効果的な肺癌治療のための薬剤耐性を克服するためにmiR495とドキソルビシンをロードした癌細胞膜装飾シリカナノ粒子

はじめに

最近の研究は、多剤耐性（MDR）と化学療法の失敗との間の正の相関関係に対する蓄積された証拠を提供しています[1、2]。 MDRの最も広く認識されているメカニズムの1つは、ATP結合カセット（ABC）トランスポーターのメカニズムであり、その中でP糖タンパク質（P-gp）が最も研究されているメカニズムです[1、3]。 P-gpは細胞内化学療法剤を細胞から効果的に排出し、細胞内薬物蓄積を減少させ、その結果、有効性を低下させることがわかった[4、5]。 P-gpの阻害は、MDRと戦うための潜在的な標的となる可能性がある、MDRの克服に有益な効果を示しています。

マイクロRNA（miRNA）は、天然に存在するタイプの非コードRNAです。しかし、miRNAは細胞のトランスフェクションとタンパク質発現の調節に重要な役割を果たしています[6]。その結果、P-gpの発現は腫瘍の種類に応じた様々なmiRNAの影響を受けることが報告されています[7]。以前の研究では、miR495がMDR卵巣癌細胞と胃癌細胞の両方でP-gp発現を効果的にダウンレギュレートできることが明らかになっています[8]。ここで、この研究では、miR495を使用して、MDR肺がん細胞におけるP-gpの調節におけるその役割をさらに調査しました。

バイオアベイラビリティの向上に伴う副作用の大幅な削減などの比類のない利点により、ドラッグデリバリーシステム（DDS）は過去数十年にわたって成長し、特に癌治療において、ドラッグデリバリーにおける無料の薬物の代替として認識されています[9,10 、11、12]。その結果、癌治療の複雑な細胞外および細胞内障壁を克服すると同時に、さまざまな種類の薬剤の装填に適した多機能DDSの開発が研究の焦点になりつつあります[13、14、15、16]。最も広く採用されている候補の1つであるシリカ（SLI）ナノ粒子は、簡単な調製、高い薬物負荷容量、優れた生体適合性などの用途の広い長所を備えており、好ましいナノキャリアです。当然のことながら、SLIは満足のいく有効性を達成するためのナノキャリアとして多くのDDSで使用されてきました[17、18]。

ただし、前臨床試験では、DDSの標的化送達も癌治療の成功に不可欠であることが明らかになっています。より良いターゲティング効果を達成するために、最も一般的に採用されているアプローチは、DDSの表面のターゲティングリガンドを変更することです。これは、癌細胞の表面の対応する受容体に結合できます[16、19、20]。小分子（分子量1000 Da未満）からモノクローナル抗体（分子量10 kDa以上）まで、これらのターゲティングリガンドはDDSにうまく適用されることが報告されています[21、22、23]。しかし、一部のリガンドの外因性またはその他の理由により、免疫反応や細胞毒性などの悪影響が発生しました。近年、細胞原形質膜は、ナノ粒子の表面を修飾するだけでなく、生体適合性の標的成分としても機能する別の有望な材料になりつつあります。相同癌細胞膜（CCM）と癌細胞との相互作用に基づいて、CCMはDDSの腫瘍ホーミング能力を大幅に向上させることが示されています[24、25]。

肺癌（本研究でモデル癌として選択）のカクテル療法のために、CCMとP-gpターゲティングmiR495の腫瘍ホーミング特性を1つのDDSに組み合わせるために、正に帯電したアミンSLIを最初に作製し、ドキソルビシン（DOX ）。続いて、DOXをロードしたアミンSLIにmiR495をロードして、同時送達コア（SLI / R-D）を形成しました。最後に、SLI / R-Dは負に帯電したCCM（A549 / DOX細胞から取得）で装飾され、同時送達および腫瘍標的化DDS（CCM / SLI / R-D）を準備しました。 CCMは、CCM / SLI / R-Dを均質なA549 / DOX細胞に特異的に誘導して、その腫瘍標的化効果を高め、細胞内取り込みを増加させることができると期待されていました。一方、リリースされたmiR495は、A549 / DOXのMDRを克服し、DOXとの相乗的な抗がん効果を達成することができます。

材料と方法

資料

メチルチアゾリルテトラゾリウム（MTT）、 N -（2-アミノエチル）-3-アミノプロピルトリメトキシシラン（AEAPS）、テトラエチルオルトシリケート（TEOS）、ドキソルビシン（DOX）、およびTriton X-100は、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手しました。 miR495は、Cell Biolabs Inc.（San Diego、CA、USA）から提供されました。その他の化学物質および試薬は、Aladdin Co.、Ltd（上海、中国）から入手し、分析用に純粋でした。

細胞培養と動物モデル

A549（ヒト肺癌）、A549 / DOX（DOX耐性細胞株）、およびNIH3T3（マウス胚性線維芽細胞）細胞株を、10％（v / v）ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン（100 U / mL）、および5％CO ₂ を含む37°Cの恒温インキュベーター内のストレプトマイシン（100 U / mL） 。 A549 / DOX（DOX耐性細胞株）は、報告されているように、DOXの濃度を徐々に上げながらA549細胞を培養することによって確立されました[26]。以前に報告されたように、すべての細胞株は標準的なプロトコルで培養された[27]。雄のBalb / cヌードマウス（〜20 g）は、武漢大学のモデル動物研究所（中国、武漢）から入手し、標準的なプロトコルで飼育しました。 A549 / DOX腫瘍異種移植モデルは、以前の記事[28]に基づいて確立されました。動物に関連するすべての実験は、中山大学の第3付属病院の組織倫理委員会によって承認されました。

多細胞腫瘍スフェロイドモデル

多細胞腫瘍スフェロイド（MCTS）は、以前の報告[29]に基づいて確立されました。簡単に説明すると、96ウェルプレート（米国コーニング）をオートクレーブ処理したアガロース溶液で覆い、ゲルパッドを作成しました。その後、混合A549 / DOXおよびNIH3T3細胞（1：1）をプレートに播種し、インキュベートしてMCTSを形成しました。 MCTSの形成は、光学顕微鏡（CX 23、オリンパス、日本）によって監視されました。

CCM / SLI / R-Dの準備

アミンSLIの製造は、以前の報告[30]に基づいて油中水型マイクロエマルジョンで実施されました。簡単に言えば、DOXを含む油中水型マイクロエマルジョンは室温で製造されました。その後、AEAPS、TEOS、およびNH ₄ OHを連続して加えて反応を引き起こした。 24時間反応させた後、DOXをロードしたアミンSLIを過剰量のエタノールを使用して沈殿させ、遠心分離（3000 rpm、10分）を使用して収集しました。

miR495をHEPESバッファーに溶解し、DOXをロードしたアミンSLIの水溶液に、ボルテックスを使用してさまざまな重量/重量（w / w）比で滴下し、SLI / R-Dバイナリー複合体を得ました[31]。

A549 / DOX細胞からのCCMの分離は、以前の報告[32]に基づいて実施されました。要約すると、A549 / DOX細胞を収集し、遠心分離を使用して濃縮しました。その後、細胞を抽出バッファーに分散させ、さらに遠心分離しました（10,000 g 、10分）、続いて2回目の超遠心分離（100,000 g 、60分）最終的にCCMを取得します。すべての手順は4°Cで実行されました。 CCMのタンパク質濃度は、BCAキット（Beyotime、上海、中国）を使用して定量化されました。

SLI / R-DへのCCMのコーティングは、miR495結合と同様のプロトコルを使用しました。要約すると、さまざまな量のCCM溶液をボルテックス下でSLI / R-D（1 mg / mL）に添加しました。最後に、混合物をプローブタイプの超音波処理（100 W、5分）で処理し、次に遠心分離（10,000 g ）しました。 、10分）CCM / SLI / R-Dを取得します。

特性評価

CCM / SLI / R-Dのサイズ分布とゼータ電位は、ゼータサイザー（ZS90、マルバーン、英国）によって評価されました。さらに、透過型電子顕微鏡（TEM、JEM1230、JEOL、日本）を適用して、ナノキャリアの形態を観察しました。

SLIのmiR495への結合能力は、コントロールとして裸のmiR495を使用したゲル遅延アッセイによって研究されました。さまざまなw / w比（0.2〜25、SLIからmiR4​​95）で処方されたSLI / RDを、Goldview（Solarbio Science＆Technology Co.、Ltd。、北京）を含む2％アガロースゲルにロードし、0.5×Tris-Borateで電気泳動しました。 -EDTAバッファー（90 V、60 min）。 miR495の視覚化は、Gel-Proアナライザー（Genegenius、Syngene、UK）を使用して実行されました。

溶解緩衝液（Beyotime、Shanghai）を使用して、CCMからの総タンパク質を正確に測定し、その後、BCAキットを使用して濃度を定量化しました。次に、サンプルをポリ（フッ化ビニリデン）（PVDF）メンブレンに転写しました。最後に、メンブレンを対応する一次抗体（Abcam、USA）および二次抗体（Abcam、USA）で染色しました。濃度計（E-Gel Imager、Thermo-Fisher、USA）を視覚化に使用しました。

CCM / SLI / R-Dの薬物負荷量（DLC）は、調製したままのナノキャリアをメタノール中で48時間出現させることによって決定されました。サンプルを遠心分離し（10,000 rpm、30分）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるDOXの測定のために上清を収集しました[33]。 miR495の負荷は、260 nmでのUV吸光度（UV5Nano、メトラートレド、スイス）によって決定されました。

PBSおよびマウス血漿中のCCM / SLI / R-Dの粒子サイズの変化は、48時間以内の各時点で記録されました。 CCM / SLI / R-DからのDOXの放出プロファイルは、以前のレポート[34]に従って調査されました。

細胞内トランスフェクション

A549 / DOX細胞を6ウェルプレートに24時間播種し、CCM / SLI / miR495（miR495濃度、1〜25 ng / mL）で48時間培養しました。その後、細胞を剥離して回収し、P-gp発現のウエスタンブロット分析を行いました。

薬物の細胞内濃度は、以前の報告[23]に従って決定されました。簡単に説明すると、CCM / SLI / miR495でさまざまな時間間隔で処理した後、A549 / DOX細胞をDOXとインキュベートしました。所定の時間間隔（4および8 h）で、細胞を分離し、収集し、5 mLのDOX抽出溶液（エタノール0.6 M HCl、1：1、v / v）に分散させた後、氷浴中で400Wで超音波処理しました。 40回。混合物を4℃で24時間放置し、12,000rpm（4℃）で10分間遠心分離しました。上清を回収し、上記のようにDOX含有量を測定しました。

細胞生存率

薬物を含まないナノキャリア（10–200μg / mL）およびCCM / SLI / RD（DOX濃度、2-50μM; miR495濃度、10–250nM; DOXとmiR495のモル比は次のように固定されています）の細胞毒性効果200）A549 / DOX細胞で48時間、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイによって測定されました。アポトーシス関連タンパク質のレベル変動も、ウエスタンブロットアッセイを使用して決定されました。

直径300〜400μmのMCTSを、さまざまな製剤（DOX濃度、25μM）を含む培地とともに37°Cで5日間インキュベートしました。光学顕微鏡を使用して、MCTSの直径の変化を記録しました。

CCM / SLI / R-Dのinvitroおよびinvivoターゲティング

FAM標識siRNAを採用してDDSを構築しました。 A549 / DOX細胞を6ウェルプレートに24時間播種しました。次に、細胞を過剰なCCMとともに2時間インキュベートし、SLC / siRNAおよびCCM / SLC / siRNAを添加しました。設定された時間間隔で、細胞を収集し、定量化のためにフローサイトメーター（FCM、FC500MCL、ベックマンコールター）で測定しました。

Cy5で標識されたmiR495がDDSの構築に採用されました。 A549 / DOX腫瘍を有するマウスは静脈内投与された。 SLI / miR495およびCCM / SLI / miR495を注入し、リアルタイムイメージングシステム（ZEWTON 7.0、フランス、ビルバー）を使用してmiR495の分布を所定の時間間隔で監視しました。 12時間投与した後、腫瘍と主要臓器を犠牲にしたマウスから採取し、分析分析のために同じシステムを使用して画像化しました。

InVivo抗がんアッセイ

CCM / SLI / R-Dのinvivo抗癌アッセイは、A549 / DOX担癌マウスを使用して評価されました。詳細には、マウスをランダムに5つのグループに分けました（ n =6）:( 1）生理食塩水（コントロールとして）、（2）遊離DOX、（3）CCM / SLI / DOX、（4）CCM / SLI / miR495、および（5）CCM / SLI / R-D。その後、マウスに5 mg / kgDOXおよび0.25mg / kgmiR495の用量の製剤を14日以内に7回腫瘍内投与しました。各グループのマウスの腫瘍体積と体重は、2日ごとに測定されました。

結果と考察

CCM / SLI / R-Dの準備

1つのDDSで優れた薬物負荷容量と生体適合性を実現するために、油中水型マイクロエマルジョンでのTEOSとAEAPSの同期加水分解をSLIの製造に使用しました。 DOXは、製造中にSLIのマトリックスに事前に取り込まれていました。図1aに示すように、動的光散乱（DLS）の結果は、DOXをロードしたアミンSLIの直径が約100nmであることを示しています。 TEM画像はさらに、ナノ粒子が狭い分布で球形であることを明らかにしました。これは、DLSによって得られた結果と一致していました。

a 異なるw / w比でのSLI / R-Dのサイズとゼータ電位の変化。 b さまざまなw / w比でのSLI / R-Dバイナリー複合体のmiRNA結合アッセイ。データは平均±SD（ n =3）

DOXをロードしたアミンSLIの表面電位は26.83mVであり、miR495キャリアとして機能するのに有益でした。以前の報告[31]によると、バイナリ複合体を形成するためのmiR495とSLIのアセンブリは、静電相互作用によって駆動されていました。バイナリー複合体のw / w SLIからmiR4​​95は、最終的なトランスフェクション効率に大きな影響を及ぼします。図1aに示すように、miR495は負に帯電した高分子であるため、SLIとmiR495のw / w比が低い場合、バイナリ複合体は、粒子サイズが大幅に増加した負の表面電荷を示します。隣接するナノ粒子の付着。しかし、w / w比の増加に伴い、二成分錯体の表面電荷は徐々に正になり、100nm付近で安定した粒子サイズが観察されました。 w / w比が20に達すると、バイナリ複合体の粒子サイズと表面電位の両方が、w / w比の増加に伴う大きな変化なしに安定したままであることが示されました。

miR495へのナノキャリアの結合および保護能力は、遺伝子送達に不可欠です。 SLIのmiR495結合能力は、ゲル遅延アッセイによって評価されました。図1bに示すように、裸のmiR495は遅延を示さなかったが、SLIを追加するとmiR495の動作が大幅に変化した。 SLIは、w / w比の増加に伴ってmiR495結合能力の増加を示し、w / w比5でmiR495の完全な遅延を達成したことが観察されました。

要約すると、適切な粒子サイズと望ましい表面電荷、および効果的なmiR495結合と保護特性を備えた、w / w比20の二成分複合体が、実行するモデルとして選択された最適な製剤であると推測されました。次の実験。

次に、CCMとバイナリ複合体をさまざまな質量比（SLIとCCMタンパク質、w / w）で混合することにより、バイナリ複合体に対する最適なCCMタンパク質の比率を調べました。最適な比率は、さまざまな条件下で得られた粒子サイズと表面電荷によって決定されました。図2aに示すように、CCM（負電荷）を追加すると、製品のサイズに大きな変動が生じましたが、表面電荷は継続的に減少しました。結果は、CCMがバイナリー複合体の表面にうまく固定されたことを示した。最も重要なことは、CCM / SLI / R-Dの粒子サイズと表面電荷の両方が質量比7.5でプラトーに達し、追加のCCMが表面電荷にわずかな影響を示し、サイズがわずかに増加するだけであることが観察されたことです。具体的には、ナノ粒子の直径は121.28±3.36 nmに達し、ゼータ電位は− 28.04±2.64mVに変化しました。これは、遊離CCMの表面電荷（− 27.95±3.06mV）と同様であり、CCMの装飾を示唆しています。この条件下で飽和に達した。その結果、以下の実験を行うためのモデル定式化として、質量比7.5のCCM / SLI / R-Dが選択されました。

a 異なるw / w比でのCCMSLC / R-Dのサイズとゼータ電位の変化。挿入された画像は、CCMおよびCCM / SLI / R-Dの3つの代表的なタンパク質のウエスタンボルト分析です。 b CCM / SLI / R-Dのサイズ分布とTEM。データは平均±SD（ n =3）。スケールバー100nm

CCM / SLI / R-Dの特性評価

以前の報告では、CCMのタンパク質は、ナノ粒子を修飾するために採用された場合、相同腫瘍細胞をホーミングできることが示されています[35、36]。したがって、3つの膜タンパク質（Na-K​​ ATPase、AT1R、およびCXCR4）を選択し、CCMでのそれらの発現レベルをCCM / SLI / R-Dと比較しました。図2aの挿入画像に示すように、CCMの3つのタンパク質すべての量は、CCM / SLI / RDと同様の強度を示しました。これは、CCMの統合タンパク質がコーティング後にCCM / SLI / RDに継承されたことを示しています。このプロセス中の損失または劣化はごくわずかでした。この結果は、CCM / SLI / R-Dの構築が成功したことを確認する確かな証拠も提供しました。これは、CCM / SLI / R-Dの腫瘍ホーミングの増加に有益でした。

CCM / SLI / R-Dのサイズ分布と形態も、DLSとTEMを使用して研究されました。図2bに示すように、DLSはCCM / SLI / RDが約120nmで狭く分布していることを示し、TEMは、CCM / SLI / RDが球状のコアシェル構造であり、脂質二重層が表面にはっきりと観察できることを示しました。レイヤー。

CM / SLI / R-D（HPLCで測定）のDOXのDLCは17.96％に達する可能性があり、miR495の負荷（UV分光光度計で測定）は1.64％に達する可能性があります。

以前の研究では、薬物分子を安全に送達するためのいくつかの予備的要件が結論付けられています。まず第一に、採用されたDDSは、生理学的環境下で劇的なサイズ変動なしに安定に維持されるべきです。なぜなら、粒子サイズはシステムのin vivo運命に決定的な重要性をもたらしたからです[10、37]。その結果、CCM / SLI / R-Dの時間依存性の安定性が調査されました。生理学的環境におけるCCM / SLI / R-Dのコロイド安定性を決定するために、PBS（pH 7.4）およびマウス血漿中のDDSのサイズ変化を48時間まで記録しました。図3aに示すように、CM / SLN / Ce6は、大幅な変動なしに、テスト範囲全体にわたってそのサイズを効果的に維持できました。したがって、CCM / SLI / R-Dは生理学的状態で安定した状態を維持できると結論付けられました。図3bに示すように、CCM / SLI / RDは細胞外条件での安定性を維持でき（120時間のインキュベーション後に薬物の32.76％が放出されます）、送達プロセス中にCCM / SLI / RDが安全にカプセル化できることを示しています。潜在的な悪影響を誘発することなく、薬物分子をロードしました。最も重要なことは、細胞に入り、癌細胞の酸性環境にさらされると、薬物は容易に放出され（75.93％）、これは薬物と担体の組み合わせを弱める高水素濃度に起因する可能性があります[6、38]。 / P>

a PBS（pH 7.4）およびマウス血漿中のLCC / R-Aの37°Cで最大48時間のコロイド安定性。 b pH（7.4および5.5）の細胞外および細胞内条件下での放出媒体中のLCC / R-AからのDOXの薬物放出プロファイル。データは平均±SD（ n =3）

細胞内トランスフェクション

miR495のトランスフェクションとP-gpの発現との関係を明らかにするために、A549 / DOX細胞にさまざまな濃度のmiR495をトランスフェクトしました。その後、これらの細胞におけるP-gp発現レベルをウエスタンブロットアッセイを使用して決定した。図4aに示すように、P-gpの発現はmiR495濃度と負の関係を示し、CCM / SLIがmiR495送達の有用なツールとして適用できることを示唆しています。 A549 / DOX細胞のMDR。概念実証として、細胞内DOX蓄積の変動に対するmiR495トランスフェクションの効果をさらに研究しました。 CCM / SLC / siRNAで48時間または72時間処理した後（図4b）、A549 / DOX細胞をさまざまな時間間隔でDOXで処理しました。図5dに示すように、CCM / SLC / siRNAを48時間前処理すると、A549 / DOX細胞におけるDOXの細胞蛍光は1.49倍（インキュベーション後4時間）および1.47倍（インキュベーション後8時間）増加しました。 、 それぞれ。 CCM / SLC / siRNAを72時間前処理すると、A549 / DOX細胞の細胞内DOX蛍光は1.63倍（インキュベーション後4時間）および1.85倍（インキュベーション後8時間）増加しました。その結果、CCM / SLC / siRNAは、未処理の細胞と比較して細胞内DOX蓄積を増加させることにより、A549 / DOXのMDRを克服できると結論付けられました。

a CCM / SLI / miR495で48時間処理した後のA549 / DOX細胞におけるmiR495濃度とP-gpタンパク質の発現との関係。 b 異なる時間間隔でLCC / miR495で処理した後のA549 / DOX細胞における細胞内DOX蓄積。データは平均±SD（ n =3）

薬物を含まない担体で処理されたA549 / DOX細胞の生存率（ a ）または薬物を含む（ b ）48時間の異なるナノ粒子/薬物濃度での異なる製剤。 c 異なる処理後のカスパーゼ-3、シトクロムC、およびbcl-2タンパク質の発現のウエスタンブロットアッセイ。データは平均±SD（ n =3）。 ^** P <0.01

インビトロ抗癌アッセイ

DDSの生体適合性をさらに明らかにするために、薬物を含まない担体（CCM / SLI）の細胞毒性を調べました。図5aに示すように、200μg/ mLの最高濃度でCCM / SLIと48時間インキュベートした後でも、A549 / DOXは90％以上の生存率を示しました。これは、CCM / SLIがわずかな毒性と生体適合性があることを示唆しています。細胞に。

その後、invitro抗癌アッセイを評価した。図5bに示すように、すべての製剤の抗がん効果は薬物濃度と正の相関がありました。詳細には、A549 / DOX細胞の生存率は、最高のDOX濃度（50μM）でも72.6％でした。同じ条件下でのCCM / SLI / DOXおよびCCM / SLI / miR495は、同様の細胞生存率を達成し、それぞれ59.4％および63.3％であり、DOXよりも高かった。ただし、CCM / SLI / R-D処理の細胞生存率は38.5％に大幅に低下したことが注目されました。さらに、CCM / SLI / R-DのCIインデックスは0.84と決定され、A549 / DOX細胞の死滅に対するmiR495とDOXの強力な相乗効果を示唆しています。

結論を再度検証するために、一般的に採用されているアポトーシス調節タンパク質（カスパーゼ-3、bcl-2、およびシトクロム-3）をさまざまな製剤で評価しました。図5cに示すように、切断されたカスパーゼ-3の量はCCM / SLI / RD処理細胞で最も高く、bcl-2（アポトーシス抑制剤）レベルはすべてのテストグループの中で最も低く、好ましい抗癌性がさらに確認されました。 CCM / SLI / RDの有効性。さらに、CCM / SLI / R-Dはシトクロム3の発現が大幅に上昇していることを示しており、このグループのアポトーシスがミトコンドリアの損傷に関連していることを示唆しています。

MCTSは、固形腫瘍を模倣し、さまざまな製剤の抗がん効果を評価するために採用されました。図6aに示すように、遊離DOXグループのMCTS量は実験期間全体にわたって持続的に増加し、A549 / DOXのMDRがDOXの細胞毒性を大幅に低下させる可能性があることを示唆しています。シングルデリバリーシステム（SLI / DOXおよびSLI / miR495）は、成長がわずかに低下する特定の抑制効果を示しました。最も重要なことは、CCM / SLI / R-DでのmiR495とDOXの組み合わせは、有効性が大幅に向上し、テストの最後に負の体積増加が観察されたことです。図6bの光学画像も同様の結論に達しました。

音量が変わります（ a ）および対応する光学画像（ b ）異なる治療後のMCTSの。データは平均±SD（ n =3）。 ^** P <0.01

InVitroおよびInVivoターゲティング

さまざまな製剤の識別可能な抗腫瘍効果の考えられる理由を明らかにするために、CCMの表面修飾が腫瘍を増強できることが多くの研究で実証されているため、CCM修飾がA549 / DOX細胞のナノ粒子の内在化能力を積極的に増加させることができるかどうかを調査するために細胞取り込みを評価しました-ナノキャリアの標的能力[39、40]。図7aに示すように、細胞内蛍光強度はCCM / SLI / miR49およびSLI / miR495グループで時間の関数として増加し、両方のナノ粒子での時間と細胞取り込みの間に正の関係があることを示唆しています。さらに、CCM / SLI / miR495グループでより高い蛍光シグナルが観察され、6時間の時点でSLI / miR495グループの1.58倍であることが注目されました。 CCM / SLI / miR495の取り込みがCCMを介したエンドサイトーシスによるものかどうかを確認するために、ナノキャリアを添加する前に、細胞を過剰なCCMとともにインキュベートしました。 CCM / SLI / miR495グループの蛍光強度は減少し続けたが、SLI / miR495グループの蛍光強度はほぼ同じレベルのままであったことが観察された。これらの結果は、CCM / SLI / miR495がCCM関連のエンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれたことを示しています。

a A549 / DOX細胞（CCMあり/なしで前処理）におけるさまざまな製剤の細胞内時間依存性取り込みの定量分析。 b 注射後48時間でSLI / R-AおよびCCM / SLI / R-Aで治療されたマウスの解剖された腫瘍および主要臓器の平均蛍光強度。データは平均±SD（ n =3）。 ^** P <0.01

A549 / DOXからのCCMは、同種のA549 / DOX細胞に対するCCM / SLI / R-Dの腫瘍標的化能力を増強し、腫瘍におけるナノキャリアの蓄積を増加させることが期待されていました。私たちのコンセプトを検証するために、SLI / R-DとCCM / SLI / R-Dの分布をリアルタイムイメージングシステムで監視しました。図7bに示すように、予想通り、CCM / SLI / R-DはSLI / R-Dと比較して腫瘍内により多くの蓄積を示しました。さらに、SLI / R-Dは、肝臓と脾臓に焦点を合わせて、ほぼすべての臓器（心臓を除く）に分布していると結論付けられました。これは、腫瘍ホーミング能力が低いことが原因である可能性があります。それどころか、CCMの変更により、肝臓の捕捉が大幅に軽減され、積載された貨物の腫瘍組織へのホーミングが強化される可能性があります。

In Vivo Antitumor Efficacy

CCM / SLI / R-Dのinvivo抗腫瘍効果を実施しました。 DOXまたはSLI / DOXによる治療後、マウスの腫瘍増殖は遅くなりました。ただし、CCM / SLI / R-Dは最高の抗腫瘍効果を示し、明らかに腫瘍体積が303±25 mm ³ 減少しました。 。さらに、異なるグループのマウスの体重変動の結果も興味深い結果を示しました（図8）。それは、CCM / SLI / R-Dで治療されたマウスに明らかな体重の減少がないことを示し、CCM / SLI / R-Dの腫瘍標的化能力が副作用を減らして抗腫瘍効果を高めることができることを示唆している。対照的に、遊離DOXの非標的分布は、マウスに系統的な毒性を引き起こしました。これは、時間の関数として徐々に体重が減少したことによって反映されました。要約すると、CCM / SLI / R-Dは、肺腫瘍治療のための優れた腫瘍ホーミングDDSでした。

The tumor volume (a ) and body weight (b ) of tumor tissue analysis of A549/DOX tumor-bearing Balb/c nude mice after intratumoral administration of different formulations. Data were expressed as mean ± SD (n =6）。 ^** P <0.01

Conclusion

In summary, we successfully constructed a CCM-coated SLI nanoparticle as a DDS to co-delivery miR495 and DOX (CCM/SLI/R-D). The characterization demonstrated that CCM/SLI/R-D showed well distribution with a diameter of 120 nm, which showed high stability as well as pH-responsive drug release. Cellular experiments revealed that CCM/SLI/R-D could realize preferable miR495 delivery which achieved the significant downregulation of P-gp, which finally overcome the MDR in A549/DOX by increasing the intracellular DOX accumulation compared to untreated cells. The CCM/SLI/R-D showed promising tumor-homing capability. Most importantly, the synergetic effect of miR495 and DOX achieved much more potent anticancer effect to mono-delivery DDS or free DOX both in vitro and in vivo.

データと資料の可用性

The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.

略語

AEAPS:

N -(2-Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane

CCM:

Cancer cell membrane

DDS：

Drug delivery systems

DLC:

Drug loading content

DOX：

ドキソルビシン

HPLC：

高速液体クロマトグラフィー

MCTS:

Multicellular tumor spheroid

MDR：

多剤耐性

miRNA:

MicroRNAs

MTT：

メチルチアゾリルテトラゾリウム

P-gp：

P糖タンパク質

SLI:

シリカ

TEOS：

オルトケイ酸テトラエチル