Cr³⁺/Eu³⁺共ドープ長寿命近赤外持続発光ナノ粒子：高度細胞イメージング応用

要旨

近赤外（NIR）発光持続発光ナノ粒子はバイオイメージング剤として開発されてきた。しかし、長期イメージング向け長残光均一ナノ粒子合成は未確立。本研究では、ゾルゲル法と後続還元雰囲気フリー焼成組合せで、スピネル構造Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺（ZGGO:Cr³⁺）とZn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺,Eu³⁺（ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺）ナノ粒子合成実証。XRD、TEM、STEM、選択領域電子回折、光励起（PLE）/発光（PL）分光法、温度依存PL解析等複合手法で詳細特性評価。単結晶ナノ粒子は均質固溶体、均一立方体形状、側面サイズ~80–100 nm。273 nm UV励起でZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺は697 nm NIR発光帯（ガロゲルマネート中歪みCr³⁺イオン²E→⁴A₂遷移）示し、Eu³⁺発光不在。NIR持続発光7200 秒超持続、強度維持。Eu³⁺導入でZGGO:Cr³⁺持続発光強度と残光時間増大、熱安定性大き影響なし。得られたZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ナノ粒子、in vitro細胞イメージング優秀能力示す。

背景

持続発光材料は励起停止後長時間（数時間）発光継続[1]。研究関心高く、夜間/暗所視認材料として警備標識、非常経路標識、識別マーカー、医療診断等幅広く商用化[2]。典型的長持続燐光体：赤色Y₂O₂S:Eu³⁺,Mg²⁺,Ti⁴⁺、CaS:Eu²⁺,Tm³⁺,Ce³⁺[3,4]、緑色SrAl₂O₄:Eu²⁺,Dy³⁺、MgAl₂O₄:Mn²⁺[5,6]、青色CaAl₂O₄:Eu²⁺,Nd³⁺、SrMgSi₂O₆:Eu²⁺,Dy³⁺[7,8]。可視持続燐光体多数成功も、近赤外（NIR、~700–2500 nm）領域持続燐光体研究開発不十分。近年、赤色/NIR発光持続燐光体応用が夜間警備標識からin vivoイメージングシステムへ拡大[1,9,10]。

光増感剤結合持続発光材料in vivo剤としてChenとZhangが光線力学療法試行[11]。SchermanらがNIR発光燐光体Ca₀.₂Zn₀.₉Mg₀.₉Si₂O₆:Eu²⁺,Mn²⁺,Dy³⁺用いin vivoバイオイメージング画期的成果[12]。同グループでCaMgSi₂O₆:Eu²⁺,Mn²⁺,Pr³⁺、Ca₂Si₅N₈:Eu²⁺,Tm³⁺性能向上新NIR燐光体開発[13,14]。近年、Cr³⁺ドープガレート持続燐光体でNIR発光長残光、スピネルZnGa₂O₄:Cr³⁺と変種Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺、Zn₃Ga₂GeO₈:Cr³⁺,Yb³⁺,Er³⁺、ZnGa₂₋ₓ(Ge/Sn)ₓO₄:Cr³⁺固相法合成[1,9,10,15–21]。セラミックディスク試料NIR領域360 h残光もバルキー材料in vivoバイオイメージング不適。NIR長持続発光ナノ粒子ZnGa₂O₄:Cr³⁺[22,23]、ZnGa₂O₄:Cr³⁺,Sn⁴⁺[19–21]、Zn₂.₉₄Ga₁.₉₆Ge₂O₁₀:Cr³⁺,Pr³⁺[9]ゾルゲル法+還元雰囲気フリー焼成合成。ナノ粒子粉末持続発光生体透過窓明るいNIR発光、超長残光示す。PEG化で生体適合性と水溶性大幅改善、in situ励起不要高SNR長期in vivoバイオイメージング応用大いに期待。アルカリ土類イオン、ランタノイドイオン、Li⁺群から選択イオンをZnガレート/Znガロゲルマネート中Cr³⁺共ドープで顕著NIR持続発光得られると信じられる[1]。Eu³⁺酸化物ホストで常に~700 nm赤色発光、250 nm電荷移動（CT）バンド短波長UV励起時⁵D₀–⁷F₄遷移由来[24]。一方Cr³⁺固体好発光中心、狭帯域発光（通常700 nm）スピン禁制²E–⁴A₂遷移、広帯域発光（650–1600 nm）スピン許容⁴T₂–⁴A₂遷移由来[1,20]。以上よりCr³⁺/Eu³⁺共ドープZnガレート/ZnガロゲルマネートでO²⁻-Eu³⁺ CTバンドとO²⁻-Ga³⁺ CTバンド重なり、Eu³⁺⁵D₀–⁷F₄発光（~700 nm）とCr³⁺²E–⁴A₂発光重なり、強烈NIR持続発光期待。さらにEu³⁺イオン六配位歪みサイトでGa³⁺置換時Cr³⁺周囲適切結晶場強度生成、NIR発光影響可能性。本研究ゾルゲル法+還元雰囲気フリー焼成でZn₃Ga₂Ge₂O₁₀:Cr³⁺,Eu³⁺（ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺）ナノ粒子合成、将来バイオイメージング有望ナノプローブとして検証。XRD、TEM、STEM、SAED、PLE/PL分光法、温度依存PL解析等複合手法で詳細特性評価実施。以下合成、特性評価、応用報告。

実験

合成

出発金属源：Zn(NO₃)₂·6H₂O、Cr(NO₃)₃·9H₂O、Ga₂O₃、Eu₂O₃、GeO₂全て99.99 %純度、Sinopharm（上海）購入。他試薬分析級、Shenyang Chemical Reagent Factory（瀋陽）購入。Zn(NO₃)₂·6H₂OとCr(NO₃)₃·9H₂O脱イオン水溶解。Ga₂O₃とEu₂O₃硝酸溶液溶解。GeO₂とエチレンジアミン四酢酸（EDTA）希アンモニア水溶解。混合液へEDTA溶液徐々添加沈殿なし、全金属イオン/EDTAモル比1:2維持。原子モル比Zn:Ga:Ge:Cr:Eu=3:1.984:2:0.01:0.006固定。最終溶液室温激撹拌1 h、85 ℃オーブン水分徐々蒸発させゾル→ゲル化。得ゲル200 ℃3 h加熱黒色多孔質材料化。多孔質材料粉砕、流れるO₂ガス（200 mL/min）下選択温度2 h焼成。

表面官能基化

ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺粉末30 min粉砕、150 mg試料0.1 mol/L NaOH溶液50 mL添加。1 h超音波後室温激撹拌24 h。コロイド溶液1000 rpm 10 min遠心分離大粒子除去、上清10,000 rpm 10 min遠心分離沈殿回収。得ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-OHナノ粒子脱イオン水3回洗浄。

ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-OHナノ粒子10 mgジメチルホルムアミド（DMF）4 mL超音波10 min分散。3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）40 µL添加激撹拌24 h室温。得ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ナノ粒子10,000 rpm 10 min遠心分離回収、DMF3回洗浄未反応APTES除去。

細胞イメージング

Hek293T細胞DMEM+10 % FBS培養、35 mm皿播種、CO₂インキュベータ2 h。ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ナノ粒子培地（50 mg/mL）分散、254 nm UVランプ10 min励起後培地皿移し1 h処理。培地除去後0.1 mL 1 %ホルマリン-PBS添加、0.5 mL DAPI染色暗所10 min。PBS数回洗浄後解析。

全動物実験大学動物ケア委員会承認済。

特性評価手法

相同定XRD（SmartLab、Rigaku、東京）、40 kV/40 mA、ニッケルフィルターCu Kα、走査速度6.0° 2θ/min。形態観察TEM（JEM-2000FX、JEOL、東京）。燐光体発光分析FP-8600蛍光分光光度計（JASCO、東京）。持続発光信号Horiba JY FL3-21取得。残光減衰像暗室Kodak In-Vivo Imaging System FX Pro記録。細胞イメージングレーザー走査共焦点顕微鏡（LEICA TCS SP2、ドイツ）実施。

全動物実験大学動物ケア委員会承認済。

結果と考察

試料相純度XRD検証。図1（上）1000 ℃焼成ZGGO:Cr³⁺とZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺XRDパターン、スピネル構造Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀[1,9]同定。Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀結晶構造ZnGa₂O₄（JCPDS No. 38-1240）同一、ZnGa₂O₄とZn₂GeO₄固溶体。Zn₃Ga₂Ge₂O₁₀構造でGeがGa置換、トラップ形成促進、ZnGa₂O₄主導結晶構造[1]。単位格子内2種陽イオン：Zn²⁺とGa³⁺各々4、6酸素陰イオン囲み正四面体と八面体形成（図1下）。回折データ計算格子定数：ZGGO:Cr³⁺ a=b≈0.8335 nm、スピネルZnGa₂O₄（a=b≈0.8335 nm、JCPDS No. 38-1240）近似。Eu³⁺イオン半径大（六配位r_Eu³⁺=0.0947 nm、r_Ga³⁺=0.062 nm）[25]ためZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺でa=b≈0.8336 nmやや大。Scherrer式(311)ブラッグ反射プロファイル拡大解析で平均結晶子サイズZGGO:Cr³⁺とZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺各83±6 nm算出。図1（上）900 ℃焼成生成物スピネル相（JCPDS No. 38-1240）と菱面体相（JCPDS No. 11-0687）混合、≥1000 ℃焼成で相純粋スピネルZn₃Ga₂Ge₂O₁₀得必要示唆。

調製ZGGO:Cr³⁺とZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺XRDパターンとスピネルZnGa₂O₄結晶構造

図2（左）ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺粒子TEM形態、全粒子立方体、側面サイズ~80–100 nm明確示す。鋭い角と明確格子縞優れた結晶性示唆、間隔~0.29 nmスピネル構造ZnGa₂O₄ (220)面整合（d(220)≈0.29 nm、JCPDS No. 38-1240）（図2インセット）。粒子サイズXRD平均結晶子サイズ近似、単結晶可能性。SAED解析（図2右）単結晶性さらに確認。本ナノ粒子直接固溶体、機械的混合物でない。Zn、Ga、Ge、Cr、Eu元素マッピング固溶体証拠（図3 ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺）。各粒子全元素含有、均一分布。

ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ナノ粒子TEM、HR-TEM（左）像、SAEDパターン（右）

STEM粒子形態（明視野像、最初画像）とZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ナノ粒子元素マッピング

図4室温ZGGO:Cr³⁺とZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺粉末励起スペクトル。697 nm監視励起スペクトル極広領域（200–650 nm）カバー、273、328、410、569 nmピーク4主励起バンド。273 nmバンドZnGa₂O₄ホストO²⁻-Ga³⁺電荷移動バンド起因、後続バンドCr³⁺内部遷移：328 nm⁴A₂→⁴T₁(tₑ²)、410 nm⁴A₂→⁴T₁(t²e)、569 nm⁴A₂→⁴T₂(t²e)[19,20]。Eu³⁺導入PLEバンド位置不変もCr³⁺内部遷移強度有意増大、I₄₁₀/I₂₇₃ 0.18→0.56増加。Eu³⁺導入可視光励起促進示唆。しかし最強励起バンド273 nmもO²⁻-Ga³⁺電荷移動バンド最効果励起波長示す。273 nm励起で697 nm NIR発光帯（図5）歪みCr³⁺イオンガロゲルマネート中²E→⁴A₂遷移由来、Eu³⁺発光不在。

ZGGO:Cr³⁺とZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺粉末光励起（PLE）スペクトル

ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺粉末発光（PL）スペクトル

ZGGO:Cr³⁺とZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ナノ粒子NIR持続発光減衰曲線、254 nm UV光（キセノンランプ光源）5 min照射後697 nm監視室温測定（図6）。ZGGO:Cr³⁺サンプルNIR持続発光7200 秒超持続、依然顕著強度保持。ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺持続発光強度Eu³⁺導入で増大。ランタノイドイオンCr³⁺共ドープでZnガロゲルマネート顕著NIR持続発光生成信じられる、Cr³⁺持続発光担う反サイト欠陥量増大重要役割[1]。一方ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺持続発光ZGGO:Cr³⁺より長持続、Eu³⁺導入残光時間延長示唆。図7 Kodak In-Vivo Imaging System FX Pro取得ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺粉末NIR残光減衰像、UV照射停止後経過時間別、残光120 分超持続強烈NIR発光強度維持確認。

254 nm UV光5 min照射後697 nm監視ZGGO:Cr³⁺とZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺粉末NIR持続発光減衰曲線

UV照射停止後経過時間別Kodak In-Vivo Imaging System FX Pro取得ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺粉末NIR残光減衰像

燐光体応用性能評価、特に高出力用途では熱安定性鍵パラメータ。本研究燐光体熱消光挙動評価 위해 PLスペクトル298–573 K温度範囲解析（図8）。全試料温度上昇で697 nm発光強度低下。熱消光挙動包括的把握と活性化エネルギー（E_a）推定 위해 Arrhenius式（式1）採用[26–28]：

$$ I_T=\frac{I_0}{1+c\exp\left(-\frac{E_a}{kT}\right)} $$ (1)

I₀、I_T初期最終温度強度、c速度定数、E_a活性化エネルギー、kボルツマン定数（8.629×10⁻⁵ eV K⁻¹）。図8 ZGGO:Cr³⁺とZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ 697 nm発光帯In(I₀/I_T–1) vs 10,000/T関係線。類似活性化エネルギー算出：ZGGO:Cr³⁺ E_a=0.23 eV、ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ E_a=0.25 eV。単位時間非輻射遷移確率（α）式（2）定義[29]：

$$ \alpha =s\exp\left(-\frac{E_a}{kT}\right) $$ (2)

s頻度因子（s⁻¹）、kボルツマン定数、T温度。低E_aで非輻射遷移確率α大。類似活性化エネルギーでZGGO:Cr³⁺とZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺熱安定性近似、Eu³⁺導入熱安定性大き影響なし示唆。ただし高温でフォノンサイドバンド（PSB、670 nm中心）優勢、発光ピーク増強誘導。

発光帯熱消光活性化エネルギー a ZGGO:Cr³⁺ b ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺粉末。インセット対応298–573 K温度依存PLスペクトル

ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺水分散液PL励起発光スペクトルも調査（図9）。粉末比較で水分散液PL励起発光曲線プロファイルほぼ同一、300、600 nm励起強度相対的弱いのみ。弱化原因水O-H振動クエンチング効果推測。

室温ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺水溶液励起発光スペクトル。インセット254 nm UV照射下ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺水溶液デジタル写真

Hek293T細胞in vitroイメージング試験採用。ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ナノ粒子培地（50 mg/mL）分散、254 nm UVランプ10 min励起後培養皿移し1 h処理。図10（左、赤色）励起なしレーザー走査共焦点顕微鏡収集細胞発光イメージ。Hek293T細胞残光発光信号1 h後依然精密測定可能十分強度、経時的漸減。比較同細胞0.5 mL DAPI染色同時励起モード共焦点顕微鏡収集（図10右、青色）。類似イメージング信号でZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ナノ粒子in vitro細胞優秀イメージング能力実証。

Hek293T細胞ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ナノ粒子1 hインキュベーション後LSCM像（左、赤色）。右像（青色）同細胞0.5 mL DAPI染色外観。スケールバー=25 µm

結論

本研究ゾルゲル法+還元雰囲気フリー焼成でスピネル構造ZGGO:Cr³⁺とZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺ナノ粒子合成。XRD、TEM、STEM、SAED、PLE/PL分光法、温度依存PL解析複合手法詳細特性評価。均一立方体形状側面サイズ~80–100 nm単結晶均質固溶体ナノ粒子得。273 nm励起で697 nm NIR発光帯（歪みCr³⁺イオン²E→⁴A₂遷移）、Eu³⁺発光不在。ZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺NIR持続発光7200 秒超持続強度維持。Eu³⁺導入でZGGO:Cr³⁺持続発光強度と残光時間増大、熱安定性大き影響なし。最終的にZGGO:Cr³⁺,Eu³⁺-NH₂ナノ粒子in vitro細胞優秀イメージング能力実証。