ドキソルビシンをロードしたGint4.T修飾DNA四面体は、PDGFRβを標的とすることにより神経膠腫細胞の増殖を阻害します

はじめに

神経上皮に由来する腫瘍である神経膠腫は、最も一般的な頭蓋内悪性腫瘍です。すべての脳腫瘍のほぼ1/3は神経膠腫であり、原発性悪性脳腫瘍の約4/5は神経膠腫です[1,2,3,4]。現在、神経膠腫の最も効果的な治療法は、外科的切除と術後の同時化学放射線療法ですが、残念ながら、患者の予後は依然として不良です。神経膠腫に対する従来の化学療法は、腫瘍の標的化が不十分であり、血液脳関門（BBB）および血液腫瘍関門（BTB）による合併症、および薬物の標的化が不十分であるため、良好な結果を示しません。 BBBは、ほとんどすべての高分子（薬物や遺伝子を含む）の脳実質への送達とそれらの適切な機能を妨げる最も重要な要因です。 BBBを通過できない薬剤は、対象領域で効果的な治療濃度を達成するために十分な高用量で投与する必要があります。ただし、過剰な薬物は、影響を受けていない組織に重度の全身性副作用や望ましくない薬物の蓄積を引き起こす可能性があります。さらに、既存の従来の抗神経膠腫薬は、不十分な標的化能力を持っています[3、4]。ナノ粒子は、最も有望な薬物運搬ツールとして浮上しています。サイズの利点により、ナノ粒子はBBBを通過し、抗腫瘍効果を発揮することができます。カファら。 [5] ANGを標的とする化学的に機能化された多層カーボンナノチューブ（f-MWNT）を設計し、invivoおよびinvitro実験を通じてBBBを通過する能力を確認しました。しかし、これらのナノマテリアルは、体中のさまざまな臓器に分布したり、中枢神経系（CNS）に侵入したりして、神経毒性を引き起こす可能性があります[6]。

DNAは、ワトソン-クリックの塩基対によってアセンブリを正確に制御できるため、ナノ構造の構築に理想的な材料です[7]。現在までに、多くの2次元（2D）および3次元（3D）DNAナノ構造が設計され、実証されてきました[8、9、10]。四面体DNAナノ構造（TDN）は、生体適合性、安定性、豊富な機能化修飾部位、および免疫原性の低さから、大きな注目を集めています[11、12、13]。 Turberfield etal。ワンステップ合成法を用いて高収率で合成されたDNA四面体ナノ構造[14]。 Walsh etal。核酸プローブを含むDNA四面体は、トランスフェクション試薬を必要とせずに哺乳類細胞に侵入できることを発見しました[15]。 Lee etal。自己組織化された四面体ナノ粒子は、invivoでの標的siRNA送達に使用できることを実証しました[16]。 TDNは、分子診断、分子送達、および標的薬物療法において優れたアプリケーションの見通しを示しています。また、乳がんなどのさまざまな臓器の腫瘍の研究にも広く使用されています[17]。同様に、TDNは神経系疾患の研究にも使用されています。 Tian etal。 [18] DNA四面体を基盤として使用し、それらをangiopep-2（ANG）で修飾して、ターゲットイメージング用の低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1（LRP-1）をターゲットにできるナノプローブANG-TDNの構築に成功しました。調査によると、ANG-TDNはBBBを通過できることがわかっています。 Ma etal。 [19]は、四面体DNAナノ構造がトランスフェクション剤を必要とせずに神経幹細胞（NSC）に入ることができ、神経幹細胞の移動、増殖、分化を促進し[20]、神経組織の修復と再生に大きな可能性があることを示唆しました。 。したがって、神経膠腫治療におけるTDNの使用の可能性と、そのターゲティング能力の強化について調査しました。

血小板由来成長因子受容体β（PDGFRβ）は、細胞増殖、遊走、血管新生に関与するチロシンプロテインキナーゼファミリーの重要なメンバーです。いくつかの研究は、PDGFβが血管新生におけるその役割のために抗腫瘍療法の有望な標的であることを示しています[21、22]。アプタマーは、指数関数的濃縮（SELEX）法によるリガンドの系統的進化によって生成される、短い一本鎖DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドです。アプタマーは抗体に類似しており、標的に対して高い親和性と特異性を持っています[23]。それらの独特の特性のために、アプタマーは、化学療法剤、siRNA、および薬物負荷ナノ粒子の標的化送達において重要な役割を果たします。 PDGFRβに特異的に結合できるRNAアプタマーであるGint4.Tは、PDGFRβ特異的アンタゴニストでもあります[24]。モナコ等。 [25]は、Gint4.Tアプタマーが血液脳関門（BBB）を通過し、PDGFRβを特異的に認識することができることを示唆しました。 Gint4.T結合高分子ナノ粒子（PNP）は、膠芽腫（GBM）細胞に容易に取り込まれます。この研究では、Gint4.TアプタマーとTDNを組み合わせた新しい薬物負荷システムを報告します。 DOX（DOX @ Apt-TDN）をロードしたGint4.T修飾TDN（Apt-TDN）は、U87MG細胞に対する特異的な細胞取り込みと細胞毒性の増強を示しました。

メソッド

資料

すべてのDNAオリゴヌクレオチドと2’F-PyRNAオリゴヌクレオチドはSangonBiotech（上海、中国）から購入し、すべてのオリゴヌクレオチド配列を表1に示します。GelRedDNAゲル染色液はSangonBiotechから購入しました。ウシ胎児血清（FBS）とダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）はどちらも、Thermo Fisher（ニューヨーク、米国）から購入しました。ドキソルビシン（DOX）は、Mengbio Technology（Chongqing、China）から購入しました。 U87MGセルは、Shanghai Life Academy of Sciences Cell Library（Shanghai、China）から購入しました。 DAPIは、中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー（北京、中国）から購入しました。

DNAナノ構造の準備

DNA四面体（表1）を組み立てるために、2μLの各オリゴヌクレオチド（S1、S2、S3、およびS4）を42μLのTMバッファー（10 mM Tris-HCl、5 mM MgCl ₂ > 、pH =8）。次に、DNA溶液を95°Cで5分間加熱し、続いてBio-Rad PCRマシン（米国カリフォルニア州）を使用して4°Cで2分間冷却しました[26、27]。 TDNの最終濃度は2μMでした。 TDN ’は、S1がS1’に置き換えられたことを除いて、同じ方法で準備されました。 Apt-TDNを合成するために、Gint4.Tアプタマーを等しいモル比でTDNに添加し、混合物を37℃で60分間インキュベートしました。合成の前に、アプタマーは短い変性-再生ステップ（85°Cで5分間、2分間で急冷、続いて10分間で37°Cに温め）にかけられました[25]。

アガロースゲル電気泳動

アガロースゲル（3％）を0.5×TEBバッファーで100Vで30分間泳動しました。電気泳動装置の温度は、装置を氷浴に置くことによって0℃に維持された。電気泳動の前に、GelRedをアガロースゲルに加えてDNA鎖を染色しました。プロセスが終了したら、Bio-Rad蛍光スキャナー（米国カリフォルニア州）を使用してゲルの画像をキャプチャしました。

動的光散乱

Malvern Zetasizer ZS90（Malvern、UK）を使用して、TDNの流体力学的サイズとゼータ電位を測定しました。合計1mLのTDN（100 nM）を動的光散乱（DLS）分析にかけました。

原子間力顕微鏡イメージング

TDNをTMバッファー（MgCl ₂ を含むTris-HClバッファー）で100nMに希釈しました。 ）。次に、10μLの各TDNサンプルを新たに劈開した雲母に添加し、10分間インキュベートしました。その後、サンプルはACモードの原子間力顕微鏡（AFM）機器（Agilent 5500、米国）で画像化されました。

準備されたTDNの薬物負荷容量の測定

ドキソルビシンを脱イオン水に溶解し、500μMの保存液を作成しました。さまざまな濃度（1〜20μM）のドキソルビシンをTDN（100 nM）またはApt-TDN（100 nM）と室温（24〜26°C）で6時間混合しました。次に、混合溶液を12,000× g で遠心分離しました。 薬物をロードしたTDNを取得するために10分間。次に、50μLの上清を除去し、1：1の比率でPBSと混合しました。 Varioskan LUXマイクロプレートリーダー（米国カリフォルニア州）を使用して、ドキソルビシン（λ）の蛍光強度を測定しました。 _ex =480nmおよびλ _em =590 nm）上澄み中のドキソルビシンの量を決定します[28]。 TDNにロードされたドキソルビシンの濃度は、検量線と蛍光強度によって計算されました。また、モル比を上げながらドキソルビシンをTDNと混合しました。

InVitroでのTDNの血清安定性

TDNを完全培地と混合し、37°C​​で0、2、4、6、8、10、12、または24時間インキュベートしました。 TDN溶液をFBSと1：1の比率で混合し、37°C​​で1、3、5、または7時間インキュベートしました。インキュベーション後、混合物を3％アガロースゲルで泳動しました。

InVitroでのTDNの細胞毒性

TDNの細胞毒性を決定するために、1×10 ⁴ の濃度のU87MG細胞 細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種しました。細胞培養培地を除去し、0〜500 nMのTDNを含む新鮮な培地を添加し、一晩インキュベートした後、さらに24時間および48時間インキュベートしました。次に、10μLのCCK-8溶液を各ウェルに加え、混合物を1時間インキュベートしました。次に、マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定しました。

蛍光イメージング

DOXおよびTDNの細胞取り込みは、蛍光顕微鏡（オリンパス、東京、日本）によって研究されました。 U87MG細胞を、10％の熱不活化ウシ胎児血清と1％のペニシリンおよびストレプトマイシンを含む培地を含む24ウェルプレートのカバーガラスに播種し、5％CO ₂ 細胞が少なくとも75％のコンフルエンスに達するまで。インキュベーション後、培地を除去した。 100 nMのCy3-TDNおよびCy3-Apt-TDNを含む完全培地を添加し、3時間インキュベートしました。 TDNとApt-TDNは、ナノ粒子の細胞間取り込みを検出するためにCy3で標識されました。 DOXの細胞取り込みを評価するために、DOX（DOX2μM）、DOX @ TDN（DOX2μM）、およびDOX @ Apt-TDN（DOX2μM）をU87MG細胞に添加し、3時間インキュベートしました。 3時間の処理後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで20分間暗所で固定し、続いて4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で5分間染色しました。細胞をPBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察しました。

フローサイトメトリー

合計1×10 ⁶ U87MG細胞を6ウェルプレートに移植しました。一晩のインキュベーション後、培養培地を除去し、100 nM Cy3-TDN、100 nM Cy3-Apt-TDN、または100 nM Cy3-Apt-TDN +1μM遊離Aptを添加した培地を添加し、3時間インキュベートしました。次に、細胞を4％パラホルムアルデヒドで20分間固定し、フローサイトメトリーを使用してCy-3陽性細胞の割合を分析しました。

細胞周期とアポトーシス

DOX、DOX @ TDN、またはDOX @ Apt-TDNで24時間処理した後、5×10 ⁵ 細胞を収集し、75％氷冷エタノールで一晩固定しました。次に、細胞をRNaseおよびヨウ化プロピジウムとともに37℃、暗所で30分間インキュベートしました。細胞周期をフローサイトメトリーによって調べた。さらに、さまざまな処理の後、細胞をアネキシンV-FITC / DAPIで染色し、初期アポトーシスを調べました。

CCK-8アッセイ

細胞生存率を決定するために、U87MG細胞（5×10 ³ ）を100μLの培地で96ウェルプレートに播種し、5％CO ₂ を含む雰囲気下で37℃で一晩培養しました。 。続いて培地を除去し、DOX、DOX-TDN、またはDOX-Apt-TDNを含む新鮮な培地を加えた。 24時間のインキュベーション後、10μLのCCK-8溶液を添加し、細胞をさらに1時間培養しました。マイクロプレートリーダーを使用して、450nmでの吸光度を測定しました。

統計分析

この研究のすべての実験は3回行われ、すべてのデータは平均値とその標準偏差（平均±SD）として表されます。統計分析は、SPSS 24.0プログラム（IBM、米国）を使用して実行されました。有意差は、学生の t を使用して決定されました P を使用してテストします <0.05は、グループ間の有意差を示します。

結果

TDNとApt-TDNの合成と特性評価

TDNは、以前に報告されたように[18、29]、シングルステップ合成を介して4つのオリゴヌクレオチド（表1）から自己組織化されました。腫瘍標的アプタマーGint4.Tは、ワトソン-クリック塩基対を介してTDNを変更するために使用されました。 DNA四面体には4つの面があり、各面は1つのオリゴヌクレオチドで形成されています。したがって、4つのオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズしてDNA四面体を形成します（図1a）。ゲル電気泳動分析は、レーン4と5に単一の顕著なバンドを示し、TDNとApt-TDNが正常に構築されたことを示唆しています。 Apt-TDNの移動度はTDNの移動度と比較して減少しており、Gint4.TアプタマーがTDNを正常に修飾したことを示唆しています。

a DNA四面体とGint4.T-TDNの合成。レーン1：S1;レーン2：S1 + S2;レーン3：S1 + S2 + S3;レーン4：S1 + S2 + S3 + S4（TDN）;レーン5：Apt-tail（Gint4.T）と混合されたTDN。 Apt-TDN。レーン1は、核酸色素が一本鎖DNAを適切に染色できないため、表示されませんでした。 b AFM画像は、TDNとApt-TDNの高さが約2nmであることを示しました。 c 動的光散乱（DLS）によるTDNおよびApt-TDNの粒子サイズとゼータ電位の決定。 TDNとApt-TDNの平均粒子サイズはそれぞれ10.10nm（A）と13.54 nm（B）でした。 TDNとApt-TDNの平均ゼータ電位はそれぞれ-5.69mV（C）と-7.3 mV（D）でした

TDNとApt-TDNのサイズは、DLSとAFMによって決定されました。 TDNとApt-TDNは、Gint4.Tリガンドの添加を反映して、それぞれ10.1nmと13.5nmの粒子サイズを示しました（図1c（A）、（B））。流体力学的直径には水分子が含まれているため、粒子は理論上のサイズよりも大きかった。 AFM画像によって決定されたTDNとApt-TDNの両方の高さは約2nmであり（図1b）、アプタマーの修飾が3D構造を変化させなかったことを示しています。 TDNとApt-TDNの平均ゼータ電位はそれぞれ-5.69mV（C）と-7.3 mV（D）でした（図1c（C）（D））。これらのパラメータに基づいて、TDNとApt-TDNは正常に組み立てられたと結論付けました。

InVitroでのTDNの安定性と細胞毒性

ゲル電気泳動分析では、完全培地で37°Cで24時間インキュベートした場合、TDNは無傷のままであることが示されました（図2a（A））。さらに、ウシ胎児血清の濃度を50％に上げると、TDNは少なくとも7時間安定したままでした（図2a（B））。これは以前の報告と一致しています[18、26]。ナノ構造の細胞毒性を決定するために、CCK-8アッセイを使用して、いくつかの濃度のTDNで処理した後のU87MG細胞の細胞生存率を評価しました。図2bに示すように、0〜500nMのTDNで24時間および48時間処理したU87MG細胞では有意な細胞毒性は観察されませんでした。したがって、DNAナノ粒子は、ドラッグデリバリー用の安定したバイオセーフキャリアとして使用できます。

a ゲル電気泳動は、TDNが37°Cの完全培地で24時間安定したままであることを示しました（A）。ウシ胎児血清の濃度が50％に増加したとき、TDNは7時間安定したままでした（B）。 b U87MG細胞は、さまざまな濃度（10〜500 nM）でTDNと24時間および48時間共培養されました。 CCK-8アッセイは、U87MG細胞の活性が影響を受けなかったことを示し、TDNの生物学的安全性を示しました

TDNおよびApt-TDNの薬物負荷容量

ドキソルビシンは、DNA二本鎖に挿入できる広域化学療法薬です。標準的なドキソルビシン曲線を計算し（図3a）、次にドキソルビシンのTDNへのインターカレーションを調査しました。 TDNおよびApt-TDNに挿入されたドキソルビシンの量は、ドキソルビシン濃度の増加とともに徐々に増加しました。ドキソルビシン濃度が14μMの場合、TDNとApt-TDNに挿入されたドキソルビシンの量はそれぞれ5.5μMと6.0μMでピークに達し、その後プラトーになり（図3b）、DNA鎖が完全に占有されていることを示しています。一方、モル比を上げながらドキソルビシンとTDNを混合しました。ドキソルビシンの蛍光スペクトルをスキャンして分析した。図3cに示すように、ドキソルビシンの蛍光スペクトルは、0.05のモル比のドキソルビシンで消光されました。これらの発見に基づいて、ドキソルビシンの約55分子が単一のTDN内に含まれ、60分子が単一のApt-TDN内に含まれていると結論付けました。

a PBSバッファー中のDOX濃度の標準曲線。 λex=480nmおよびλem=590nm。 TDNおよびApt-TDNによって運ばれるDOXの量。 b DOXはTDNとApt-TDNの二本鎖DNAに挿入されました。 DOX濃度が14μMに達し、TDNとApt-TDNに挿入されたDOX濃度がそれぞれ5.5μMと6.0μMでピークに達したとき、単一のDNA四面体は55のDox分子を運ぶことができ、単一のアプタマー修飾DNA四面体は60のDOXを運ぶことができました。分子。 c 上澄み中のDOXの蛍光スペクトル。ドキソルビシンは、増加するモル比（0、0.0005、0.001、0.005、0.01、および0.05）でTDNと混合されました。モル比が1:20になると、蛍光が消光しました

Apt-TDNのターゲットセルラー取り込み

DNAは負に帯電した高分子であるため、負に帯電した細胞膜への侵入が困難になります。通常、個々のDNA分子は、トランスフェクション試薬の助けを借りて細胞にアクセスする必要があります。ここでは、ナノ粒子の細胞内取り込みを監視するために、TDNとApt-TDNをCy3でラベル付けしました。 U87MG細胞と3時間インキュベートした後、赤いCy3蛍光シグナルが細胞質に現れ、TDNが細胞膜に結合し、トランスフェクション剤の助けを借りずに細胞に取り込まれたことを示しています（図4a）。 Apt-TDNはより高い赤色蛍光を示しました。これは、Gint4.Tアプタマーの存在が、U87MG細胞によるDNA四面体の取り込みを有意に増加させたことを示唆しています。しかし、遊離アプタマーを添加すると、Cy3蛍光はTDNのみで観察されたレベルまで減少しました。遊離アプタマーによる競合阻害のため、TDN上のアプタマーはTDNの取り込みを促進できなかったと推測されます。この競合阻害に基づいて、Apt-TDNがU87MG細胞を標的にできることを証明しました。フローサイトメトリーはさらに、Cy3陽性U87MG細胞の割合がTDNグループよりもApt-TDNグループの方が高いことを証明しました。 Free Aptは、Apt-TDNグループのCy3陽性U87MG細胞の割合を減少させました（図4b）。

a TDNおよびApt-TDN（TDN-Gint4.T）のU87MG細胞取り込み。 TDNはトランスフェクション剤なしでU87MG細胞に直接侵入し、Apt-TDN（アプタマーGint4.Tにリンク）の取り込みが大幅に増加し、遊離Apt（Gint4.T）によって競合的に阻害され、アプタマーGint4.Tが細胞ターゲティングにおける重要な役割。スケールバーは50μmを表します。 b フローサイトメトリー曲線は、3時間のインキュベーション後のTDN、Apt-TDN、およびApt-TDN + Aptの細胞内取り込みを示しています

DOX @TDNおよびDOX @ Apt-TDNの細胞内取り込み

ドキソルビシンの特徴的な蛍光スペクトルを利用して、薬物の取り込み効率を評価しました。 3時間の処理後、細胞内ドキソルビシンを蛍光顕微鏡で画像化しました（図5a）。遊離ドキソルビシンはU87MG細胞に侵入する可能性があり、核内に存在していました。 DOX @ TDNを添加すると、蛍光は遊離ドキソルビシンよりも高くなりました。この結果は、DNAナノ粒子がドキソルビシンの細胞取り込みを増強したことを示唆しました。 DOX @ Apt-TDNを追加すると、核内の赤色信号は、DOX @TDNを追加した細胞の信号よりもさらに高くなりました。 DOXの細胞内取り込みの半定量分析により、Apt-TDNが単剤の場合と比較して細胞内DOX取り込みの2倍以上の増加を促進することがさらに確認されました。これは、受容体へのGin4.T特異的結合によるものであり、その後、より多くのナノ粒子が細胞に入る可能性があると推測されます。リソソームで消化された後、ドキソルビシンは細胞質に放出され、核でさらに機能します。

a DOX、DOX @ TDN、およびDOX @ Apt-TDNの細胞内取り込み。アプタマーGint4.Tで修飾された、Apt-TDNは、TDNよりも多くのドキソルビシンをU87MG細胞に送達できます。さらに、TDNは、薬物単独よりも多くの薬物を細胞に運ぶことができます。スケールバーは50μmを示します。 b PBS、DOX、DOX @ TDN、およびDOX @ Apt-TDN処理によるドキソルビシンの蛍光強度の半定量分析（ブランクと比較：* p <0.05、** p <0.01）

DOX、DOX @ TDN、およびDOX @ Apt-TDNの細胞毒性

細胞毒性研究では、U87MG細胞の3つのグループを異なる濃度のドキソルビシンで処理しました（図6a）。 IC ₅₀ ドキソルビシンの値は、DOX治療で13.39μM、DOX @ TDN治療で7.826μM、DOX @ Apt-TDN治療で4.205μMでした。 3つの処理の中で、DOX @ Apt-TDNは24時間で最も高い細胞毒性を示しました。これは、U87MG細胞に対するApt-TDNの特異性を示しています。 24時間後、DOX、DOX @ TDN、およびDOX @ Apt-TDNグループの細胞を収集し、初期アポトーシスの調査に使用しました。私たちのデータは、初期アポトーシス率が他の2つのグループよりもDOX @ Apt-TDNグループの方が高かったことを示しています（図6b）。さらに、G0 / G1期の細胞の割合は、DOXおよびDOX-TDNグループと比較してDOX-Apt-TDNグループで増加しました（ p <0.01）、S期の細胞の比率はDOX-Apt-TDNグループで減少しました（ p <0.01）（図6c）。 G2期の細胞の割合は変化しませんでした（データは示していません）。

a さまざまな濃度でのDOX、DOX @ TDN、およびDOX @ Apt-TDNの細胞毒性。 U87MG細胞の阻害率は、DOX濃度の増加とともに有意に増加しましたが、DOX @TDNおよびDOX @ Apt-TDNグループは、DOXグループと比較して有意に増加した細胞毒性を示しました。 DOX @ Apt-TDNグループの細胞阻害率も、DOX @ TDNグループの細胞阻害率よりも有意に高かった（DOXと比較して、** p < 0.05; DOXと比較して、*** p <0.01; DOX @ Apt-TDNと比較して、 ^＃ p <0.05）。 b PBS、DOX、DOX @ TDN、およびDOX @ Apt-TDNと24時間インキュベートした後のU87MG細胞のアポトーシス。 c PBS、DOX、DOX @ TDN、およびDOX @ Apt-TDNと24時間インキュベートした後のU87MG細胞周期のフローサイトメトリーヒストグラム（コントロールと比較して、** p < 0.05;コントロールと比較して、*** p <0.01; DOX @ Apt-TDNと比較して、 ^＃ p <0.01）

ディスカッション

インビトロまたはインビボ実験のいずれを介しても、薬物およびその担体の安定性を決定する必要があります。 TDNの組み立て後、その安定性は最初にinvitroで決定されました。この研究は、DNAナノ粒子の3D構造が、酵素結合を阻害することにより、血清中での安定性を改善できることを示しました。関連するナノ構造の生物学的安全性は、そのアプリケーションの最も重要な要件です。さまざまな濃度のTDNと24時間または48時間共培養したU87MG細胞では、有意な細胞毒性は観察されませんでした。この研究で使用されたDNA配列はいずれも遺伝情報をコードしておらず、細胞毒性試験で副作用は報告されていません。したがって、TDNは安全で安定した薬物担体として機能することができます。

アプタマー修飾ナノ構造のターゲティング効率は、癌細胞への選択的ドラッグデリバリーにとって非常に重要です。抗体とは異なり、アプタマーは化学的に安定しており、安価であり、大量生産することができます。さらに、他の材料とは異なり、アプタマーは塩基相補性の原理を使用してDNA四面体に簡単に結合できます。このように、アプタマーとDNA四面体の組み合わせは、標的化ドラッグデリバリーと次世代治療の基礎を築きます。私たちの結果は、TDNがトランスフェクション剤なしで細胞に入ることができることを示しました。これはWalshらの結果と同様です。およびMaetal。 [15、19]。 TDNのそれと比較して、U87MG細胞によるApt-TDNの取り込みは有意に増加しました。無料のアプタマーを追加した後、この増加は消えました。この結果は、Gint4.TがPDGFRβ特異的アンタゴニストであることを示唆しています[25]。私たちの研究は、神経膠腫細胞の表面でのPDGGRβの高発現により、Gint4.TアプタマーがU87MG細胞を標的とする可能性があることを示しました。 Camorani etal。 [24]はまた、Gint4.TアプタマーがPDGFRβの細胞外ドメインと特異的に相互作用することによって腫瘍細胞を標的にすることができることを示しました。 Gint4.Tアプタマーターゲティングの利点は、in vitro研究によってある程度実証されていますが、これらの発見を確認するには、さらにinvivo試験が必要です。この研究はまた、DOX @ Apt-TDNがDOXまたはDOX @ TDNよりも細胞毒性が高いことを確認しました。これはおそらく2つの要因に起因します。まず、Gint4.Tアプタマーは、PDGFR細胞外ドメインに特異的に結合し、腫瘍細胞の増殖をブロックし、腫瘍細胞の増殖を阻害します[24]。これは私たちの実験結果と一致しています。対照群と比較して、DOX、DOX @ TDN、およびDOX @ Apt-TDNによる治療後のU87MG細胞周期の変化は、G0 / G1期の腫瘍細胞で有意に増加し、S期の細胞で減少し、G0で腫瘍細胞をブロックしました/ G1期。これは、U87MG細胞の細胞周期を阻害し、増殖を阻害できることを示しています。 DOXおよびDOX @ TDNグループと比較して、DOX @ Apt-TDNグループはU87MG細胞の増殖を阻害する非常に強力な能力を持っていました。さらに、Gint4.Tは腫瘍細胞に特異的に結合し、DOX @ Apt-TDN複合体の細胞ターゲティングを強化します。したがって、薬剤の標的化効率を高め、抗腫瘍薬の全身投与量を減らして、全身性の副作用を防ぐことができます。

結論

Gint4.Tによる修飾は、神経膠腫細胞で大量に発現するPDGFRβを標的とすることにより、神経膠腫治療におけるTDNの特異性と効率を高めました。さらに、Apt-TDNをロードすると、DOXの抗神経膠腫効果を大幅に促進する可能性があります。したがって、DOX @ Apt-TDNは、患者の神経膠腫に対する有望な治療戦略として役立つ可能性があります。この研究の欠点は、invitroでのみ検証されていることです。後の研究では、動物モデルをさらに調査します。

データと資料の可用性

関連するデータは記事に含まれています。

略語

BBB：

血液脳関門

BTB：

血液腫瘍バリア

TDN：

四面体DNAナノ構造/ DNA四面体

DOX：

ドキソルビシン

PDGFRβ：

血小板由来成長因子受容体β

Apt-TDN：

Gint4.Tで変更されたTDN

DOX @ TDN：

DOXをロードしたTDN

DOX @ Apt-TDN：

Gint4.T-DOXをロードした変更されたTDN

CNS：

中枢神経系

ANG：

Angiopep-2

LRP-1：

Low-density lipoprotein receptor-related protein 1

SELEX:

Exponential enrichment

PNPs:

Polymeric nanoparticles

GBM:

Glioblastoma

FBS：

Foetal bovine serum

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

DLS：

動的光散乱

AFM：

原子間力顕微鏡

CCK-8：

Cell Counting Kit-8

Cy3:

Sulfo-Cyanine3

DAPI：

4′,6-Diamidino-2-phenylindole