ゼラチナーゼ刺激戦略による口腔扁平上皮癌の腫瘍標的MRI造影剤としてのオムニスキャン負荷ナノ粒子の使用

はじめに

口腔扁平上皮癌（OSCC）は、口腔および顎顔面領域で最も一般的な悪性腫瘍です。 OSCCの特別な場所のため、外科的治療は必然的に口腔顔面領域の機能と審美性に影響を及ぼします。 OSCCの早期かつ正確な診断により、より個別で適切な外科的治療が可能になり、その結果、治療後の罹患率が低下し、患者の予後が改善されます。疾患の治療計画に影響を与える正しい診断と病期分類には、画像技術の使用が必要です[1]。

MRIは、電離放射線を伴わない非侵襲的画像診断法です。それは、軟組織の高解像度および三次元画像を提供するために利用され得る。マルチパラメトリックMRIは臨床試験でテストされており、腫瘍の位置特定に役立つことが証明されています[2]。さまざまな化合物がMRI造影剤として評価されていますが、ガドリニウム（Gd）錯体は引き続き最も広く使用されており、現在クリニックで使用されているすべての薬剤を占めています[3]。ただし、既存のGdベースのMRI造影剤は腫瘍特異的ではなく、腫瘍の正確な検出と特性評価を提供することはできません。サイズが小さいため、これらの薬剤のほとんどは血管内および間質腔に分布し、腎濾過によって急速に排出されます[3]。腫瘍組織の特異性を改善し、MRI造影剤の血流の循環​​時間を延長するために、研究者は可変の新しいMRI造影剤を設計および合成しようとしました[4、5、6、7、8]。

最近では、多くのメトキシポリ（エチレングリコール）（mPEG）および/またはポリカプロラクトン（PCL）関連のナノ粒子（NP）が設計され、研究されています[9、10、11]。これらのNPは、薬物の送達に使用され、薬物の溶解性を高め、循環時間を延長し、透過性と保持効果を高めることで腫瘍への取り込みを促進することにより、治療プロセスを改善しました。 mPEGとPCLは、米国食品医薬品局が承認した共重合体であり、免疫原性、抗原性、毒性が非常に低く、医療用途で広く研究されています[12]。 NPが医療、環境、化学工学の分野で使用される場合、生体適合性と生分解性が重要な特性であることが知られています[13、14]。以前の研究では、mPEGとPCLの間に腫瘍特異的ゼラチナーゼ切断可能ペプチドを挿入したmPEGとPCLに基づくゼラチナーゼ刺激ドラッグデリバリーシステムを開発しました[12]。ドセタキセル、miR-200cなどの治療薬がこのナノ粒子にロードされました。インビトロおよびインビボ研究は、薬物が腫瘍組織に特異的に送達され得ることを示した[15]。私たちのNPは、比較的単純な腫瘍標的戦略に基づいています。強化された透過性と保持（EPR）効果により、ナノ粒子が腫瘍組織に蓄積する可能性があります。腫瘍で広く発現しているゼラチナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ-2/9 MMP2 / 9、コラゲナーゼIV）は、NPを分離し、ロードされた薬物を放出します。アクティブターゲティング戦略とは異なり、当社のNPには、よりシンプルで普遍的なさまざまな治療薬や診断薬をロードする可能性があります。

この研究では、腫瘍を標的とし、生体適合性があり、生分解性のMRI造影剤を確立するという目標を達成するために、同じタイプのNPに広く使用されているMRI造影剤であるOmnをロードしました[16]。 MRI造影剤としてのOmn-NPの有効性は、コントロールとしてOmnのみを使用したヒト口腔扁平上皮癌の異種移植モデルで評価されました。

材料と方法

資料

メトキシ-ポリエチレングリコール-NHS（mPEG-NHS、Mn 5000）は、Beijing Jiankai Technology Co（北京、中国）から購入しました。ゼラチナーゼ切断可能ペプチド（配列：H2N-PVGLIG-COOH）は、Shanghai HD Biosciences Co（Shanghai、China）によって合成されました。 Omniscan（Gadodiamide Injection）は、GE Healthcare（アイルランド）から購入しました。コラゲナーゼIVはSigma（USA）から購入しました。

Omnをロードしたゼラチナーゼ-刺激NPの合成

ゼラチナーゼ切断可能な共重合体mPEG-Pep-PCLおよびペプチドを含まないmPEG-PCLは、以前の研究[17]と同じように開環共重合によって合成されました。 Omn-NPは、ダブルエマルジョン溶媒蒸発法によって配合されました。簡単に説明すると、10mgのmPEG-Pep-PCLコポリマーを1mLのジクロロメタン（DCM）に溶解しました。次に、0.1 mL、0.2 mL、0.3mLのOmnをそれぞれ添加しました。この混合物を3mLの3％（w / v）ポリビニルアルコール（PVA）水溶液に超音波処理（XL2000、Misonix、ファーミングデール、ニューヨーク、米国）で60秒間乳化し、油/水（o / w）エマルジョンを得ました。 。次に、このエマルジョンを、PVAを60秒間超音波処理することにより、0.5％（w / v）を含む5mLの水溶液に乳化しました。形成されたw / o / wエマルションを、有機溶媒が蒸発するまでドラフト内で室温で穏やかに攪拌しました。得られた溶液を濾過して、組み込まれていない薬物を除去した。ブランク-NPは、Omnを追加せずに、説明したのと同じ方法で準備しました。 OmnをロードしたmPEG-PCLNP（Con-Omn-NP）は、10 mgのmPEG-PCLコポリマーで合成され、0.2mLのOmnは同じ手順に従いました。

NPの粒度測定と形態検査

Omn-NPとブランク-NPの粒子サイズと安定性は、動的光散乱（DLS）（Brookhaven Instruments Corporation、USA）によって測定されました。 Omn-NPとブランク-NPは室温で保存されました。粒子サイズは、Omn-NPの安定性を評価するために2日ごとにDLSによって決定されました（合計6日間）。値は、単一サンプルの3回の測定の平均でした。 Omn-NPおよびブランク-NPの形態検査は、透過型電子顕微鏡（TEM）（JEM-100S、JEOL、日本）を使用して実施しました。適切に希釈されたNP懸濁液の1滴を、ニトロセルロース膜で覆われた銅グリッド上に置き、室温で風乾しました。観察前に、サンプルを1％（w / v）リンタングステン酸ナトリウム溶液でネガティブ染色しました。

薬物の充填内容とカプセル化の効率

ガドリニウムイオンの濃度を計算することにより、Omn-NPの薬物負荷量とカプセル化効率を分析しました。 1ミリリットルのOmn-NPを濃硝酸で分割し、次に混合物を希硝酸で希釈しました。サンプルは、誘導結合プラズマ原子発光分析（ICP-AES、Optima 5300DV、PerkinElmer、米国）によってテストされました。

コラゲナーゼに応答したNPの巨視的変化と微視的形態学的変化

OmnをロードしたmPEG-PCLNP（Con-Omn-NP）およびmPEG-Pep-PCL NP（Omn-NP）を、コラゲナーゼIV（0.34 mg / mL）を含むハンクス溶液と37°Cで24時間インキュベートしました。溶液の透明度の変化は肉眼で観察されました。

Con-Omn-NPsおよびOmn-NPs（コラゲナーゼの有無にかかわらずインキュベートされた）の顕微鏡形態評価は、TEMを使用して実施されました。 TEMの場合、NP懸濁液の1滴をニトロセルロース膜で覆われた銅グリッド上に置き、観察前に風乾しました。

V itro C ellular U ptake

ヒト口腔扁平上皮癌株（HSC3）は、上海の第9病院から提供されました。腫瘍細胞を24ウェルプレートに5×10 ⁵ の密度で播種しました。 ウェルあたりの細胞数と24時間培養。次に、クマリン-6をロードしたmPEG-Pep-PCL NP（クマリン-6で計算して12.5μg/ mL）を培養培地に添加し、37°C​​で0.5時間および1時間インキュベートしました。培養培地を吸引し、PBSで3回洗浄した。細胞を無水エタノール（ウェルあたり1 mL）で20分間固定し、PBSで3回洗浄しました。細胞は、免疫蛍光細胞化学および共焦点レーザー走査型顕微鏡（LSM710、Carl Zeiss MicroImaging GmbH、ベルリン、ドイツ）によって観察された。クマリン-6の励起および発光波長は460nmでした。

動物

すべての動物実験は、米国国立衛生研究所が発行した実験動物の管理と使用に関するガイド（NIH出版物No.85-23、1985年改訂）のガイドラインに完全に準拠して実施され、倫理審査委員会によって承認されました。南京大学医学部南京口内科病院の動物実験。 BALB / cマウス（5〜6週間、18〜22 g）は、南京大学のモデル動物研究センターから購入しました。体重や皮膚の状態を含む動物の健康状態を週に2回モニターしました。動物の可動性と体重減少の減少である潰瘍形成は、実験中に観察されませんでした。

OSCCモデルの確立

腫瘍細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）、100 U / mLペニシリン、および100 mg / mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で、37°C​​、5％CO _{を含む加湿雰囲気で培養しました。 2} そして95％の空気。ヒトOSCCの異種移植モデルを確立するために、ヒトOSCC細胞HSC3（1×10 ⁶ 50μLリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の細胞をヌードマウスの右脇の下に皮下接種しました（グループあたり3匹のマウス）。ノギスで1日おきに腫瘍の大きさを測定しました。腫瘍の直径が約0.4〜0.5 cmになると、マウスはin vivoMRイメージング実験の準備が整いました。

Omn-NPとOmnを造影剤として使用したInVivoMRI検査

インビボ研究のために、我々はマウスを２つのグループ（ＡおよびＢ）に分けた。グループAのマウスには尾静脈からOmn-NPを注射し、グループBのマウスにはロードしたNPと同じ濃度のOmnを注射しました。両方のグループは、Bruker Biospin 7.0 T MRIスキャナー（Bruker BioSpin、Ettlingen、ドイツ）を使用してスキャンされました。パラメータは次のように設定されました。視野（FOV）、3.5×2.5cm。スライス厚、0.8 mm; TR、745.2 ms; TE、7.5ms。マウスの軸方向スライスは、T1強調スピンエコーシーケンスを使用して取得されました。画像は、2つの造影剤の静脈内投与の前と後の異なる時点で取得されました。

腫瘍および正常組織におけるMMP2 / 9の発現

インビボMRI検査後、OSCCマウスモデルからの腫瘍組織、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、および筋肉組織が、MMP2およびMMP9の免疫組織化学的（IHC）染色のために選択された。すべての組織を解剖し、10％中性緩衝ホルマリンで固定し、通常はパラフィンに加工し、5μmの厚さに切片化しました。 MMP2 / 9の半定量的発現（-、+、および++）のIHC検査は、光学顕微鏡を使用して実施されました。

統計分析

統計分析は、学生の t を使用して実行されました テスト。データは平均±SD、および p の値としてリストされました。 <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果と考察

mPEG-Pep-PCLナノ粒子の特性評価

¹ H NMR（CDCl ₃ ）mPEG-Pep-PCL共重合体のスペクトルにより、ペプチドがmPEGと正常に結合し、mPEG-Pep結合体がPCLと正常に結合したことが確認されました（図1a）。 mPEG-Pep-PCLコポリマーの親水性ブロックと疎水性ブロックのモル比（mPEG / PCL）は、PCLセグメントの-CH2-O-（4.04 ppm）と-CH2-CH2-O（ ¹ のmPEGセグメントで3.65ppm） HNMR測定。

a ¹ CDCl3中のPEG-Pep-PCLのH核磁気共鳴スペクトル（300 MHz、25μC）。 b ブランクNPとOmnをロードしたNPの直径と多分散度指数（0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL）。 c OmnをロードしたNPの安定性（0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL）。 d ブランクNPおよびOmnをロードしたNPのTEM顕微鏡写真。エラーバーは、3つの別々の測定値の標準偏差を表します

NPの粒子サイズと安定性

粒子サイズと多分散度指数（PDI）は、DLSによって決定されました（図1b）。 3つのOmn-NP間で粒子サイズに有意差は見られませんでした（ p > 0.05）、Omn-NPとブランク-NPの間に有意差が見つかりました（ p <0.05）。 PDIの場合、これらのOmn-NP間で有意差は見つかりませんでした（ p > 0.05）、ただし、Omn-NPとブランク-NPの間には有意差がありました（ p <0.05）。

Omn-NPの安定性については、3つのOmn-NPすべてで沈殿やサイズの明らかな変化は観察されませんでした（図1c）。これは、Omn-NPが安定していることを示しています。

NPの形態学的研究

ブランク-NPおよびOmn-NPのTEM顕微鏡写真を図1dに示します。オブレート形状は、ブランクNPとOmn-NPの両方で観察することもでき、Omn-NPは、サイズが異なるため、ブランクNPよりもはるかに小さかった。さらに、NPのOmnは明確に区別でき、NPでは暗い粒子として現れました。このOmn粒子は、NP内に分散して観察できました。

薬物の読み込みコンテンツとカプセル化の効率

3つのOmn-NPの薬物負荷量とカプセル化効率を表1に示します。結果は、0.3 mLOmnが最高の薬物負荷を示しましたが、カプセル化効率は非常に低く、0.1 mLOmnは最高のカプセル化効率と比較的近いことを示しました。 0.2mLおよび0.3mLのOmnによる薬物負荷。薬物の負荷とカプセル化の効率の両方を考慮して、0.1mLのOmn-NPを最終的なinvivoMRI研究で使用しました。カプセル化効率が低いことは、反応システムでは、追加したOmnがNPに十分であることも示しています。

コラゲナーゼIVに応答したOmn-NPおよびCon-Omn-NPの巨視的および微視的形態変化

ゼラチナーゼ（コラゲナーゼIV）に応答したNPの切断を検証するために、2 mg / mLコラゲナーゼIVを含むハンクス溶液とのインキュベーション後のOmn-NPおよびCon-Omn-NPの巨視的および顕微鏡的形態変化を評価しました。 A1とB1は、コラゲナーゼIVとのインキュベーションの前後でCon-Omn-NPの透明な溶液を示し、A2とB2は、インキュベーションの前後でTEMを使用したCon-Omn-NPの微視的形態に変化が見られなかったことを示しました。 C1とD1は、コラゲナーゼIVとのインキュベーション前後のOmn-NPの溶液を示しました。 D1は、24時間後にOmn-NP溶液で沈殿が発生したため、液体が濁ったことを示しました。 D2は、コラゲナーゼIVに応答したOmn-NPのTEM画像を示し、NPの構造が破壊されました（図2）。この結果は、NPがゼラチナーゼ刺激であることを示しています。ペプチドの切断によりNPが破壊され、ロードされた薬物が放出されます。また、ペプチドを切断してロードされた薬物を放出する機能は、薬物放出および以前の研究[12、18]でも実証されました。

a1 、 a2 、 b1 、 b2 、 c1 、 c2 、 d1 、 d2 コラゲナーゼIVとのインキュベーション後のOmnをロードしたmPEG-PCLNP（Con-Omn-NP）およびOmnをロードしたmPEG-Pep-PCL NP（Omn-NP）の巨視的および顕微鏡的形態変化

インビトロ細胞取り込み研究

クマリン-6をロードしたNPの細胞内取り込みを図3に示します。クマリン-6からの緑色蛍光がHSC3細胞の細胞質に示され、クマリン-6がNPと一緒にサイトゾルに入ったことを示唆しています。クマリン-6はもともとNPに閉じ込められていたため、NPが細胞膜バリアに効果的に浸透し、エンドサイトーシスを介して細胞質に分布する可能性があることを示しています。

a、b ナノ粒子のinvitroHSC3細胞取り込み研究。クマリン-6をロードしたNPとのインキュベーション後のHSC3細胞の共焦点顕微鏡画像

Omn-NPとOmnを造影剤として使用したインビボでのMRイメージング

Omn-NPおよびOmnを0.025mmol / kg（Gd ³⁺ ）の用量で静脈内投与する前に画像を取得しました。 ）2つのグループの。次に、造影後の画像を、注射後5分、15分、30分、60分、90分、120分、150分、180分で取得しました（図4a）。腫瘍からバックグラウンドへの信号（TBR） ）比率が計算され、Omnと比較したOmn-Npsを使用した評価の定量化可能な指標として使用されました。その結果、Omn-NPの最大TBRは2.23±0.10、Omnは1.48±0.01、ピークまでの時間はOmn-NPで30分、Omnで5分、信号増強持続時間はOmn-で180分でした。 NPおよびOmnの場合は30分（図4b）。 2つのグループ間で最大TBRと保持時間に有意差がありました（ p <0.05）。私たちのOmn-NPは比較的低い薬物負荷を持っていましたが、Omn単独と比較して優れた強化されたin vivoMRイメージングが実証されました。これはまた、私たちのOmn-NPがゼラチナーゼ刺激および腫瘍特異的であることを証明しました。

a 、 b T1強調シーケンスで取得された指定された腫瘍位置でのヒトOSCCの異種移植モデルのアキシャルMRI画像と腫瘍対バックグラウンド比の折れ線グラフ。エラーバーは、3つの別々の測定値の標準偏差を表します

OSCCの診断には、単一光子放射型コンピューター断層撮影[19]、ポジトロン放射型断層撮影（PET）[20]、光学画像[21]などの最近の高度な画像技術が使用されましたが、MRIは依然として最も広く使用され信頼性があります。 TNMがん病期分類システム[1]およびガドリニウムキレートに従って頭頸部腫瘍を病期分類するためのツールは、依然として最も広く使用されているMRI造影剤です[22]。

特にMRI造影剤のために腫瘍を標的化するという目標を達成するために、能動的および受動的標的化戦略が使用されてきた[2、23、24]。アクティブターゲティング[12]は、がん診断において大きな焦点となっています。アプタマー[25]、ペプチド[8]、抗体[6]、葉酸[26]などの標的リガンドは、腫瘍細胞または血管系によって過剰発現される特定の受容体に結合するために高分子および超分子多量体Gd複合体に結合します。ただし、これらの高分子および超分子の生体適合性および生分解性の特性は明確ではなく、それらの非生分解性は臨床応用を妨げます。ただし、Omn-NPは、PEG、PCL、ゼラチナーゼ切断ペプチド、およびOmnで構成されています。 PEGとPCLは優れた生体適合性と生分解性を備えており、Omnは臨床的に広く使用されているMRI造影剤です。したがって、Omn-NPは優れたバイオセーフティを備えていることが期待されます。

親水性mPEGによるポリマーの修飾は、血液循環を延長し、腫瘍におけるNPの蓄積を増加させる可能性があります。 PEG化は、血清タンパク質の付着を減らし、細網内皮系による取り込みを回避することで循環時間を延長するステルス表面を作成する可能性があります[12、17]。この研究では、カプセル化された薬物の濃度が腫瘍部位で特異的に増加し、有意に延長された増強持続時間が観察された。したがって、TBRのピークポイント時間ははるかに遅く、イメージング待ち時間はOmnグループよりもOmn-NPsグループの方がはるかに長かった。

さらに、改善された特異性と延長された増強持続時間は、ガドリニウムイオンの注入用量を最小限に抑え、したがって、ガドリニウムベースの造影剤の設計における懸念である腎性全身性線維症のリスクを低減します[27、28]。

MMP2およびMMP9のIHC染色

臓器および腫瘍組織からの正常組織のMMP2およびMMP9のIHC染色の結果を図5に示します。結果は、腫瘍組織におけるMMP2およびMMP9の発現レベルが（++）であったのに対し、ほとんどの正常組織では（++）であることを示しました。だった（- ）。腫瘍組織では、細胞の形質細胞と細胞外マトリックスが目に見えて茶色に染色されており、MMP2 / 9の発現レベルが高いことを示しています。

a 、 b ヒト口腔扁平上皮癌株の異種移植マウスモデルの正常組織および腫瘍組織におけるMMP2およびMMP9のIHC染色

マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）ファミリーは、癌の浸潤と転移に重要な役割を果たし、コラゲナーゼIVおよびゼラチナーゼA / Bとしても知られるMMP2 / 9は、最も重要な癌関連MMPであると報告されています。研究により、ゼラチナーゼの発現と、OSCCを含む多くの腫瘍の転帰不良との相関関係が明らかになりました[29、30]。 MMP2 / 9の高発現も我々の研究で観察された。 MMPは、その広範な発現と癌との密接な関係から、間違いなく重要な抗癌標的です。したがって、Omn-NPはほとんどすべての腫瘍で使用できます。そのシンプルさと普遍性は、優れた臨床応用の可能性を秘めています。

結論

この研究では、クリニックで現在使用されている造影剤の欠陥を補うために、新しい腫瘍標的MRI造影剤デリバリーシステムを設計および合成しました。 OSCCマウスモデルでは、Omn-NPの方がOmnよりもMRIT1腫瘍対バックグラウンド比が高く血液循環時間が長いことがわかりました。この研究は、Omn-NPが腫瘍特異的MRI造影剤として、腫瘍組織の特異性を改善し、循環時間を延長する可能性があることを示しています。 PEGとPCLの優れた生体適合性と生分解性を考慮すると、Omnは臨床的に広く使用されているMRI造影剤であるため、この腫瘍標的MRI造影剤デリバリーシステムは優れた臨床応用の可能性を秘めています。さらに、感度を高めるために、NPでのOmnの薬物負荷量とカプセル化効率を高めるためのさらなる努力がなされます。

データと資料の可用性

この研究の結果を裏付けるデータは、リクエストに応じて対応する著者から入手できます。

略語

NP：

ナノ粒子

Omn：

オムニスキャン

OSCC：

口腔扁平上皮がん

MMP：

マトリックスメタロプロテイナーゼ

Gd：

ガドリニウム

mPEG：

メトキシポリ（エチレングリコール）

PCL：

ポリ（ε-カプロラクトン）

ペップ：

ペプチド

Omn-NPs：

OmniscanをロードしたmPEG-Pep-PCLNP

Con-Omn-NPs：

OmniscanをロードしたmPEG-PCLNP

MRI：

磁気共鳴画像法

EPR：

強化された透過性と保持力

DCM：

ジクロロメタン

PVA：

ポリビニルアルコール

DLS：

動的光散乱

PDI：

多分散度指数

TEM：

透過型電子顕微鏡

ICP-AES：

誘導結合プラズマ原子発光分析

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

FBS：

ウシ胎児血清

IHC：

免疫組織化学

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水