PEG‑block‑PLAポリマーソームを用いた新生仔豚膵島様細胞クラスターの効率的ナノカプセル化

概要

ポリエチレングリコール‑ブロック‑ポリ乳酸（PEG‑b‑PLA）から形成されるポリマーソーム（PSome）を用いて、新生仔豚膵島様細胞クラスター（NPCC）をナノカプセル化する手法を確立した。本研究では、NPCCの損傷と損失を最小限に抑えた効率的なナノカプセル化手順を提示する。PSomeのN末端にN‑ヒドロキシサクシニミド（NHS）を導入し、NPCCを取り巻く細胞外マトリックス（ECM）のアミノ基との結合を誘導した。ナノカプセル化工程では、牛血清アルブミン（BSA）を含むF‑10培地を用いてNPCCのダメージと損失を低減した。さらに、二官能基PSome（NHS‑/NH₂‑PSome）間の架橋を誘導し、カプセル化効率を高めた。pH 7.3、0.25 % BSA含有F‑10培地は、従来の塩基性HBSS緩衝液（pH 8.0）と比較して、ナノカプセル化後のNPCC損傷と損失を有意に抑制した。また、二官能基PSomeの共役により、効率的なナノカプセル化が達成された。

はじめに

1型糖尿病治療における同種膵島移植は、適切なドナー不足によって制限されている。代わりに、異種膵島移植における動物膵島の利用が徐々に増えており、ブタが最適なドナー種として浮上している^[1]。ブタをドナーとする場合、年齢に応じて個別の膵島を使用できる。特に新生仔豚膵島様細胞クラスター（NPCC）は、成豚膵島（API）に比べて安価で分離が容易なため好まれる。さらにNPCCは移植後に徐々に増殖し、生体内での機能を長期化できる^{[1, 2]}。しかし、NPCCをヒトや非ヒト霊長類（NHP）の門脈に移植すると、種間差によって即時血液介在性炎症反応（IBMIR）や超急性拒絶反応などの免疫反応が誘発され、早期グラフト喪失につながる^[3]。この問題を解決するには、さまざまな免疫応答を阻害できるNPCCのカプセル化が必要である。カプセル化にはマクロ、マイクロ、ナノの3種類がある。マクロカプセル化は膵島を含むデバイスを血管周囲に植込み、半透膜を通じて血糖値に応じてインスリンを放出させる。マイクロカプセル化は少数の膵島を多孔性カプセルに封入する。これらのカプセル化は免疫拒絶から膵島を保護できるが、生体内試験では膜崩壊や血栓生成などの副作用が報告されている。また、拡散距離の増大によりホルモン、栄養、酸素の流れを阻害する懸念もある。ナノカプセル化は、主にポリエチレングリコール（PEG）などの外来タンパク質と細胞の付着を誘導する細胞表面修飾戦略であり、輸血分野で用いられてきた^[4]。

PEGを用いたナノカプセル化は、標的タンパク質やペプチドの効率と物理化学的特性を改善する修飾法として広く利用されている^[5]。特に膵島のナノカプセル化は、免疫細胞の攻撃や抗体認識に対する抑制効果が期待される。PEGは非免疫原性、抗原マスキング、非汚れ効果などの生体適合性に優れ、細胞コーティングに広く用いられている^[6]。NPCCのナノカプセル化に用いられるナノ粒子の中で、「ポリマーソーム（PSome）」と呼ばれるPEG‑b‑PLAベースのものは、安定で修飾が容易、かつ親水性・疎水性試薬の両方を組み込めるため最適とされる^{[7, 8]}。膵島の細胞外マトリックス（ECM）と官能基導入ポリマーとの共有結合または非共有結合により、PEG含有ポリマーによる膵島表面修飾が達成される^[9]。

従来の研究では、NHS‑NH₂結合を促進するため、塩基性ハンクス平衡塩液（HBSS、pH 8.0）が膵島ナノカプセル化の反応緩衝液として用いられてきた^[10,11,12]。しかし、ナノカプセル化時のNPCC細胞障害を最小限に抑えるため、本研究では生理的pH（pH 7.3）のF‑10培地（NPCC培養培地）を用いた。また、移植に適した細胞量を確保するため、ナノカプセル化後のNPCC回収率を高める目的で、長鎖ポリマーで培養皿底面をコーティングする牛血清アルブミン（BSA）を添加した^[13]。過去の研究では、NHSやNH₂などの単一官能基を用いてNPCCのECMとの共有結合や静電相互作用を誘導していたが、時間経過とともに結合親和性が低下するため、結合効率を高める戦略が必要だった^[14]。二官能基を持つPSomeは凝集能を有するため、コーティング効率向上の候補となる。そこで、NPCCのECMに結合できるだけでなく、PSome同士が共有結合や静電相互作用で架橋できる二官能基PSome（NHS‑/NH₂‑PSome）を用いて架橋を誘導し、ナノカプセル化効率を向上させた。

本研究では、ブタ膵島異種移植分野におけるNPCCナノカプセル化の最適化手法の適用可能性を検討した。

材料と方法

動物

すべての動物実験はMGENPLUS株式会社の機関動物実験委員会（#2019‑1）の承認を受け、同委員会のガイドラインに従って実施された。手術は全身麻酔下で行い、動物の苦痛を最小限に抑えるよう努めた。膵切除前にブタを安楽死させた。

新生仔豚膵島様細胞クラスター（NPCC）の分離

NPCCは生後3～5日の仔豚から分離した。簡潔に述べると、ケタミン（10 mg/kg、Yuhan、ソウル、韓国）とキシラジン塩酸塩（1 mg/kg、Rompun；バイエルコリア、ソウル、韓国）を大腿筋に注射して麻酔し、塩化カリウム（シグマアルドリッチ、MO、USA）を心臓に注射して安楽死させた。腹部切開で膵臓を露出、摘出し、8.3 mM炭酸水素ナトリウム、10 mM HEPES（シグマアルドリッチ、MO、USA）、0.5 %抗生物質・抗真菌剤（Biowest、MO、USA）を含むHBSS（Biosesang、京畿道、韓国）に浸した。膵臓を1～2 mm³に切断し、HBSS中のコラゲナーゼV型（1 mg/ml、シグマアルドリッチ、MO、USA）で10分間消化した。10 %胎児牛血清（FBS、Biowest、MO、USA）含有冷HBSSを加えて酵素反応を停止し、HBSSで洗浄後、再懸濁して500 μmプルリストレーナー（pluriSelect、ライプツィヒ、ドイツ）で濾過、再度HBSSで洗浄した。最終的にNPCCを、0.25 % BSA（genDepot、TX、USA）、10 mMニコチンアミド、10 mM D‑グルコース、2 mM L‑グルタミン、2 mM塩化カルシウム二水和物、50 μM IBMX、20 μg/mlシプロフロキサシン（シグマアルドリッチ、MO、USA）、1 %抗生物質・抗真菌剤を添加したF‑10培地（Gibco、CA、USA）で、5 % CO₂、37 ℃で播種・培養した。NPCCは5日間培養し^[15]、毎日10 nMエキセンジン‑4（Prospec、ネス・ツィオナ、イスラエル）を培地に添加した。

NPCCおよびナノカプセル化NPCCのin vitro評価

培養後、接眼レティクルを用いて膵島当量（IEQ）としてNPCC数を計測した。生存率はアクリジンオレンジ（AO、0.67 μM、シグマアルドリッチ、MO、USA）とヨウ化プロピジウム（PI、75 μM、シグマアルドリッチ、MO、USA）染色で評価した。グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）アッセイでは、20～30個のNPCCをピッキングし、低グルコース（2.8 mM）のKrebs‑Ringer重炭酸緩衝液（KRBB）で1時間プレインキュベートした。その後、低グルコース（2.8 mM）KRBBで1時間、高グルコース（28.0 mM）KRBBで1時間インキュベートし、上清を回収して低・高グルコース条件下のインスリン分泌量を測定した^[11]。インスリン量はヒト/イヌ/ブタインスリンQuantikine ELISAキット（R&D Systems、MN、USA）で測定した。刺激指数（SI）は、高グルコース（28.0 mM）時のインスリン量を低グルコース（2.8 mM）時の量で割って算出した。

ポリマーソーム（PSome）の調製

PSome調製には、N‑ヒドロキシサクシニミド‑ポリ（エチレングリコール）‑ブロック‑ポリ（乳酸）共重合体（10 mg/ml、NHS‑PEG‑b‑PLA）またはアミノ‑ポリ（エチレングリコール）‑ブロック‑ポリ（乳酸）共重合体（10 mg/ml、NH₂‑PEG‑b‑PLA；Nanosoft Polymers、NC、USA）をジメチルスルホキシド（DMSO、シグマアルドリッチ、MO、USA）1 mlに溶解した。二官能基PSomeを調製する場合、各共重合体（NHSまたはNH₂‑PEG‑b‑PLA）をDMSOに溶解後、所定比率で混合した。蒸留水（DH₂O）を加えて最終濃度1 mg/mlとし、超音波処理機（Sea han ultrasonic、ソウル、韓国）で5分間超音波処理した。可視化のため、超音波処理中に1,1′‑ジオクタデシル‑3,3,3′,3′‑テトラメチルインドジカルボシアニン、4‑クロロベンゼンスルホネート塩（DiD；Biotium、CA、USA）を添加した。最後に蒸留水で3日間透析した。

ナノカプセル化

PSomeをナノカプセル化反応緩衝液（HBSS（pH 7.3または8.0）または無添加プレーンF‑10培地（pH 7.3または8.0）、0.25 % BSAあり/なし）で希釈した。培養培地中のNPCCにPSomeを添加してナノカプセル化を行った。6ウェル培養皿（SPL、京畿道、韓国）に10,000 IEQのNPCCを播種し、希釈PSomeを加えて5 % CO₂、37 ℃で1時間インキュベートした。陰性対照（NC）群（PSome非処理NPCC）は同条件でインキュベートした。インキュベーション後、ナノカプセル化NPCCを回収し、F‑10培地で培養した。

ナノカプセル化NPCCの効率評価

DiD標識PSomeでナノカプセル化したNPCCを蛍光顕微鏡（Leica、ヴェッツラー、ドイツ）または共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM；Carl Zeiss、オーバーコッヘン、ドイツ）で観察した。ImageJソフトウェア（NIH、ベセスダ、USA）を用いて平均蛍光強度（MFI）を算出し、DiD標識PSome結合NPCCの強度を定量化した。細胞核はDAPIで対比染色した。

ポリマーソーム透過性アッセイ

F‑10またはF‑10（0.25 % BSA）中のNHS‑PSomeナノカプセル化NPCCを、分子量の異なるフルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識デキストラン（10、20、70、250 kDa）と2時間インキュベートした。共焦点レーザー走査顕微鏡で各分子量のFITC‑デキストランのNHS‑PSomeナノカプセル化NPCCへの浸透を確認した。

ポリマーソーム細胞生存率アッセイ

RPMI 1640（Biowest、MO、USA）中のNHS‑PSomeナノカプセル化THP‑1（ヒト単球性細胞株）を1時間インキュベートし、MTT細胞増殖アッセイキット（iNtRon Biotechnology、城南市、韓国）のプロトコルに従って生存率を測定した。

統計解析

GraphPad Prism 6.0で対応のないt検定を実施した。統計的有意性は*、**、***、****でそれぞれP ≤ 0.05、≤ 0.01、≤ 0.001、≤ 0.0001を示す。

結果

NPCCの培養と機能評価

NPCCを5日間培養し、生存率とGSISを含む品質管理を行った。総NPCC数は21,014.0 IEQ/g/膵臓だった。AO/PI染色による生存率は89.9 %だった。グルコース濃度に対するNPCC応答性を確認するGSISでは、平均刺激指数（SI）は2.3だった（表1、追加ファイル1：Fig. S1）。

NPCC効率的ナノカプセル化に必要なPSome濃度

効率的なナノカプセル化に必要なPSome濃度を決定するため、NHS‑PSomeをさまざまな濃度でNPCCに添加した。NHS‑PSomeはDH₂O中で1 mg/mlに調製し、1:5、1:10、1:20、1:40に希釈して最終濃度0.2～0.025 mg/mlとした。ナノカプセル化効率は、DiD含有PSomeでナノカプセル化したNPCCのMFIで評価した。ナノカプセル化2日後、0.1 mg/ml（1:10希釈）で最高の蛍光強度を示した（Fig. 1a、b）。以降の実験ではこの濃度を用いた。

生理的pHのF‑10培地によるナノカプセル化効率の向上

膵島（NPCC含む）のナノカプセル化は、膵島ECMのNH₂とポリマー共役NHSの結合親和性を高めるため、塩基性HBSS緩衝液（pH 8.0以上）で行われることが多い。しかし、塩基性HBSSはNPCCを損傷する恐れがある。そこで、NPCCのダメージを最小限に抑え、pHがNHS‑NH₂結合に及ぼす影響を調べるため、HBSS緩衝液または本研究でNPCC培養に用いたプレーンF‑10培地を、pH 7.3（生理的）とpH 8.0（塩基性）でそれぞれ用いてNHS‑PSomeによるNPCCナノカプセル化を行った。F‑10培地ではNPCCの正常な形態が維持され（Fig. 2a）、pHに関わらずHBSS群と比較してMFIベースのナノカプセル化効率が日0と日6で有意に向上した（Fig. 2b）。HBSS群では日6にpH 7.3と8.0で有意差が見られたものの、ナノカプセル化強度はF‑10群より有意に低かった。したがって、以降の実験では生理的F‑10培地（pH 7.3）をナノカプセル化反応緩衝液として用い、NPCCへの潜在的ダメージを最小限に抑えた。

ナノカプセル化後のNPCC回収率向上

F‑10培地で細胞ダメージは最小限に抑えられたものの、ナノカプセル化後のNPCC回収量が著しく減少した。この問題を解決するため、NPCCの培養およびNHS‑PSomeを用いたナノカプセル化時に0.25 % BSAをF‑10培地に添加した。まず、0.25 % BSA添加がコーティング効率と選択的透過性（10および20 kDa FITC‑デキストランの通過を許容し、70および250 kDaを遮断するPSomeの必須機能）に影響するかを検証した。その結果、F‑10に0.25 % BSAを添加しても、CLSM画像でコンフォーマルコーティングが確認され（Fig. 3a、Mid）、選択的透過性も正常に維持された（Fig. 3b、FITC‑デキストラン）、MFIはわずかに低下したのみだった（Fig. 3b）。ナノカプセル化後のNPCC回収率は、F‑10（0.25 % BSAあり）で71.9 %、F‑10（BSAなし）で42.3 %と、BSA添加群で有意に高かった（Fig. 3c）。F‑10（0.25 % BSA）中のNPCC生存率（NC: 89.5 %、NHS‑PSome: 90.3 %）とGSIS（NC: 2.1、NHS‑PSome: 1.6）もナノカプセル化後も維持された（Fig. 4a、b、追加ファイル1：Fig. S2）。これらの結果は、0.25 % BSA添加がナノカプセル化後のNPCC回収率を有意に向上させ、PSomeのコーティング効率や機能に影響を与えないことを示している。

PSome架橋によるナノカプセル化安定性の向上

より安定したNPCCナノカプセル化を実現するため、異なる官能基を持つPSomeの共役を試みた。まず、NHSとNH₂の二官能基を持つPSome（NHS‑/NH₂‑PSome）をさまざまな比率（9:1、5:5、1:9）で同時に添加し、NPCCをナノカプセル化した（Scheme 1）。効率はDiD標識PSomeナノカプセル化NPCCのMFIで確認した。蛍光顕微鏡画像では、日0と日1で9:1、5:5、1:9群に有意差は見られなかった（Fig. 5a）。しかし、CLSMでは日1に5:5群が過剰コーティング、1:9群が不十分なコーティングだったのに対し、9:1群がコンフォーマルコーティングを形成していた（Fig. 5b）。したがって、PSome中のNHS/NH₂最適比率は9:1と決定した。9:1群の機能評価では、生存率がNC対照（92.1 %）と比較して有意に低下したものの、正常レベル（87.8 %）を維持した。SI機能もNC対照（3.7）と比較して正常（3.0）だった（Fig. 5c、d）。

考察

糖尿病（糖尿病性疾患）は高血糖を特徴とする代謝疾患である。1型糖尿病は膵臓β細胞が十分なインスリンを産生できないことで発症する^[16]。インスリン産生β細胞を含む膵島移植は近年、1型糖尿病治療に用いられている。しかし、同種膵島移植はドナー不足で制限されており、代わりに非ヒト動物由来膵島を用いた異種移植が代替ドナー源として浮上している。ヒトとの生理的類似性、大量繁殖の容易さ、病原体フリー施設での飼育可能性から、ブタは異種膵島移植の最適な動物モデルとされる^[1]。特にNPCCはAPIと同等に貴重である。NPCCの成熟度はAPIより低いが、分離手技が比較的簡単で安価、低酸素環境への耐性獲得や移植後の生体内増殖能など、APIに対する利点がある^[1,2,3]。これらの理由から、本研究では生後3～5日の新生仔豚を膵島源として用いた。

残念ながら、ブタ膵島をヒトや非ヒト霊長類の血管に移植すると、IBMIRや超急性拒絶反応などの重篤な免疫反応が頻発する。IBMIRは通常、ブタ膵島に発現する複数の組織因子（TF）が、外因性経路の活性化を通じてヒト血管内で凝固を媒介することで発生する。ブタ細胞表面に発現するα‑ガラクトースや非ガラクトース抗原が天然ヒト抗体の標的となり、補体カスケード活性化（超急性拒絶）を引き起こす。その結果、凝固経路による血栓形成に伴う低酸素と、補体活性化による細胞死でグラフトが失われる^[3]。これらの問題を解決するため、生体適合性材料で膵島をコーティングし、抗体や補体反応からの攻撃を防ぐカプセル化が試みられてきた。まずマクロカプセル化は、半透膜を持つデバイスに膵島を封入し、血管付近に植込んで血糖値に応じて血流中にインスリンを放出させる^[4]。次にマイクロカプセル化は主にアルギン酸を用い、選択的透過性を持ち、酸素と栄養を通しながらサイトカインや免疫細胞の浸潤を遮断する。しかし、膵島サイズに関わらず同サイズのカプセルを用いるためコンフォーマルコーティングが困難で、移植後に線維化が生じてグラフトを包み込むことがある^[17]。最後に、膵島表面修飾（ナノカプセル化）は主にポリエチレングリコール（PEG）を用い、「ステルス効果」によってPEGコーティング物質と血液成分（免疫細胞）の相互作用を生体内で遮断する^{[11, 18]}。本研究のNPCCナノカプセル化戦略では、修飾PEG共重合体（PEG‑b‑PLA、ポリマーソーム、PSome）を用いる。PSomeは親水性と疎水性を併せ持ち、免疫抑制剤や細胞分化・増殖因子を組み込める^[8]。

PEGを用いた膵島ナノカプセル化は、PEG上のNHSと膵島ECM上のNH₂の結合親和性を高めるため、塩基性HBSS緩衝液（pH 8.0以上）で行われてきた^[10,11,12]。しかし、これらの条件は適切な細胞培養環境を提供できないため、NPCC培養条件を模倣した環境でのナノカプセル化を試みた。上記課題に対処するため、NPCC培養基礎培地であるプレーンF‑10培地（無添加、生理的pH）をナノカプセル化反応緩衝液として試験した。生理的pHのF‑10培地でのナノカプセル化は、塩基性HBSS緩衝液を用いた条件と比較して同等のコーティング効率を示し、NPCCの正常形態を維持した（Fig. 3）。したがって、NPCC培養環境を模倣した条件下でNPCCダメージを最小限に抑えるナノカプセル化プラットフォームを提案できる。

NPCCダメージを最小限に抑えるナノカプセル化法を確立したものの、シャーレでナノカプセル化を行うと、その後のNPCC残存量が減少した。これは移植用ナノカプセル化により多くのNPCCが必要となることを意味する。先行報告では、分離時にBSAを用いることで一部のマウス株で膵島収率が向上したとある^[19]。また、ラット肝腫瘍細胞培養では、BSAを培養皿表面のプレコーティングに用いて懸濁培養を行った例がある^[13]。したがって、ナノカプセル化後のNPCC量を増やすため、NPCC培養時と同じ濃度の0.25 % BSAをF‑10ナノカプセル化反応緩衝液に添加した。その結果、ナノカプセル化後のNPCC回収率が有意に上昇した（Fig. 4）。これにより、ナノカプセル化後の正確な膵島（NPCC含む）数を予測・移植でき、膵島（NPCC含む）損失を最小限に抑えられる。まとめると、本研究で用いたF‑10（0.25 % BSA）によるナノカプセル化では、（i）NPCCの正常形態が維持され、（ii）NHS共役PSomeとNPCCのECM中NH₂の結合が阻害されず、（iii）ナノカプセル化後のNPCC回収率が向上した。

最後に、（i）PSome同士の共役と（ii）PSomeとNPCCのECMとの結合により、ナノカプセル化の安定性向上を試みた。まず、NHS‑とNH₂‑PEG‑b‑PLAポリマーを比例混合し、PSomeとNPCCのECMの両方に結合できる二官能基PSome（NHS‑/NH₂‑PSome）を形成した。単一官能基を持つ2つのPSomeを共役させるよりも、1つのPSome内に二官能基を持たせる方が、同種官能基間の結合（NHS‑NHS、NH₂‑NH₂）による潜在的干渉を回避でき、効率的な共役が可能と考えた。結果、NHS‑/NH₂‑PSomeナノカプセル化NPCCにおいて、NHS/NH₂比9:1でコンフォーマルコーティングが達成され、生存率と機能が維持された（Fig. 5）。ただし、PSome結合強度の定量化や、二官能基PSomeによるナノカプセル化が単一官能基PSomeより安定であることの証明にはさらなる研究が必要である。したがって、NPCC培養環境を模倣した本研究の効果的なナノカプセル化条件は、NPCC含有膵島のナノカプセル化戦略に応用可能であると提案する（追加ファイル1）。

結論

本研究は、PEGベースのポリマーソーム（PSome）を用いた膵島（NPCC）ナノカプセル化の最適手法を決定することを目的とした。第一に、pH 7.3のF‑10培地を用いることで、塩基性HBSS緩衝液（pH 8.0）と比較してナノカプセル化後のNPCC正常形態が維持され、カプセル化時のNPCCダメージを最小限に抑えられる。第二に、F‑10培地に0.25 % BSAを添加することで、ナノカプセル化後のNPCC収率が約1.7倍向上した。第三に、二官能基PSome（NHS‑/NH₂‑PSome）の共役により、より安定したナノカプセル化を誘導できた。本論文で提示したナノカプセル化手法は、PEGベースナノ粒子を用いた膵島ナノカプセル化に応用可能である。

データと資料の入手可能性

該当なし。

略語

DiD:

1,1′‑ジオクタデシル‑3,3,3′,3′‑テトラメチルインドジカルボシアニン、4‑クロロベンゼンスルホネート塩

AO:

アクリジンオレンジ

APIs:

成豚膵島

BSA:

牛血清アルブミン

BF:

明視野

CLSM:

共焦点レーザー走査顕微鏡

DAPI:

4′,6‑ジアミジノ‑2‑フェニルインダール

DMSO:

ジメチルスルホキシド

DH2O:

蒸留水

ELISA:

酵素免疫測定法

FBS:

胎児牛血清

FITC:

フルオレセインイソチオシアネート

GSIS:

グルコース刺激インスリン分泌

HBSS:

ハンクス平衡塩液

IBMIR:

即時血液介在性炎症反応

IEQ:

膵島当量

IBMX:

イソブチルメチルキサンチン

KRBB:

Krebs‑Ringer重炭酸緩衝液

MFI:

平均蛍光強度

HEPES:

N‑(2‑ヒドロキシエチル)ピペラジン‑N′‑(2‑エタンスルホン酸)

NC:

陰性対照

NPCCs:

新生仔豚膵島様細胞クラスター

NHS:

N‑ヒドロキシサクシニミド

NHP:

非ヒト霊長類

PLA:

ポリ乳酸

PEG:

ポリエチレングリコール

PSomes:

ポリマーソーム

PI:

ヨウ化プロピジウム

SI:

刺激指数

TF:

組織因子