CoFe₂O₄量子ドット：PI3K/AKT経路調節によるアポトーシス誘導で非小細胞肺がんに対する光熱/光動力療法を実現

概要

非小細胞肺がん（NSCLC）は世界で2番目に多く診断される悪性腫瘍です。長年にわたるナノ材料を用いたがん治療戦略の探求の一環として、本研究では優れた光熱/光動力相乗効果を示す新規CoFe₂O₄量子ドット（QDs）を構築し、顕著な毒性を示さずにNSCLCを効率的に抑制することを実証しました。CoFe₂O₄-QDsと近赤外（NIR）レーザー照射の併用により、NSCLC細胞のアポトーシスが誘導されることを示しました。さらに、この併用療法は反応性酸素種（ROS）生成を促進し、PI3K/AKT経路を介して細胞死を引き起こします。また、生体内においても腫瘍移植片を毒性なしに完全に消失させることに成功しました。以上より、新規ナノ材料CoFe₂O₄-QDsは、NSCLCに対する光熱療法（PTT）と光動力療法（PDT）の相乗効果を発揮し、毒性を伴わない有望な光増感剤となり得ることを報告します。

はじめに

がんは死因の首位であり、家族と社会に多大な負担を与えています。中でも肺がんは2020年に診断数第2位、がん死亡原因第1位を記録しました。非小細胞肺がん（NSCLC）は肺がんの約85%を占め、高い発生率と死亡率が特徴です。手術療法に加え、化学療法や免疫療法の開発が進められており、EGFR変異阻害剤、KRAS阻害剤、ALK阻害剤などが有効性を示し、免疫チェックポイント阻害剤（抗PD-L1、抗CTLA-4抗体）も生存利益をもたらしています。しかし、患者による応答率のばらつきや副作用、特に薬剤耐性は無視できません。したがって、侵襲性の低い新規治療戦略の開発は、NSCLC研究と臨床治療において喫緊の課題です。

近年、ナノ材料を用いた光熱療法（PTT）と光動力療法（PDT）は、抗がん戦略として大きな注目を集め、著しい発展を遂げています。ナノ材料ベースのPTT/PDTは低侵襲・低毒性で、薬剤耐性を誘導しにくい利点があります。近赤外光（NIR）との協働により、腫瘍局所に集積したナノ材料が温度上昇と酸素からの細胞毒性ROS生成を引き起こし、がん細胞を死滅させます。ナノ材料の選択が効力と安全性を左右する鍵となります。これまで金属ナノ構造、炭素系材料、高分子ナノ粒子、半導体化合物などが用いられてきましたが、それぞれに限界があります。例えば炭素系材料は高コストで懸濁性が悪く、大規模応用と臨床展開を制限しています。より適したナノ材料の開発が求められています。

量子ドット（QDs）は、良好な生体適合性、溶解性、優れた光安定性、容易な表面機能化などから、生物医学応用で注目されています。これらの特性を活かし、QDsをPDT試薬として用いる報告が相次いでいます。例えば、Mengらは二光子励起でPDT効率を高めるGQD@MnO₂を、Kuoらはアミノ基修飾窒素ドープQDsでPDT効率を向上させました。これらの知見に着想を得て、非貴金属ベースナノ材料と組み合わせ、PTT/PDT相乗効果を単一ナノシステムで実現するQDsの開発を試みました。Coベースナノ材料は、PTT剤やイメージング剤としてよく研究されている非貴金属材料です。そこで、CoベースQDsの設計がPTT/PDT相乗効果をもたらすと考えました。

本研究では、新規ナノ材料CoFe₂O₄-QDsを合成し、in vitroおよびin vivoで毒性を伴わずNSCLCに対するPTT/PDT相乗効果を示すことを実証し、NSCLC治療のための有望な光増感剤となり得ることを報告します。

材料と方法

CoFe₂O₄-QDsの合成

CoFe₂O₄-QDsは水熱法で合成しました。CoCl₂·6H₂O（0.238 g）とFe(NO₃)₃·9H₂O（0.808 g）を水10 mLとプロピレングリコール10 mLの混合溶媒に溶解し、10分撹拌後、ジスラノールアミン4 mLを滴下添加し30分撹拌しました。得られたスラリーを50 mLテフロンライニング付きステンレスオートクレーブに移し、160 ℃で3時間加熱しました。8500 rpm、10分遠心分離後、脱イオン水とエタノールで順次洗浄し、CoFe₂O₄-QDsを回収しました。試薬と材料は表1にまとめています。

CoFe₂O₄-QDsのキャラクタリゼーション

形態とサイズはTEMとEDSで、結晶構造はX線回折計（Bruker、Cu Kα線、λ=0.15406 nm）で解析しました。吸収スペクトルはSHIMADZU UV-2600分光光度計で、元素価数状態はXPS（VG ESCALAB 220I-XL）で測定しました。熱画像はIRサーモグラフィカメラ（FLIR E50）で記録しました。

細胞培養

NSCLC細胞株NCI-H460（H460）、A549、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）をATCCから入手し、マイコプラズマ陰性を確認しました。H460とA549はRPMI-1640培地（10% FBS、1% ペニシリン・ストレプトマイシン）、HUVECは内皮細胞増殖培地（Sigma #211-500）で、37 ℃、5% CO₂、暗所湿潤条件で培養しました。

細胞毒性検出

CoFe₂O₄-QDsを様々な濃度（0.1、0.5、1.0、2.0 mg/mL）でHUVECと24時間共培養後、CCK-8試薬を添加し1時間インキュベーション、450 nmで吸光度測定しました。対照群HUVECの生存率を100%としました。

アポトーシス解析

H460およびA549細胞（2×10⁵）を6ウェルプレートで一晩培養後、1.0 mg/mL CoFe₂O₄-QDsと808 nm NIRレーザー（5分）で処理しました。細胞を洗浄後、Annexin-V/PIアポトーシスキット（BD #556547）で染色し、メーカー指示に従って解析しました。HUVECアポトーシスアッセイも同様に実施しました。

細胞内ROS検出

H460およびA549細胞を一晩培養後、1.0 mg/mL CoFe₂O₄-QDs存在下で1時間インキュベーションし、808 nm NIRレーザー（5分）照射しました。処理後、DCFH-DAを添加し30分インキュベーション、FACSで励起/放射485/535 nmで検出しました。ROS阻害アッセイでは、NAC（Sigma A7250）をメーカー指示に従って添加しました。データはFlowJoソフトウェアで定量化しました。

ウェスタンブロット解析

アポトーシスアッセイと同様に処理したH460およびA549細胞からRIPA溶解バッファーで全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットを実施しました。使用抗体：抗Bcl-2（abcam ab59348）、抗Bax（abcam ab32503）、抗P-PI3K（Bio-Vision 3152-100）、抗P-AKT-S473（CST 4060S）、抗β-Actin（CST 4970S）、抗ウサギIgG-HRP（CST 7074S）。定量はImageJソフトウェアで行いました。

CoFe₂O₄-QDsとNIR併用療法のin vivo抗NSCLC効果検証

H460細胞を50% MatriGelと共にNSGマウス（各群N=8）へ皮下移植しました。4-6週齢雄性M-NSGマウス（Shanghai Model Organisms #NM-NSG-001）を用いました。腫瘍が可視化され体積が約5×5 mmに達したら、マウスを無作為に4群（対照、NIRのみ、CoFe₂O₄-QDsのみ、CoFe₂O₄-QDs+NIR）に分けました。CoFe₂O₄-QDs群と併用群には腫瘍内へ50 µLのCoFe₂O₄（5.0 mg/kg）を注射し、対照とNIR群にはPBS 50 µLを注射しました。注射後、NIR 808 nmレーザー（1 W/cm²）をNIR群と併用群に10分照射し、赤外線サーモグラフィで監視しました。腫瘍体積を毎日記録し、V = 長径 × 短径²/2で計算しました。腫瘍径が約15 mmに達したらマウスを安楽死させ、移植片を撮影・保存しました。全動物実験は北京大学深圳病院のIACUCと動物福祉委員会の承認を得て実施しました。

H&E染色と免疫組織化学染色

病理評価のため、処理1日後に腫瘍移植片（N=3）を採取し、10%緩衝ホルマリン固定、パラフィン包埋後、H&E染色とIHC検出を行いました。in vivo毒性評価のため、腎臓、肝臓、肺、心臓、脾臓を摘出し病理評価しました。IHC染色には抗Ki67抗体（Abcam ab15580）を用い、陽性領域をFijiソフトウェアで定量化しました。

統計解析

全実験で「N」は反復数または使用マウス数を示します。Studentのt検定または一元配置分散分析（ANOVA）で統計比較を行いました。P < 0.05を有意、*、**、***でP < 0.05、0.01、0.001を示します。GraphPad Prism 5で解析しました。

結果

新規CoFe₂O₄-QDsの特性

水熱法でCoFe₂O₄-QDsを構築しました。この手法は低コストかつ簡便です。TEM像（図1a）では均一で安定したパターンが見られ、平均直径約3.4 nm（図1b）でした。調製されたCoFe₂O₄-QDsは暗褐色で、水への優れた溶解性を示しました。高分解能TEM（図1c）では、(222)面の格子間隔が約0.242 nmで、CoFe₂O₄の結晶パラメータと一致しました。元素スペクトル（図1d）でCoとFeの存在が確認され、原子比は約1:2でした。これらのデータはCoFe₂O₄-QDsの成功した構築を示しています。

CoFe₂O₄-QDsの物理的特性検出

NIR吸収測定では、CoFe₂O₄-QDsは濃度依存的に適切な光熱変換を示し、温度上昇（ΔT）は0.3～18.9 ℃の範囲で調整可能でした（図2a）。また、1.0 mg/mL濃度でNIR出力を0.5～2.0 W/cm²に増やすと、ΔTは0.8～24.3 ℃に調整可能でした（図2b）。光熱変換性能は濃度と照射パワーに依存することが示されました。周期照射による安定性試験（図2c）では安定した光熱変換が確認されました。光-熱変換効率は7.18%（図2d）と計算されましたが、PDT効果を増強するには十分です。さらに、CoFe₂O₄-QDsの最長吸収波長は約808 nmでした（図2e, f）。これらのデータは、CoFe₂O₄-QDsがPTT/PDT相乗剤として有望であることを示唆しています。

正常細胞に対するCoFe₂O₄-QDsの細胞毒性評価

ナノ粒子が薬物送達系や腫瘍治療の媒質として用いられることを考慮し、正常細胞特にヒト血管内皮細胞に対する細胞毒性を確認しました。HUVECに様々な濃度のCoFe₂O₄-QDsを共培養し、CCK-8アッセイで細胞生存率を測定したところ、対照群と比較して明らかな細胞毒性は観察されませんでした（図3a）。さらに同条件でアポトーシスアッセイを行い、アポトーシス率の定量でも対照群と有意差はありませんでした（図3b, c）。CoFe₂O₄-QDsは正常細胞に顕著な毒性を示さず、薬物送達媒質としての可能性を示しました。

NIRとCoFe₂O₄-QDsの併用によるNSCLCアポトーシス誘導

CoFe₂O₄-QDsのNSCLC殺傷能を検証するため、808 nm NIRレーザー照射とCoFe₂O₄-QDsインキュベーションを併用し、アポトーシスアッセイを実施しました。H460とA549の両細胞株で、併用群にて顕著なアポトーシス率上昇が認められました（図4a, b）。定量解析でも対照群と有意差があり、CoFe₂O₄-QDsのみまたはNIRのみの群では差がなく、併用が抗NSCLC効果を発揮することを示しました。Bcl-2/Baxタンパク質レベルの変化はアポトーシス判定の指標となります。両細胞株でBcl-2/Bax比が低下し、ミトコンドリア依存性アポトーシス経路の活性化が確認されました（図4c, d）。したがって、CoFe₂O₄-QDs+NIRはミトコンドリア依存性アポトーシス経路を活性化し、抗NSCLC効果を発揮します。

CoFe₂O₄-QDsとNIRの併用によるPI3K/AKT経路を介したROS生成誘導

ミトコンドリア機能不全はROS生成を上昇させ、NSCLC細胞死を引き起こします。CoFe₂O₄-QDs+NIR処理後、H460とA549で大量のROS放出が観察され、光熱変換効率が低くてもPDT効果が増強されることが示されました（補足図S1A, B）。さらに、PI3K/AKTシグナル経路関連タンパク質レベルも低下し、ROS変化がPI3K/AKT経路によって制御され、Bcl-2/Bax発現変化につながることが示唆されました（図4c, d、補足図S1C, D）。これを確認するため、ROS阻害剤NACを添加したところ、現象が逆転しました（図5a, b）。NAC処理後、PI3K/AKT発現が回復し、ROS放出がPI3K/AKT経路により制御されることがさらに確認されました（図5c, d）。これらの知見は、CoFe₂O₄-QDs+NIRがミトコンドリア機能不全（ROS）依存性アポトーシスを誘導し、PTTとPDTの相乗効果でNSCLC細胞を殺傷することを強く支持します。

CoFe₂O₄-QDsとNIR併用療法のin vivo抗NSCLC評価

in vitro結果に基づき、NSCLC腫瘍移植マウスモデルで併用療法の抗腫瘍効果を検証しました。H460細胞をM-NSGマウスに皮下移植後、CoFe₂O₄-QDsを腫瘍内注射し、NIRレーザー照射を行いました。赤外線サーモグラフィ監視下で腫瘍内温度が急速に約56 ℃まで上昇しました（図6a, b）。病理染色では併用群で広範な壊死領域が観察され、腫瘍細胞死による腫瘍消失が示されました（図6c, d）。IHC染色ではKi-67陽性領域が併用群で著しく縮小し、処理腫瘍が増殖能を失ったことを示しました（補足図S2A, B）。12日間の経過観察では、他群で腫瘍体積と重量が顕著に増大したのに対し、併用群では腫瘍移植片が完全に消失しました（図6e, f）。CoFe₂O₄-QDsの細胞毒性について、観察期間中、主要臓器の病理解析で明らかな有害影響は検出されませんでした（補足図S2C）。以上のデータは、CoFe₂O₄-QDsがNSCLC治療用の新規PTT/PDT試薬として開発可能であることを強力に示唆しています。

考察

近年、抗NSCLC戦略の研究は大きく進展しました。特定の変異オンコジーンに依存するNSCLCを標的としたプレシジョンメディシンや免疫チェックポイント阻害療法は、臨床治療に有望な未来をもたらしています。しかし、腫瘍微小環境の複雑さと異質性、腫瘍抗原喪失のリスクを考慮すると、免疫逃避状態に伴う薬剤耐性率を低下させ、短期間での腫瘍再発を防ぐことは依然としてボトルネックです。したがって、NSCLC治療のための新規治療法や媒質の探求は喫緊の課題です。新興アプローチの中で、ナノ材料は効果的ながん殺傷剤として最前線に位置づけられています。小型サイズ、良好な生体適合性、熱伝達能力を活かし、複数のナノ材料が近年の研究で優れたがん殺傷能を示しています。

本研究では、NIRレーザー活性化下で相乗的PTT/PDT効果を発揮し、ROS分泌を介して腫瘍細胞アポトーシスを誘導する新規CoFe₂O₄-QDsを開発しました。他のナノ材料と同様、CoFe₂O₄-QDsは正常細胞と主要臓器に顕著な毒性を示さず、優れた生体適合性を示しました。光熱変換効率は他のナノ材料ほど高くありませんが、NIRレーザー活性化下でがん細胞アポトーシスを誘導するには十分です。CoFe₂O₄-QDsは光吸収において良好な直線関係を示し、NIRレーザーとの併用でROSを生成する可能性があり、優れた光増感剤として機能し得ます。今後、構造最適化や熱感受性元素の導入により光熱変換効率をさらに高め、より優れたPTT/PDT相乗効果を目指せます。また、CoFe₂O₄-QDs表面への化学薬品や抗体の固定化も可能で、更なる殺傷効率向上が期待できます。例えば、抗PD-L1や抗CTLA-4抗体をCoFe₂O₄-QDsに結合させるアプローチは、腫瘍内免疫抑制微小環境を打破する有望な併用療法となり得ます。

また、CoFe₂O₄-QDsによるNSCLC殺傷メカニズムも解明しました。NIRレーザー活性化後の相乗的PDT/PTT効果によるROS分泌が主たるメカニズムです。過剰ROSは酸化ストレスとDNA損傷を引き起こし、下流シグナル経路を活性化して腫瘍細胞死を誘導します。中でも、PI3K/AKT経路が細胞ROSによって調節され、ミトコンドリア機能不全を導くことが知られています。活性化されたAKTはPI3Kによってリン酸化され、アポトーシス促進タンパク質Baxを不活性化し、細胞をアポトーシスから守ります。また、リン酸化AKTはMDM2/p53複合体を安定化し、細胞生存を制御します。本研究では、CoFe₂O₄-QDsによる過剰ROSがPI3K/AKT経路を有意にダウンレギュレーションし、Bax活性化とBcl-2不活性化を介して腫瘍細胞アポトーシスを誘導することを確認しました。ROS阻害剤添加でPI3K/AKT発現が回復し、ROS生成が減少したことでさらに裏付けられました。PI3K/AKT経路は特にがん細胞において細胞生存と死を制御するため、このメカニズム理解は併用療法の更なる選択肢開発に役立ちます。

要約すると、新規光増感剤開発のため、本研究では水熱法で低コストかつ容易にCoFe₂O₄-QDsを構築しました。CoFe₂O₄-QDsは広いNIR吸収、良好な生体適合性、光熱変換能を持ちます。さらに、先行QDs研究と比較して、NSCLC腫瘍に対する相乗的PTT/PDT効果を示し、今後のNSCLC光療法における多機能剤として有望です。NIR照射下では、CoFe₂O₄-QDsは上流PI3K/AKTシグナル経路を介してBcl-2/Bax発現を調節し、ROS生成を誘導することでNSCLCを殺傷します。in vivoでも、CoFe₂O₄-QDs+NIRがNSCLC腫瘍移植片を顕著な毒性なしに完全消失させました。これらの知見は、CoFe₂O₄-QDsが新規NSCLC殺傷試薬として開発可能な有望な応用を持つことを証明しています。