ポリマーソームを使用した新生児ブタ膵島様細胞クラスターへのナノカプセル化の最適化

はじめに

1型糖尿病の治療における同種膵島移植の使用は、適切なドナーが不足しているために制限されています。代わりに、異種膵島移植における動物膵島の使用が徐々に増加しており、ブタが最適なドナー種として浮上しています[1]。移植中にブタをドナーとして使用する場合、ブタの年齢に基づいて別々の膵島を使用することができます。多くの場合、新生児のブタ膵島様細胞クラスター（NPCC）は、手頃な価格と分離の容易さから、成体のブタ膵島（API）よりも好まれます。さらに、NPCCは移植後に徐々に増殖し、in vivoでの機能を延長することができます[1、2]。ただし、NPCCをヒトまたは非ヒト霊長類（NHP）の門脈に移植すると、種間変動により、即時血液介在性炎症反応（IBMIR）や超急性拒絶反応などの免疫反応が引き起こされ、早期の移植片喪失につながる可能性があります[3]。この問題を解決するには、さまざまな免疫応答を阻害できるNPCCのカプセル化が必要です。カプセル化には、マクロ、マイクロ、およびナノカプセル化の3つのタイプがあります。マクロカプセル化では、膵島を含むデバイスを使用します。膵島は血管の周囲に埋め込まれ、血糖値に応じて半透膜からインスリンを放出します。マイクロカプセル化は、少数の膵島を多孔質カプセルに詰め込みます。これらのカプセル化は免疫拒絶反応から膵島を保護することができますが、膜の崩壊や血栓の生成などの副作用がinvivo試験で報告されています。膵島はまた、拡散距離の増加により、ホルモン、栄養素、または酸素の流れを妨げます。ナノカプセル化は、輸血において細胞と外因性タンパク質、主にポリエチレングリコール（PEG）との付着を誘発する細胞表面修飾の戦略です[4]。

PEGを使用したナノカプセル化は、標的タンパク質またはペプチドの有効性と物理化学的特性を改善するための修飾方法として広く使用されています[5]。特に、膵島のナノカプセル化は、免疫細胞の攻撃と抗体の認識に応答して抑制効果をもたらす可能性があります。 PEGは、非免疫原性、抗原マスキング、非ファウリング効果などの生体適合性があるため、細胞コーティングに広く使用されています[6]。 NPCCのナノカプセル化に使用されるナノ粒子の中で、PEG-block-poly lactide（PEG-b-PLA）に基づく「ポリマーソーム」（PSomes）は、安定していて変更が簡単なため、最も適しています。また、アセンブリに親水性試薬と疎水性試薬の両方を組み込むこともできます[7、8]。ポリマー（PEGを含む）を使用した膵島の表面修飾は、膵島の細胞外マトリックス（ECM）と官能基共役ポリマーとの間の共有結合または非共有結合によって達成されます[9]。

以前の研究では、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）-NH ₂ を促進する能力があるため、基本的なハンクの平衡塩類溶液（HBSS、pH 8.0）を膵島ナノカプセル化反応バッファーとして使用していました。 バインディング[10、11、12]。ただし、ナノカプセル化中のNPCCへの細胞の損傷を最小限に抑えるために、生理学的pH（pH 7.3）のF-10培地（NPCC培地）を使用しました。さらに、ナノカプセル化後のNPCCの量を維持することは、正しい量の細胞を移植するために重要であるため、細胞培養皿の底を長鎖ポリマーでコーティングするウシ血清アルブミン（BSA）を追加して、回復を促進しましたレート[13]。以前の研究では、PSomesによるNPCCのナノカプセル化は、NHSやNH ₂ などの単一の官能基を介して実行されました。 、それぞれNPCCのECMとの共有結合または静電相互作用を誘導するために使用されます。ただし、結合親和性は時間の経過とともに低下するため、結合効率を高めるための戦略が必要です[14]。二官能性基を有するPSomeは、凝集する能力があるため、コーティング効率を高めるための候補として使用できます。したがって、二官能性基（NHS- / NH ₂ ）を含むPSome間の架橋を誘導しました。 -PSome）NPCCのECMだけでなく、共有相互作用または静電相互作用を介して各PSomeにも結合できるため、ナノカプセル化の効率が向上します。

この研究では、ブタ膵島異種移植の分野で最適化された方法を通じて、NPCCへのナノカプセル化の適用の可能性を調査しました。

材料と方法

動物

すべての動物実験は、MGENPLUSco。の研究所の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。株式会社（＃2019–1）、すべての手順は委員会によって設定されたガイドラインに従って実行されました。手術は全身麻酔下で行われ、動物が最小限の痛みを経験することを確実にするための努力がなされた。膵臓切除術の前にブタを殺した。

新生児のブタ膵島様細胞クラスター（NPCC）の分離

NPCCは3〜5日齢の子豚から分離されました。簡単に説明すると、子豚はケタミン（10 mg / kg、ユハン、ソウル、韓国）とキシラジン塩酸塩（1 mg / kg、ロンプン、バイエルコリア、ソウル、韓国）を大腿筋に注射して麻酔をかけ、塩化カリウムを注射して殺しました（ Sigma-Aldrich、MO、USA）を心臓に注入します。膵臓を腹部切開で露出させ、採取し、ハンクスの平衡塩類溶液（HBSS、Biosesang、京畿道、韓国）に8.3 mM重曹、10 mM N-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-N '-（ 2-エタンスルホン酸）（HEPES）（Sigma-Aldrich、MO、USA）、および0.5％抗生物質-抗真菌剤（Biowest、MO、USA）。膵臓は1〜2 mm ³ に切り刻まれました 断片化し、コラゲナーゼタイプV（1 mg / ml、Sigma-Aldrich、ミズーリ州、米国）でHBSSで10分間消化します。 10％ウシ胎児血清（FBS）（Biowest、MO、USA）を含む冷HBSSを消化した膵臓組織に添加して、酵素活性を停止させました。消化された膵臓組織をHBSSで洗浄し、再懸濁後、組織をpluriStrainer500μm（pluriSelect、ライプツィヒ、ドイツ）でろ過し、HBSSで洗浄しました。最後に、NPCCを5％CO ₂ で播種し、培養しました。 0.25％ウシ血清アルブミン（BSA）（genDepot、TX、USA）、10 mMニコチンアミド、10 mM D-グルコース、2 mM L-グルタミンを添加したF-10培地（Gibco、CA、USA）で37°Cで2 mM塩化カルシウム二水和物、50 µMイソブチルメチルキサンチン（IBMX）、20 µg / mlシプロフロキサシン（Sigma-Aldrich、MO、USA）、および1％抗生物質-抗真菌剤。 NPCCは5日間培養され[15]、10 nMのエキセンディン-4（Prospec、ネスジオナ、イスラエル）が毎日培地に添加されました。

NPCCおよびナノカプセル化NPCCのinvitro評価

培養後、接眼レンズレチクルを使用して、NPCCの数を膵島等価物（IEQ）としてカウントしました。生存率は、アクリジンオレンジ（AO、0.67μM、Sigma-Aldrich、ミズーリ州、米国）およびヨウ化プロピジウム（PI、75μM、Sigma-Aldrich、ミズーリ州、米国）染色を使用して評価しました。グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）アッセイを実行するために、20〜30個のNPCCを選択し、クレブス-リンガー重炭酸塩バッファー（KRBB）で低D-グルコース（2.8 mM）濃度で1時間プレインキュベートしました。次に、NPCCをKRBBバッファー中の低D-グルコース（2.8 mM）と1時間インキュベートし、続いてKRBB中の高D-グルコース溶液（28.0 mM）と1時間インキュベートしました。低および高グルコース濃度下でのインスリン分泌を測定するために上清を収集した[11]。各サンプルから分泌されるインスリンの量は、ヒト/イヌ/ブタインスリンQuantikine ELISAキット（R＆Dシステム、ミネソタ州、米国）を使用して測定されました。刺激指数（SI）は、高グルコース（28.0 mM）でのインスリン量を低グルコース（2.8 mM）濃度でのインスリン量で割ることによって計算されました。

ポリマーソーム（PSome）の調製

PSomeを調製するには、N-ヒドロキシスクシンイミド-ポリ（エチレングリコール）-ブロック-ポリ（ラクチド）コポリマー（10 mg / ml、NHS-PEG-b-PLA）またはアミン-ポリ（エチレングリコール）-ブロック-ポリ（ラクチド）のいずれか）共重合体（10 mg / ml、NH ₂ -PEG-b-PLA; Nanosoftポリマー（米国ノースカロライナ州）を1 mlのジメチルスルホキシド（DMSO、米国ミズーリ州シグマアルドリッチ）に溶解しました。二官能性PSomeの調製に加えて、各コポリマー（NHSまたはNH ₂ -DMSOに溶解したPEG-b-PLA）を一定の割合で混合した。蒸留水（DH2O）をポリマー溶液に加えて、最終濃度を1 mg / mlにしました。ポリマー溶液を超音波処理装置（Sea han超音波、ソウル、韓国）で5分間超音波処理しました。 1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'-テトラメチルインドジカルボシアニン、4-クロロベンゼンスルホン酸塩（DiD; Biotium、CA、USA）を超音波処理中にポリマー溶液に添加して、可視化を可能にしました。最後に、混合物をDH2Oで3日間透析しました。

ナノカプセル化

PSomeは、ナノカプセル化反応バッファー（HBSS（pH7.3またはpH8.0）またはサプリメントなしのプレーンF-10培地（pH7.3またはpH8.0）、0.25％BSAありまたはなし）で希釈しました。ナノカプセル化は、PSomeを培地中のNPCCに添加することによって実行されました。これを行うために、10,000 IEQのNPCCを6ウェル細胞培養皿（SPL、京畿道、韓国）に播種し、希釈したPSomeをNPCCに添加し、5％CO ₂ でインキュベートしました。 37°Cで1時間。ネガティブコントロール（NC）グループ（PSomesのないコーティングされていないNPCC）は、実験グループと同じ条件下でインキュベートされました。インキュベーション後、ナノカプセル化されたNPCCを回収し、F-10培地で培養しました。

ナノカプセル化されたNPCCの効率

DiD結合PSomeナノカプセル化NPCCは、蛍光顕微鏡（Leica、Wetzlar、Germany）または共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM; Carl Zeiss、Oberkochen、Germany）のいずれかを使用して視覚化されました。 DiD結合PSome結合NPCCの強度は、ImageJソフトウェア（NIH、ベセスダ、米国）を使用して平均蛍光強度（MFI）を計算することによって定量化されました。細胞内の核は4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で対比染色されました。

ポリマーソーム透過性アッセイ

F-10またはF-10（0.25％BSA）のNHS-PSomeナノカプセル化NPCCを、さまざまな分子量（10、20、70、および250 kDa）のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合デキストランと2時間インキュベートしました。 。 FITC結合デキストランのNHS-PSomeナノカプセル化NPCCへの浸透は、共焦点レーザー走査顕微鏡を介して各分子量について確認されました。

ポリマーソーム細胞生存率アッセイ

RPMI 1640（Biowest、MO、USA）のNHS-PSomeナノカプセル化THP-1（ヒト単球細胞株）を1時間インキュベートしました。 NHS-PSomeナノカプセル化THP-1の生存率は、MTT細胞増殖アッセイキット（iNtRon Biotechnology、城南市、韓国）で提示されたプロトコルに従って測定されました。

統計分析

対応のないt検定は、GraphPad Prism6.0で実行されました。統計的有意性は、 P を示す*、** ***、および****として表されました。 ≤0.05、≤0.01、≤0.001、および≤0.0001の値。

結果

NPCCの文化と機能の評価

NPCCを5日間培養し、生存率やGSISなどの品質管理を実施しました。 NPCCの総数は21,014.0IEQ / g /膵臓でした。 AO / PI染色を使用した生存率は89.9％でした。グルコース濃度に対するNPCCの応答性を確認するために実行されたGSISは、2.3の平均刺激指数（SI）を示しました（表1、追加ファイル1：図S1）。

NPCCの効率的なナノカプセル化に必要なPSome濃度

効率的なナノカプセル化に必要なPSomeの濃度を決定するために、さまざまな濃度のNHS-PSomeをNPCCに追加しました。 NHS-PSomeは、DH ₂ に1mg / mlの濃度でストックされていました。 Oで、1：5、1：10、1：20、および1:40に希釈して、0.2〜0.025 mg / mlの範囲の最終濃度にします。ナノカプセル化効率は、DiDをロードしたPSomeナノカプセル化NPCCのMFIによって測定されました。 0.1 mg / ml（1:10希釈）の最終濃度は、ナノカプセル化の2日後に最も高い蛍光強度を示し（図1aおよびb）、その後のNPCCのナノカプセル化はこの濃度で行われました。

0日と2日で効果的なナノカプセル化のためのPSome濃度の最適化。効果的なナノカプセル化のためのPSome濃度の最適化。 a DiDをロードしたNHS-PSomeは、さまざまな濃度（BF;明視野）でNPCCで処理されました。スケールバーは200μmを表します。 b DiDをロードしたPSomeナノカプセル化NPCCのMFI（ n =3）およびNC制御（ n =1）

生理学的pHのF-10培地でのナノカプセル化の効率の向上

膵島（NPCCを含む）のナノカプセル化は、多くの場合、基本的なHBSSバッファー（pH 8.0以上）で実行され、膵島のECMのNH2とポリマーに結合したNHSの間の結合親和性を高めます。ただし、基本的なHBSSバッファーでのナノカプセル化は、NPCCに損傷を与える可能性があります。したがって、NPCCの損傷を最小限に抑え、NHS-NH ₂ に対するpHの影響を判断する 結合、NPCCは、それぞれpH 7.3（生理学的）またはpH 8.0（基本）のHBSSバッファーまたはプレーンF-10培地（この研究でNPCCを培養するために使用）にNHS-PSomeを介してナノカプセル化されました。 NPCCをF-10にナノカプセル化すると、NPCCの正常な形態が維持され（図2a）、MFIに基づくナノカプセル化の効率は、0日目のpHに関係なく、HBSSグループと比較して大幅に向上しました。および6（図2b）。 HBSSグループは6日目にpH7.3と8.0の間に有意差を示しましたが、ナノカプセル化の強度はF-10グループと比較して大幅に減少しました。したがって、NPCCの潜在的な損傷を最小限に抑えるために、後続の実験では、ナノカプセル化反応バッファーとして生理学的F-10培地（pH 7.3）を使用しました。

1日目と6日目のさまざまな反応バッファーでのナノカプセル化のコーティング効率の比較。さまざまな反応バッファーでのナノカプセル化のコーティング効率の比較。 a DiD結合NHS-PSome（BF;明視野）を使用したHBSS（pH7.3およびpH8.0）またはF-10（pH7.3およびpH8.0）のナノカプセル化NPCC。スケールバーは200umを表します。 b DiD結合NHS-PSome（すべてのグループ; n ）を使用したHBSS（pH7.3およびpH8.0）またはF-10（pH7.3およびpH8.0）でのナノカプセル化NPCCのMFI =3）。データは平均±S.Dを表します。 * p <0.05、*** p <0.001および**** p <0.0001対他のグループ

ナノカプセル化後のNPCCの回収率の向上

NPCCの細胞損傷はF-10で最小限に抑えられましたが、ナノカプセル化後に収集されたNPCCの量は著しく減少しました。この問題を解決するために、NHS-PSomeを使用したNPCCの培養およびナノカプセル化中にF-10培地に0.25％のBSAを追加しました。最初に、0.25％BSAをF-10培地に添加すると、コーティング効率と選択的透過性に影響し、小分子（10および20 kDa FITC結合デキストラン）の通過を可能にし、より大きな分子（70および250 kDa FITC結合デキストラン）をブロックするかどうかを確認しました。デキストラン）、PSomeの必須機能として。その結果、コンフォーマルコーティングがCLSMの画像に表示され（図3a、Mid）、0.25を含むF-10を含むNHS-PSomeナノカプセル化NPCCで選択的透過性が正常に維持されました（図3b、FITC結合デキストラン）。 MFIはわずかに減少しましたが、F-10と比較した％BSA（図3b）。ナノカプセル化後に収集されたNPCCの量は、BSAを含まないF-10（42.3％）よりも0.25％のBSAを含むF-10で有意に高い回収率（71.9％）を示しました（図3c）。 0.25％BSAを含むF-10のNPCCの生存率（NC：89.5％、NHS-PSome：90.3％）およびグルコース刺激インスリン分泌（NC：2.1、NHS-PSome：1.6）も、ナノカプセル化後に維持されました（図。4a、b、追加ファイル1：図S2）。私たちの結果は、0.25％のBSAを添加すると、ナノカプセル化後のNPCCの回収率が大幅に向上し、PSomeのコーティング効率や機能に影響を与えなかったことを示しています。

回収率を高めるためのナノカプセル化反応バッファーへの0.25％BSA添加後のコーティング効率の比較。回収率を高めるためのナノカプセル化反応バッファーへの0.25％BSA添加後のコーティング効率の比較。 a F-10または0.25％BSAを含むF-10のNHS-PSomeを含むナノカプセル化NPCCのコーティング効率と選択的透過性（BF;明視野、中央; DiD結合NHS-PSomeナノカプセル化NPCCのCLSMを使用した中央画像FITC結合デキストラン; NHS-PSomeナノカプセル化NPCCにおけるFITC結合デキストランのCLSMを使用した中央の画像）。真ん中の青は、DAPI染色による細胞を表しています。スケールバーは200（BFおよびDiD）および100（MidおよびFITC結合デキストラン）μmです。 b DiD結合NHS-PSomeを使用したナノカプセル化NPCCのMFI。 c F-10にナノカプセル化した後のNPCCの回収率（ n =12）または0.25％BSAのF-10（ n =12）。データは平均±S.Dを表します。 * p <0.05対F-10

NHSの実行可能性と機能性-0.25％BSAを含むF-10を使用したナノカプセル化NPCCの一部。 NHSの実行可能性と機能性-0.25％BSAを含むF-10を使用したナノカプセル化NPCCの一部。 a NHS-PSomeナノカプセル化NPCCの実行可能性（ n =6）およびNC制御（ n =6）; b NHS-PSomeナノカプセル化NPCCのSI（ n =5）およびNC制御（ n =5）。データは平均±S.D

を表します

PSomeのクロスリンクによるナノカプセル化の安定性の向上

NPCCのより安定したナノカプセル化を誘導するために、2つの異なる官能基を持つPSomeを結合させようとしました。まず、NHSとNH ₂ を含むさまざまな比率のPSomeを同時に追加することにより、NPCCのナノカプセル化を実施しました。 二官能性基（NHS- / NH ₂ -PSome）1つのPSome（スキーム1）。ナノカプセル化の効率は、PSomeナノカプセル化NPCCに結合したDiDのMFIによって確認されました。蛍光顕微鏡から得られた画像は、0日目のNHS- / NH2-PSomeナノカプセル化NPCC（9：1、5：5、1：9）の9：1、5：5、および1：9グループ間で有意差を示さなかったと日（図5a）。ただし、CLSMの結果では、5：5グループはオーバーコーティングされているように見え、1：9は不十分なコーティングを示しましたが、9：1グループは1日目にコンフォーマルコーティングを形成しました（図5b）。したがって、PSomeのNHS- / NH2の最適な比率は9：1であると判断しました。 9：1グループで機能アッセイを行ったところ、NCコントロール（92.1％）と比較して9：1グループの生存率が大幅に低下したが、生存率は正常レベル（87.8）に維持された。 ％）。 9：1グループのSI関数は、NCコントロール（3.7）のSI関数と比較した場合、正常（3.0）でした（図5c、d）。

PSomesの架橋によるナノカプセル化の改善された安定性の図解

NHS- / NH ₂ のコーティング効率と機能性 -PSいくつかのナノカプセル化されたNPCC。 NHS- / NH ₂ のコーティング効率と機能性 -PSいくつかのナノカプセル化されたNPCC。 a NHS- / NH ₂ の9：1、5：5、1：9を共役したDiD -PS一部のナノカプセル化NPCC（9：1、5：5、1：9）（NC;コーティングされていないNPCC）。 MFIは、DiD結合PSomeナノカプセル化NPCC（ n ）の強度を示します =3）およびNC制御（ n =3）。スケールバーは200umを表します。 b DiD共役NHS- / NH ₂ のCLSM -PSomeナノカプセル化NPCC（中央; DiD結合NHSのCLSMを使用した中央の画像-/ NH ₂ -PSomeナノカプセル化NPCC）。真ん中の青は、DAPI染色による細胞を表しています。スケールバーは100umを表します。 C. 9：1の実行可能性（ n =9）およびNC制御（ n =3）。データは平均±S.Dを表します。 ** p <0.01対NC; D. 9：1のSI（ n =9）およびNC制御（ n =3）。データは平均±S.D

を表します

ディスカッション

一般に糖尿病として知られている糖尿病は、高血糖値を特徴とする代謝性疾患です。 1型糖尿病は、膵臓のベータ細胞が十分なインスリンを産生できないことに起因します[16]。インスリン産生β細胞を含む膵島の移植は、最近、1型糖尿病を治療するために使用されています。ただし、ドナーが不足しているため、同種膵島移植は限られています。代わりに、非ヒト動物からの膵島を使用した異種移植が、ドナー組織の代替供給源として浮上している。ヒトとの生理学的類似性、大量繁殖の容易さ、および病原体のない施設での繁殖の利用可能性のために、ブタは異種膵島移植の最適な動物モデルと見なされています[1]。特に、NPCCはAPIと同じくらい非常によく使用されています。 NPCCの成熟度はAPIの成熟度よりも低いですが、NPCCには、比較的単純で安価な膵島分離手順、低酸素環境への耐性を発達させる能力、移植後のin vivoでの増殖など、APIに比べていくつかの利点があります[1,2,3]。 。これらの理由から、この研究では、3〜5日齢の新生児ブタを膵島の供給源として使用しました。

残念ながら、ブタの膵島がヒトまたは非ヒトの霊長類の血管に移植されると、IBMIRや超急性拒絶反応などの重度の免疫反応がしばしば発生します。 IBMIRは通常、外因性経路の活性化を介してヒト血管の凝固を媒介するブタ膵島で発現するいくつかの組織因子（TF）が原因で発生します。ブタ細胞の表面に発現するα-ガラクトースまたは非gal抗原も、天然のヒト抗体の標的となり、その後に超急性拒絶反応と呼ばれる補完的なカスケード活性化が続きます。その結果、凝固経路からの血餅形成による低酸素症および宿主における補体活性化による細胞死に続いて、移植片が失われる[3]。これらの問題を解決するために、膵島を生体適合性材料でコーティングして抗体または補体反応による攻撃から膵島を保護する方法であるカプセル化が試みられた。まず、マクロカプセル化は、膵島を含む半透膜を備えたデバイスを使用し、血管の隣に埋め込まれ、血糖値に応じてインスリンを血流に放出します[4]。第二に、主にアルギン酸塩を使用するマイクロカプセル化は、選択的な透過性を持ち、酸素と栄養素がその多孔質表面を通過できるようにすると同時に、複数のサイトカインと免疫細胞の浸潤をブロックします。ただし、膵島のサイズに関係なく同じサイズのカプセルを使用するため、膵島をコンフォーマルコーティングすることは困難です。さらに、移植後に移植片を取り囲む線維症が発生する可能性があります[17]。最後に、膵島の表面修飾（ナノカプセル化）では、主に「ステルス」ポリマー（PEG）でコーティングされた材料と血液中の成分（免疫細胞）の相互作用をブロックする「ステルス効果」特性を持つポリエチレングリコール（PEG）を使用します。インビボ[11、18]。当社のNPCCナノカプセル化戦略では、修飾PEGコポリマー（PEG-b-PLA、ポリマーソーム、PSome）を使用しています。また、Psomeは親水性と疎水性の両方の特性を備えており、免疫抑制剤や細胞の分化や成長に関与する因子を組み込むことができます[8]。

PEGを使用した膵島のナノカプセル化は、基本的なHBSSバッファー（pH 8.0以上）で実行され、PEG上のNHSとNH ₂ の間の結合親和性を強化しています。 膵島のECMについて[10,11,12]。ただし、これらの条件では適切な細胞培養環境を提供できないため、NPCC培養条件を模倣した環境でナノカプセル化を試みました。上記の問題に対処するために、ナノカプセル化反応バッファーとして使用される生理学的pH（サプリメントなし）を使用して、プレーンF-10培地、NPCC培養ベース培地をテストしました。生理的pHのF-10でのナノカプセル化は、基本的なHBSSバッファーを使用した培養条件と比較した場合、同様のコーティング効率を示し、NPCCの正常な形態を維持しました（図3）。したがって、NPCC培養模倣環境でのナノカプセル化中のNPCC損傷を最小限に抑えるプラットフォームを提案できます。

NPCCの損傷を最小限に抑えるためのナノカプセル化法が確立されたが、ナノカプセル化がペトリ皿で行われた場合、ナノカプセル化後に収集されたNPCCの残留量は減少した。これは、移植用のナノカプセル化のためにより多くのNPCCが必要であることを意味します。以前の報告によると、分離中にBSAを使用することにより、一部のマウス系統で膵島の収量が改善されました[19]。また、BSAは、ラット肝癌細胞培養で細胞培養皿の表面をプレコーティングすることにより、浮遊培養として使用されました[13]。したがって、ナノカプセル化後のNPCCの量を増やすために、NPCCの培養に使用したBSAの濃度と同じ0.25％のBSAをF-10ナノカプセル化反応バッファーに添加しました。その結果、NPCCの回収率は、ナノカプセル化後に大幅に増加しました（図4）。これは、ナノカプセル化後の膵島（NPCCを含む）の損失を最小限に抑えることで、膵島（NPCCを含む）の正しい数を予測して移植できることを意味します。要約すると、ナノカプセル化に0.25％BSAを含むF-10を使用したこの研究では、（i）NPCCの正常な形態が維持され、（ii）NPCCのECMにおけるNHS結合PSomeとNH2の間の結合が妨げられず、 （iii）ナノカプセル化後のNPCCの回復率が増加しました。

最後に、（i）PSome間の結合、および（ii）PSomeとNPCCのECM間の結合により、ナノカプセル化の安定性を高めることを試みました。まず、NHS-およびNH2-PEG-b-PLAポリマーを比例的に混合して、NPCCのPSomeとECMの両方に結合できる二官能性PSome（NHS- / NH2-PSome）を形成しました。同じ官能基（NHS-NHSとNH2-NH2）を持つPSome間の結合によって引き起こされる潜在的な中断のために、2つのPSomeを単一官能基と結合するのではなく、1つのPSome内の2官能基によって結合を効率的に達成できると仮定しました。結果からわかるように、NPCCのコンフォーマルコーティングは、NHS- / NH2-PSomeナノカプセル化NPCCの9：1の比率で達成され、生存率と機能性が維持されました（図5）。ただし、PSome結合の強度を定量化して、二機能性PSomeを使用したナノカプセル化により、単機能性PSomeを使用した場合よりも安定したカプセル化が得られることを証明するには、さらなる研究が必要です。したがって、NPCC培養環境を模倣した効果的なナノカプセル化条件を、NPCCを含む膵島を使用したナノカプセル化戦略で使用できることをお勧めします（追加ファイル1）。

結論

この研究は、PEGベースのポリマーソーム（PSomes）を使用した膵島（NPCC）のナノカプセル化の最適な方法を決定するために実施されました。まず、pH 7.3のF-10培地を使用すると、基本的なHBSSバッファー（pH 8.0）を使用した場合と比較して、ナノカプセル化後のNPCCの正常な形態を維持できるため、カプセル化中のNPCCへの損傷を最小限に抑えることができます。第二に、0.25％BSAをF-10培地に添加すると、ナノカプセル化後のNPCCの収量が約1.7倍向上しました。最後に、二官能性PSomes（NHS- / NH2-PSomes）の結合により、より安定したナノカプセル化を誘導しました。この論文で提示されているナノカプセル化の方法は、PEGベースのナノ粒子を使用した膵島のナノカプセル化に適用できる可能性があります。

データと資料の可用性

該当なし。

略語

DiD：

1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'-テトラメチルインドジカルボシアニン、4-クロロベンゼンスルホン酸塩

AO：

アクリジンオレンジ

API：

成体のブタの小島

BSA：

ウシ血清アルブミン

BF：

明視野

CLSM：

共焦点レーザー走査顕微鏡

DAPI：

4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール

DMSO：

ジメチルスルホキシド

DH2O：

蒸留水

ELISA：

酵素免疫測定法

FBS：

ウシ胎児血清

FITC：

フルオレセインイソチオシアネート

GSIS：

グルコース刺激インスリン分泌

HBSS：

ハンクの平衡塩類溶液

IBMIR：

瞬時の血液介在性炎症反応

IEQ：

膵島相当

IBMX：

イソブチルメチルキサンチン

KRBB：

クレブス-リンゲル重炭酸塩バッファー

MFI：

平均蛍光強度

HEPES：

N-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-N '-（2-エタンスルホン酸）

NC：

ネガティブコントロール

NPCC：

細胞クラスターのような新生児ブタ膵島

NHS：

N-ヒドロキシスクシンイミド

NHP：

人間以外の霊長類

PLA：

ポリラクチド

PEG：

ポリエチレングリコール

PSomes：

ポリマーソーム

PI：

ヨウ化プロピジウム

SI：

刺激指数

TF：

組織因子