞を効果的に刺激して免疫サイトカインを産生する可能性があることを明確に示しています。

CpG-MCAゲルの免疫刺激効果をさらに評価し、RAW264.7マクロファージをGpC-ODN（シーケンスがGACGTTからGAGCTTに変更）[22]、CpG-ODN、CpG-RCAゲル、およびCpG-で処理しました。 MCAがゲル化し、TNF-αとIL-6の発現を検出しました。 CpG-RCAゲル（R12）およびCpG-MCAゲル（R4M4およびR4M8）と8時間インキュベートしたRAW264.7細胞の上清中のTNF-αの濃度は、CpG-ODNよりもはるかに高いレベルのTNF-αを誘発しました。同じ治療濃度（図3a）。 CpG-MCAゲルの場合、R4M4ではなくR4M8が、より高いレベルのTNF-α分泌を誘導しました（ P <0.001）、コピーが増加するにつれてTNF-α分泌が増強されたことを示唆しています。さらに、R4M8は有意に（ P <0.001）R12よりもTNF-αの濃度が高いことは、総反応時間が等しい場合、CpG-MCAゲルがCpG-RCAゲルよりも強力な刺激剤であることを示しています。同じ傾向がIL-6の検出にも見られました（図3d）。 CpG-MCAゲルおよびCpG-RCAゲルによって刺激されたIL-6の分泌は有意に増加しました。 R12、R4M4、およびR4M8グループでのIL-6の分泌は2.97倍でした（ P <0.0001）、4.39回（ P <0.0001）、27.81回（ P それぞれ、CpG-ODNグループの<0.0001）。 R4M8グループのIL-6の分泌は6.33倍でした（ P <0.0001）R4M4グループで記録されたものの9.36回（ P <0.001）R12グループに記載されているもの。 IL-6の分泌は、CpG-ODN、GpC-ODN、および対照群の間で有意差がなかったことは言及する価値があります。これらの結果は、放出されたTNF-αおよびIL-6のより高い効率が、CpG-ODNからではなくCpG-MCAゲルで処理されたRAW264.7細胞から観察されたことを確認した。さらに、異なる濃度のCpG-MCAゲルがサイトカイン分泌に及ぼす影響も調べたところ、ゲルの濃度とともにTNF-αとIL-6の分泌が増加することがわかりました（図3b、e）。非CpGゲル（図3cではR12-C、R4M4-C、およびR4M8-Cとして示されている）とGpC-ODNの免疫刺激能力の結果は、TNF-αの分泌をほとんど誘導しないことを示しました（図3c）。 3c）、CpG-MCAゲルによって誘導される免疫応答がCpGモチーフに起因することを示しています。

次に、サイトカイン、細胞表面マーカー、TLR-9のmRNA発現をテストしました。 CpG-ODN群のTNF-αmRNAは対照群で検出された発現の1.25倍であり、R12、R4M4、およびR4M8群の倍率変化は3.28倍でした（ P <0.01）、2.53倍（ P <0.05）、4.57倍（ P <0.001）CpG-ODNグループで個別にテストしたもの（追加ファイル1：図S5A）。CpG-ODNグループのIL-6のmRNA発現は、コントロールグループの1.01倍でした。 R12、R4M4、およびR4M8グループのIL-6 mRNA発現は3.87倍でした（ P <0.01）、4.63倍（ P <0.05）、23.04回（ P <0.0001）それぞれCpG-ODNグループのそれと同じです（追加ファイル1：図S5B）。

細胞内のCpGの受容体であるTLR-9のmRNA発現[4]も、コントロールグループと比較してすべてのグループで増加しましたが、CpG-MCAゲルグループはCpGと比較してTLR-9のmRNA発現を著しく増強しました-ODNグループ（追加ファイル1：図S5C）。サイトカインとTLR9に加えて、共刺激分子（CD）CD86とCD206も検出されました。これらは、それぞれ炎症誘発性（M1）マクロファージと成長促進（M2）マクロファージのタグ付けに使用されました[23]。 CD86またはCD206のいずれにおいても、CpG-ODNグループとコントロールグループの間に有意差はないことがわかりました（追加ファイル1：図S5D、E）。 CpG-RCAゲルグループと比較して、CpG-MCAゲルグループのCD86はさまざまな程度で増加し、CD206はさまざまな程度で減少し、R4M8グループは最も増加および減少し、RAW264.7細胞がCpG-MCAゲルで処理されたことを示唆していますCD86表面マーカーでM1集団に分化する傾向があり、CpG-MCAゲルの免疫刺激能力がさらに検証されました。

マクロファージからのサイトカインの分泌は、免疫刺激の応答、ならびにマクロファージの増殖および移動において非常に重要です。 CpG-ODNによるマクロファージの刺激は、TLR9依存性経路を介した抗炎症性サイトカインの産生を増加させます。 CpG-ODNによって誘導されるサイトカインは、細胞周期の負の調節因子の発現をダウンレギュレートすることにより、マクロファージの遊走を増加させ、マクロファージの増殖を促進しました[24]。 CpG-ODNはまた、マクロファージでプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤タイプ1（PAI-1）の発現を誘導し、その結果、ビトロネクチンを介した遊走が促進されました[25]。また、マクロファージの移動を促進し、細胞毒性を評価するCpG-MCAゲルの能力についても調査しました。 RAW264.7細胞の遊走は、トランスウェル遊走システム（図4a）と引っかき傷の遊走アッセイ（図4b）の両方でCpG-MCAゲルによって誘導されました。 RAW264.7細胞をCpG-MCAゲルの存在下または非存在下で培養し、24時間遊走させました。 CpG-MCAゲルグループのマクロファージの移動数は、CpG-ODNグループの移動数よりはるかに多かった（図4a）。次に、引っかき傷の移動アッセイに進みました。細胞を24時間移動させ、0時間、6時間、24時間で写真を撮影しました。結果は、創傷が治癒するにつれて引っかき傷の面積が減少することを示した。 6時間でのマクロファージの移動は、創傷治癒率が高いため、CpG-MCAゲルがCpG-ODNグループよりも効果的であることを示しましたが、R12、R4M4、およびR4M8グループ間で明確な重要性はありません（追加ファイル1：図S6A、B）。また、24時間のスクラッチ領域では、CpG-ODNグループのスクラッチ領域の治癒率が1.70倍（ P ）であることが確認されました。対照群の<0.05）であり、R12、R4M4、およびR4M8群の治癒率は1.63倍（ P ）でした。 <0.001）、1.63倍（ P <0.0001）、および2.23倍（ P < 0.0001) of that measured in the CpG-ODN group separately. The healing rate in the R4M8 group was 1.36 times (P < 0.01) of that in the R12 group. CpG-MCA gels strongly promoted the migration of RAW264.7 cells compared to that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 4c). In addition, RAW264.7 cells were cultured with a series concentration of gels for 24 h. We found that the CpG-MCA gels exhibited a negligible cytotoxicity to RAW264.7 cells due to the non-toxicity of DNA itself; on the contrary, CpG-MCA gels could stimulate RAW264.7 cell proliferation with a dose-dependent effect, which was a benefit to enhance the production of immune cytokines (Fig. 4d).

For further verifying the inhibited efficiency of CpG-MCA gels for the proliferation of solid tumor cells, we estimated the inhibitory effects of CpG-MCA gels as immune stimulators for the U251 human brain glioma cells. The U251 cells was first co-cultured with RAW264.7 macrophages for 24 h, and the clone formation rate was used to check the proliferate ability of the U251 cells. As shown in Fig. 5a–f, the clone formation rate in the CpG-ODN group was 74.1% of that observed in the control group (P < 0.05), and the rates in R12, R4M4, and R4M8 groups were 45.4% (P < 0.01), 15.3% (P < 0.001), and 12.0% (P < 0.001) of that in the CpG-ODN group, respectively. The results demonstrated that the U251 cells treated with CpG-MCA gels presented a significantly lower percentage of clone formation rate compared with that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 5g). It is notable that the trend of inhibitory results was in accordance with the secretion of TNF-α among groups, CpG-MCA gels exhibited a stronger effect on stimulating RAW264.7 cells to secrete cytokines to inhibit proliferation of U251 cells than CpG-ODN. Our research provided preliminary evidence to demonstrate the CpG-MCA gels have the potential to be used as an immunostimulant.

Conclusions

In summary, we have successfully preparedCpG-MCA nanohydrogels that consist of hundreds of immunostimulatory CpG motifs to effectively deliver immune stimulus signal into cells and significantly induce the expression of immune cytokines. CpG-MCA nanohydrogels exhibited powerful anti-tumor immunity against human glioma cells, demonstrating that CpG-MCA nanohydrogels have the potential to be used as an immunostimulant for the therapy of cancer.

データと資料の可用性

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

略語

CpG-MCA gels:: CpG-MCA hydrogel
CpG-RCA gel:: CpG-RCA hydrogel
MCA/M:: Multi-primed chain amplification
R12:: CpG-RCA gel
R12-C, R4M4-C, R4M8-C:: Hydrogels not containing CpG motifs
R4M4, R4M8:: CpG-MCA gels
RCA/R:: Rolling circle amplification

化学的に還元されたホーリー酸化グラフェン薄膜に基づくガスセンサー CdSナノ構造における表面関連励起子とレーザー発振

ナノマテリアル