ヒト臍帯由来MSCエクソソームmiR-18b-3pがレプチンを標的とし子癇前症リスクを低減

要旨

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（hucMSC）由来エクソソームが発現するマイクロRNAは、ヒト疾患において注目されています。しかし、hucMSC由来エクソソームmiR-18b-3pの子癇前症（PE）に対する詳細な分子メカニズムは更なる検討が必要です。本研究は、エクソソームとmiR-18b-3p/レプチン（LEP）がPE発症に及ぼす影響を調査することを目的としました。hucMSCとhucMSC由来エクソソーム（Exos）の形態を同定しました。異なるmiR-18b-3p発現レンチウイルスでエクソソームを感染させ、miR-18b-3pのPEにおける役割を探索しました。N-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル腹腔内投与でPEラットモデルを確立しました。PEラット胎盤組織でのLEPとmiR-18b-3p発現を測定しました。また、エクソソームがLEPとmiR-18b-3p発現に及ぼす影響を検出しました。PEラットの収縮期血圧（SBP）、蛋白尿、炎症因子、胎仔と胎盤の重量、細胞アポトーシスを測定しました。最後に、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイとRNAプルダウンアッセイでmiR-18b-3pとLEPの関係を検証しました。エクソソーム、miR-18b-3p回復、またはLEP阻害は、PEラットのSBPと蛋白尿を減少させ、胎仔と胎盤重量を増加させ、血清炎症因子レベルを低下させ、PEラットのアポトーシス細胞を抑制し、PE進行に対する抑制効果を示しました。PEラット胎盤組織ではmiR-18b-3pが低下し、LEPが上昇していました。LEPはmiR-18b-3pの直接標的遺伝子でした。miR-18b-3p上方制御またはエクソソーム処理はLEP発現を抑制しPE発症を減少させましたが、miR-18b-3pダウンレギュレーションは逆の効果を示しました。LEPダウンレギュレーションは、miR-18b-3p減少のPEラットへの効果を逆転させました。hucMSC由来エクソソームmiR-18b-3pはLEPを標的としてPEの発症と進行に関与します。本研究は、PEのメカニズムと研究に対する新たな理論的基盤を提供する可能性があります。

はじめに

子癇前症（PE）は、蛋白尿と高血圧を特徴とし、ヒト妊娠における胎児と母体の死亡率と罹患率の主要な原因です。PEの病因と発症機序は不明確で、異常なトロホブラスト侵襲による母体内皮機能不全、慢性胎盤灌流不全、悪影響を伴う高血圧と関連していると報告されています。胎児と胎盤の分娩を除き、PEに対する特異的治療法はありません。したがって、この疾患の予後改善のための治療標的の探索が急務です。

ヒト臍帯（huc）は、多様な栄養因子とサイトカインを分泌し、強力な抗炎症作用と免疫調節能を示す間葉系幹細胞（MSC）の適切な供給源です。PEが臍帯ワートンジェリー由来MSCの神経膠マーカー発現を加速することが検証されています。hucMSCエクソソーム（Exos）がPEラットの胎盤形態と血管新生に保護的効果を持つことも報告されています。エクソソームは小型（50-100 nm）の分泌小胞で、腫瘍微小環境において発癌因子をカプセル化し、循環によって遠隔部位や周囲細胞へ伝達することで細胞間コミュニケーションを媒介します。sFlt-1とsEngがエクソソームによってPE患者の内皮細胞へ効果的に移行し、血管機能障害と合併症を誘導することが明らかにされています。マイクロRNA（miRNA）は、18-25ヌクレオチドの長さを持つ内因性非コードRNAで、転写後レベルで遺伝子発現を制御します。ある研究では、miR-18b発現がPEにおけるトロホブラスト細胞の細胞侵襲、生存率、遊走に影響することが報告されています。さらに、WuらはmiR-18bが高グルコース誘導ヒト網膜内皮細胞の増殖を抑制し、糖尿病網膜症発症機序の理解に新たな知見を提供する可能性を提案しています。しかし、hucMSC由来エクソソームmiR-18b-3pのPEにおける役割は未知です。レプチン（LEP）は、主に脂肪細胞から分泌されるほか、胎盤を含む他の組織でも発現し、生理状態における細胞分化/増殖と免疫に多面的な効果を持ちます。異常なLEPプロモーターメチル化がPE進行に関与することが検証されています。別の研究では、胎盤が妊娠中のLEP発現の主要部位であることが示唆されています。しかし、miR-18b-3pとLEPの結合関係は依然として不明です。したがって、本研究はLEPの関与のもと、hucMSC由来エクソソームmiR-18b-3pのPEにおける役割を探索することを目的とし、hucMSC由来エクソソームmiR-18b-3pがLEPを標的としてPE進行を抑制すると推測しました。

材料と方法

倫理的承認

本研究は武漢大学人民病院倫理委員会の承認を得ました。すべての参加者がインフォームドコンセント文書に署名しました。すべての動物実験は、武漢大学人民病院国際委員会の実験動物の飼育と使用のガイドラインに準拠しました。

HucMSCの分離、培養、同定

健康な産婦から分娩された胎児臍帯を採取し、微細に切断、ふるいにかけ、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液と混合しました。臍帯組織を遠心半径10 cmで1500 rpm、5分間遠心分離しました。組織を10%胎児牛血清（FBS）含有Dulbecco改変Eagle培地（DMEM）/F12で懸濁し、培養フラスコに移しました。培養液を4日後に交換し、その後3日ごとに交換しました。コンフルエンスが約90%に達した時点で継代培養しました。hucMSCの貼着増殖と形態を倒立顕微鏡で観察しました。細胞をオイルレッドO染色液（Beyotime Institute of Biotechnology、上海、中国）で染色し、hucMSCの骨形成分化を検出し、アルカリホスファターゼ（ALP）染色液（Beyotime）で染色し、脂肪形成分化を検出しました。フローサイトメーター（Beckman Coulter Life Sciences、ブレア、カリフォルニア州、米国）でCD73、CD166（ともに1:10、BD Biosciences、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）、CD105（1:20、AbD Serotec、オックスフォード、英国）を測定しました。

HucMSC-Exosの抽出と同定

良好に増殖しているhucMSCを培養しました。上清を回収し、遠心半径10 cmで28,500 rpm、1時間遠心分離しました。上清を除去し、細胞を2%グルタルアルデヒドと1%オスミウム酸で固定し、エタノールで脱水、プロピレンオキシドに浸漬、2時間乾燥、Epon812で包埋、スライスしました。スライスをウランと鉛でそれぞれ染色し、最終的に電子顕微鏡でエクソソームを観察しました。ナノサイト検出器（Malvern Instruments、マルバーン、英国）でエクソソームナノ粒子のブラウン運動イメージングとサイズを検出しました。hucMSC-Exosの表面マーカーをウエスタンブロットアッセイで同定し、CD9、CD81、CD63の発現を確認しました。

レンチウイルス感染法

hucMSCを、miR-18b-3p低発現ベクターとmiR-18b-3p低発現ベクターネガティブコントロール（NC）を含むレンチウイルスで感染させました（Shanghai GenePharma Co, Ltd、上海、中国）。最終的に、安定発現するhucMSC-antagomir NCとhucMSC-miR-18b-3p antagomirを得ました。細胞を48時間培養し、上清を回収、超遠心分離で対応するExos-antagomir NCとExos-miR-18b-3p antagomirを得ました。

実験動物

健康清潔レベル、性成熟したWistarラット（体重200-250 g、齢8週、性別不問）を選択しました（武漢大学実験動物センター、武漢、中国）。ラットを温度18-28°C、相対湿度40-70%、十分な餌と水のバリアシステムで飼育しました。

ラットPEモデルの確立

文献[17]を参照し、一酸化窒素合成酵素阻害剤N(G)-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル（L-NAME、Beyotime）を50 mg/kgで腹腔内投与してラットPEモデルを確立しました。PEモデルの成功確立は、血圧上昇20 mmHg以上かつ115 mmHg以上、および蛋白尿増強に基づきました。

動物群分け

雌ラットと雄ラットを1:1でランダムに同居させ、前日の17-18時に個別の特別ケージで飼育しました。翌日に膣栓と顕微鏡で雌ラット膣分泌物の精子を観察し、陽性ならその日を妊娠0日と記録しました。妊娠13日目から、ラットを6群（各群10匹）に分けました：正常群（妊娠13-20日目に同量の生理食塩水を腹腔内投与）、PE群（妊娠13-20日目にL-NAME[50 mg/kg/日]を腹腔内投与、妊娠16-19日目に胎盤へ20 μL生理食塩水を注射）、PE+miR-NC群（妊娠13-20日目にL-NAME[50 mg/kg/日]を腹腔内投与、妊娠16-19日目に胎盤へ20 μLの4 nmol miR-NCを注射）、PE+miR-18b-3p agomir群（妊娠13-20日目にL-NAME[50 mg/kg/日]を腹腔内投与、妊娠16-19日目に胎盤へ20 μLの4 nmol miR-18b-3p agomirを注射）、PE+miR-18b-3p antagomir群（妊娠13-20日目にL-NAME[50 mg/kg/日]を腹腔内投与、妊娠16-19日目に胎盤へ20 μLの4 nmol miR-18b-3p antagomirを注射）、PE+miR-18b-3p antagomir+si-LEP群（妊娠13-20日目にL-NAME[50 mg/kg/日]を腹腔内投与、妊娠16-19日目に胎盤へ20 μLの4 nmol miR-18b-3p antagomirとsi-LEPを注射）、PE+si-LEP群（妊娠13-20日目にL-NAME[50 mg/kg/日]を腹腔内投与、妊娠16-19日目に胎盤へ20 μLの4 nmol si-LEPを注射）。ラットをエクソソームとレンチウイルス担持エクソソームで処理しました。ラットを5群（各群10匹）に割り付けました：正常群（妊娠13-20日目に同量の生理食塩水を腹腔内投与）、PE群（妊娠13-20日目にL-NAME[50 mg/kg/日]を腹腔内投与、妊娠16-19日目に胎盤へ20 μL生理食塩水を注射）、PE+Exos群（妊娠13-20日目にL-NAME[50 mg/kg/日]を腹腔内投与、妊娠16-19日目に胎盤へ20 μLのExos[80 μgエクソソームを20 μL生理食塩水に懸濁]を注射）、PE+Exos-antagomir NC群（妊娠13-20日目にL-NAME[50 mg/kg/日]を腹腔内投与、妊娠16-19日目に胎盤へ20 μLのExos-antagomir NC[80 μgエクソソームを20 μL生理食塩水に懸濁]を注射）、PE+Exos-miR-18b-3p antagomir群（妊娠13-20日目にL-NAME[50 mg/kg/日]を腹腔内投与、妊娠16-19日目に胎盤へ20 μLのExos-miR-18b-3p antagomir[80 μgエクソソームを20 μL生理食塩水に懸濁]を注射）。

収縮期血圧（SBP）検出と24時間蛋白尿測定

ラット尾動脈血圧測定法で血圧を測定しました。すべての妊娠ラットの尾カフSBPを妊娠10、13、16、19日目にラット尾動脈圧検出器（Tensys(R) Medical Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）で測定しました。短時間で3回測定し、平均値を血圧としました。

自由摂食・給水下で、妊娠10、13、16、19日目の24時間尿を採取し、武漢大学人民病院腎臓内科で蛋白含量を測定しました。

検体採取

妊娠21日目に3%ペントバルビタールナトリウムで妊娠ラットを麻酔しました。ラット末梢血を保存し、遠心分離して血清を採取、-20°Cで保存しました。その後、帝王切開で胎仔と胎盤を取り出し、胎膜と連結臍帯を除去し、胎仔に連結した臍帯を切断しました。胎盤と胎仔を無菌ガーゼで血液と羊水を拭き取り、分析天秤で重量を測定しました。胎盤組織の一部を4%パラホルムアルデヒドで固定し、エタノール脱水、キシレン透明化、パラフィン包埋、連続横切片（5 μm）を作製し、ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色とTUNEL染色を行いました。残りを-80°Cで保存し、RT-qPCR検出、ウエスタンブロット解析、ELISAに供しました。

ELISA

血清中の腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、インターロイキン（IL）-1β、IL-6含量をELISAで測定しました。TNF-α、IL-1β、IL-6濃度をキット（R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）の指示に従って測定しました。光学密度（OD）値（490 nm）をマイクロプレートリーダー（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国）で測定しました。OD値を横軸、対応する標準サンプル濃度を縦軸として標準曲線を作成し、TNF-α、IL-1β、IL-6濃度を標準曲線から算出しました。

HE染色

胎盤組織パラフィン切片をキシレンで透明化、慣用勾配アルコールで脱水、ヘマトキシリンで染色、1%塩酸アルコールで分化、1%アンモニア水で青化しました。その後、1%エオシン液で対比染色、脱水（75%、90%、95%エタノール、無水エタノール）、キシレンで透明化、乾燥、封入し、電子顕微鏡で観察しました。

TUNEL染色

パラフィン包埋切片を指示に従って日常的に脱蝋・脱水し、TUNELキット（Nanjing Kejin Biotechnology Co., Ltd.、江蘇、中国）でアポトーシスを検出しました。4,6-ジアミノ-2-フェニルインドール（Shanghai Baitai Biotechnology Co., Ltd.、上海、中国）を用い、蛍光顕微鏡（Nikon、東京、日本）でTUNEL陽性細胞を観察しました[18]。

RT-qPCR

胎盤組織を秤量し、50-100 mgごとに1 mL TRIzol（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を添加して完全溶解しました。200 μLクロロホルムを添加し、4°C、12,000 rpmで遠心分離して総RNAを抽出しました。RNA濃度と純度をDU-800蛋白核酸分光光度計（Beckman）で測定しました。U6とβ-actinをローディングコントロールとして用いました。PCRプライマーをShanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd.（上海、中国）で設計・合成しました（表1）。RNA逆転写キット（Sangon）の指示に基づきRNAをcDNAに逆転写しました。PCR増幅し、産物をアガロースゲル電気泳動で検証しました。データを2^(-ΔΔCt)法で算出しました。

ウエスタンブロットアッセイ

胎盤組織総蛋白を放射免疫沈殿アッセイ細胞溶解バッファー（Beyotime）で抽出しました。HucMSC-Exoを抽出バッファーとして用い、14,000 rpmで遠心分離しました。上清を保存し、血清中のエクソソームマーカー蛋白（CD81、CD63、CD9）発現を検出しました。蛋白濃度をビシンコニン酸キット（Beyotime、P0010）で測定しました。定量結果に基づきサンプルをロードし、10% SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、メンブレンに転写しました。メンブレンを5%脱脂乳でブロッキングし、一次抗体（LEP、CD63、CD81、CD9、β-actin、4 mL、1:1000、Santa Cruz Biotechnology, Inc、サンタクルーズ、カリフォルニア州、米国）で反応させ、4 mL二次抗体ヤギ抗ウサギIgG/ホースラディッシュペルオキシダーゼで再反応させ、露光・現像しました。β-actinを内部基準として用いました。グレー値をゲル画像解析ソフトウェアImage Labで解析しました。

デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ

オンライン予測ソフトウェアhttps://cm.jefferson.edu/でmiR-18b-3pとLEPの標的関係と、miR-18b-3pとLEP 3'非翻訳領域（UTR）の結合部位を予測しました。miR-18b-3p結合部位を含むLEP 3'UTRプロモーター領域配列を構築しました。LEP 3'UTRワイルドタイプ（WT）プラスミドとLEP 3'UTR変異型（MUT）を構築しました。組み換えプラスミドをそれぞれLEP 3'UTR-WT、LEP 3'UTR-MUTと命名しました。培養した293T細胞を、miR-18b-3p mimic+LEP 3'UTR-WT、miR-18b-3p mimic+LEP 3'UTR-MUT、mimic NC+LEP 3'UTR-WT、mimic NC+LEP 3'UTR-MUTで30時間共トランスフェクションしました。その後293T細胞を回収し、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット（Promega、マディソン、ウィスコンシン州、米国）に従い、ホタルルシフェラーゼとレニラルシフェラーゼ活性を発光測定で測定しました。

RNAプルダウンアッセイ

ビオチン標識RNAプローブ（Bio-miR-NC、Bio-miR-18b-3p、Bio-miR-18b-3p-Mut）を293T細胞溶解液とインキュベートし、抗生物質ストレプトマイシン共役磁気ビーズで抽出しました。実験をPierce磁気RNAプルダウンキット（Pierce、イリノイ州、米国）の指示に従って行いました。RNAをTRIzol（Pierce）で溶出・精製しました。RNA複合体中のLEP富化を、前述のRT-qPCRで定量しました[19]。

統計解析

すべてのデータをSPSS 21.0ソフトウェア（IBM Corp.、アーモンク、ニューヨーク州、米国）で解析しました。測定データを平均±標準偏差で示しました。2群比較は独立サンプルt検定、多群比較は一元配置分散分析（ANOVA）後にTukey事後検定を行いました。統計的有意水準はp < 0.05としました。

結果

HucMSCとHucMSC-Exosの形態と同定

臍帯組織塊を倒立顕微鏡で観察しました。3日目に組織塊から細胞が這い出し、5日目頃には紡錘形・糸状でコロニー状に増殖していることが確認できました（図1a）。3継代目で培養すると、細胞形態は均一な長紡錘形で線維芽細胞様形態を示し、規則正しく配列していました（図1a）。hucMSCを2週間脂肪形成分化させると、細胞質に脂肪滴が形成され、倒立顕微鏡下でクラント構造を示しました（図1b）。これは分離培養hucMSCが脂肪形成分化能を持つことを示唆します。2週間骨形成分化後、倒立顕微鏡下で多数の褐色カルシウム結節が観察されました（図1c）。これは分離培養hucMSCが骨形成分化能を持つことを示しています。フローサイトメーターで細胞免疫表現型を検出し、MSC表面マーカーCD73、CD105、CD166の過剰発現を確認しました（図1d）。

Morphology and identification of the hucMSC and hucMSC-Exos. a The morphology of the hucMSC under the inverted microscope, b hucMSC was tested by oil red O staining. c hucMSC was tested by ALP staining. d Flow cytometry was used to detect immunophenotype. e The shape and size of hucMSC-Exos observed through a TEM. f Detection of particle size distribution of exosomes using Nanosight analysis. g Protein expression of CD9, CD81 and CD63 in hucMSC-Exos was detected by western blot assay

hucMSC-Exosの形態を透過型電子顕微鏡（TEM）で観察し、エクソソームが円形または楕円形で中心密度が低く、両側に濃い染色を示すことを確認しました（図1e）。ナノサイト解析でエクソソーム粒子サイズを解析し、粒子サイズが主に40-100 nmに分布し、80 nm付近に集中していることを確認しました（図1f）。ウエスタンブロットアッセイで、すべての表面マーカーCD81、CD63、CD9がhucMSC-Exosで発現していることを確認しました（図1g）。

miR-18b-3p回復がPEラットの病理学的特性を軽減

SBPと24時間蛋白尿の結果（図2a, b）では、投与前（妊娠10日目）の6群間でSBPと24時間蛋白尿に有意差はありませんでした。妊娠19日目の正常ラットではSBPと24時間蛋白尿に明確な差はありませんでした。PEラットまたはPEラットにmiR-NC、miR-18b-3p agomir、miR-18b-3p antagomir、miR-18b-3p antagomir+si-LEP、si-NC、si-LEPを処理した群では、SBPと24時間蛋白尿が妊娠13日目から上昇し始めました。miR-18b-3p agomirとsi-LEP処理PEラットでは、妊娠16日目と19日目のSBPと24時間蛋白尿に明確な差はありませんでした。PEラットでは妊娠19日目にSBPと24時間蛋白尿が上昇しましたが、この上昇はmiR-18b-3p上昇で減少させられ、miR-18b-3p阻害でさらに増強されました。LEP減少は、妊娠19日目のPEラットにおけるmiR-18b-3pダウンレギュレーションのSBPと24時間蛋白尿への役割を打ち消しました。

Restoring miR-18b-3p alleviates pathological characteristics of PE rats. a Results of SBP in rats. b Results of 24-h proteinuria in rats. c Weight changes of fetal rats. d Changes of placental weight in rats. e Changes of inflammatory factors in serum were detected using ELISA. n = 10, *p < 0.05 versus the normal group. ^p < 0.05 versus the PE + miR-NC group. @p < 0.05 versus the PE + miR-18b-3p antagomir group. &p < 0.05 versus the PE + si-NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey's test

胎仔と胎盤重量はPEラットで減少しました。miR-18b-3p上方制御またはLEPダウンレギュレーションで増加し、miR-18b-3pダウンレギュレーションで減少しました。LEP沈黙は、miR-18b-3p阻害の胎仔と胎盤重量への効果を逆転させました（図2c, d）。

PEラット血清炎症因子を検出しました。PEラットでTNF-α、IL-1β、IL-6含量が増加しました。miR-18b-3p上昇またはLEP阻害で抑制され、miR-18b-3p減少で促進されました。阻害されたmiR-18b-3pのTNF-α、IL-1β、IL-6含量への効果はLEP枯渇で打ち消されました（図2e）。

miR-18b-3p過剰発現がPEラット胎盤組織の組織病理学的変化を改善

正常ラットでは、胎盤絨毛が豊富な血管を持ち明確な構造で、シンキシオトロホブラストが胎盤絨毛の主要トロホブラストであり、細胞性トロホブラストは少数でした。PEラットまたはPEラットにmiR-NC、miR-18b-3p antagomir、si-NC、miR-18b-3p antagomir+si-LEPを処理した群では、胎盤絨毛数が減少し、構造が不明瞭で萎縮し、一部の絨毛がフィブリノイド壊死を示し、胎盤絨毛内のシンキシオトロホブラスト結節数が増加し、ほとんどの絨毛が未熟でした。栄養細胞数が減少し、miR-18b-3p agomirとsi-LEP処理PEラットで病理学的変化が軽減されました（図3a）。

Overexpressed miR-18b-3p ameliorates pathological change and suppresses apoptotic cells of placenta tissues in PE rats. a HE staining was utilized to test pathological features of placenta tissues. b TUNEL staining was implemented to determine apoptotic cells of placenta tissues in PE rats. c Cell apoptosis rate was detected by TUNEL staining. n = 10, *p < 0.05 versus the normal group. ^p < 0.05 versus the miR-NC group. @p < 0.05 versus the miR-18b-3p antagomir group. &p < 0.05 versus the si-NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey's test

TUNEL染色では、少数のアポトーシス細胞が観察されました。PEラットでアポトーシス細胞が増加し、miR-18b-3p上昇とLEP沈黙で減少し、miR-18b-3p阻害でさらに増加しました。LEP沈黙は、miR-18b-3p阻害のPEラットアポトーシス細胞数への効果も逆転させました（図3b, c）。

総じて、miR-18b-3p上方制御またはLEP阻害ラットでは組織学的にPE進行度が低下し、LEP沈黙は阻害されたmiR-18b-3pの治療効果を打ち消すことができました。

PEラット胎盤組織でmiR-18b-3pがダウンレギュレーション、LEPがアップレギュレーションされ、miR-18b-3pがLEPを標的とする

上記結果に基づき、LEPダウンレギュレーションがmiR-18b-3pダウンレギュレーションのPEラットへの治療効果を病理学的・組織学的に逆転させたため、miR-18b-3pがLEPに関連すると仮説を立てました。

ウエスタンブロットアッセイとRT-qPCRで、PEラットではmiR-18b-3pが減少し、LEP発現レベルが増加していることを確認しました。miR-18b-3p agomir処理でPEラットのmiR-18b-3pが上方制御され、LEPがダウンレギュレーションされました。miR-18b-3p antagomir処理でLEP発現が増加しました。LEP沈黙は、PEラットでのmiR-18b-3p減少によるLEP発現促進効果を逆転させました（図4a-c）。

miR-18b-3p is downregulated and LEP is upregulated in placenta tissues of PE rats. a Expression of miR-18b-3p and LEP mRNA in placenta tissues was detected using RT-qPCR. b Protein band of LEP in placenta tissues. c Western blot assay was conducted to detect LEP protein expression in placenta tissues. d Expression of miR-18b-3p and LEP mRNA in placenta tissues after exosome treatment was detected using RT-qPCR. e Protein band of LEP in placenta tissues after exosome treatment. f Western blot assay was performed to detect LEP protein expression after exosome treatment. g The binding sites of miR-18b-3p and LEP predicated by an online software. h The target relationship between miR-18b-3p and LEP verified by dual-luciferase reporter gene assay. i targeting relationship between miR-18b-3p and LEP verified by RNA pull-down assay. n = 10, *p < 0.05 versus the normal group. ^p < 0.05 versus the miR-NC group. @p < 0.05 versus the miR-18b-3p antagomir group. &p < 0.05 versus the si-NC group. #p < 0.05 versus the PE group. $p < 0.05 versus the PE + Exos-antagomir NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey's test

ウエスタンブロットアッセイとRT-qPCRでエクソソームのPEラットでの役割を探索しました。結果、エクソソームがPEラットでmiR-18b-3pを上方制御し、LEPをダウンレギュレーションすることを示し、エクソソームのPE発達抑制効果を示唆しました。さらに、miR-18b-3p antagomirを担持するエクソソームが、PEラットでmiR-18b-3pダウンレギュレーションとLEP上方制御を誘導しました（図4d-f）。

バイオインフォマティクスオンライン予測ソフトウェアhttps://cm.jefferson.edu/でmiR-18b-3pとLEPの標的関係を予測しました（図4g）。デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイで、miR-18b-3p mimicがLEP 3'UTR-WTのルシフェラーゼ活性を低下させ、LEP 3'UTR-MUTには影響を与えないことを確認しました（図4h）。さらに、RNAプルダウンアッセイで、WT-ビオチン標識miR-18b-3pでLEP富化が増加することを示しました（図4i）。これらの所見は、LEPがmiR-18b-3pの標的遺伝子であることを示しています。

HucMSC-ExosがPEラットの病理学的特性を減弱

SBPと24時間蛋白尿の結果（図5a, b）では、投与前（妊娠10日目）の5群間でSBPと24時間蛋白尿に有意差はありませんでした。妊娠19日目の正常ラットではSBPと24時間蛋白尿に明確な差はありませんでした。PEラットではSBPと24時間蛋白尿が妊娠13日目から上昇し始めました。hucMSC-ExosとhucMSC-Exos-antagomir NC処理PEラットでは、妊娠16日目と19日目のSBPと24時間蛋白尿に明確な差はありませんでした。PEラットでは妊娠19日目にSBPと24時間蛋白尿が上昇しましたが、この上昇はhucMSC-Exos注射で減少させられました。miR-18b-3p阻害は、妊娠19日目のPEラットにおけるhucMSC-ExosのSBPと24時間蛋白尿への効果を逆転させました。

hucMSC-Exos attenuate pathological characteristics of PE rats. a Results of SBP in rats after exosome treatment. b Results of 24-h proteinuria in rats after exosome treatment. c Weight changes of fetal rats after exosome treatment. d Changes of placental weight in rats after exosome treatment. e Changes of inflammation factors after exosome treatment in serum were determined using ELISA. n = 10, *p < 0.05 versus the normal group. #p < 0.05 versus the PE group. $p < 0.05 versus the PE + Exos-antagomir NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey's test

胎仔と胎盤重量を測定し、PEラットで胎仔と胎盤重量が減少していることを確認しました。miR-18b-3pダウンレギュレーションは、PEラットにおけるhucMSC-Exosの胎仔と胎盤重量への役割を打ち消しました（図5c, d）。

ELISAで血清炎症因子を検出しました。PEラットでTNF-α、IL-1β、IL-6含量が著しく増加しました。エクソソーム処理でPEラット血清のTNF-α、IL-1β、IL-6含量が減少し、miR-18b-3p阻害エクソソーム注射で増強されました（図5e）。

エクソソームがPEラット胎盤組織の病理学的変化を改善しアポトーシスを抑制

正常ラットでは、胎盤絨毛が豊富な血管を持ち明確な構造で、シンキシオトロホブラストが主要トロホブラストであり、細胞性トロホブラストは少数でした。PEラットとhucMSC-Exos-miR-18b-3p-antagomir処理PEラットでは、胎盤絨毛数が減少し、構造が不明瞭で萎縮し、一部の絨毛がフィブリノイド壊死を示し、シンキシオトロホブラスト結節数が増加し、ほとんどの絨毛が未熟でした。hucMSC-ExosまたはhucMSC-Exos-antagomir NC処理PEラットでは、PEラットとhucMSC-Exos-miR-18b-3p antagomir処理PEラットと比較して病理学的変化が改善されました（図6a）。

Exosomes alleviate pathological change and decrease apoptotic cells of placenta tissues in PE rats. a HE staining was utilized to test pathological features of placenta tissues in PE rats after exosome treatment. b TUNEL staining was implemented to determine apoptotic cells of placenta tissues in PE rats after exosome treatment. c Cell apoptosis rate was detected by TUNEL staining. n = 10, *p < 0.05 versus the normal group. #p < 0.05 versus the PE group. $p < 0.05 versus the PE + Exos-antagomir NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey's test

TUNEL染色では、正常ラットで少数のアポトーシス細胞が観察されました。PEラットでアポトーシス細胞が増加し、miR-18b-3p減少がhucMSC-ExosのPEラット胎盤組織アポトーシス細胞数への影響を逆転させました（図6b, c）。

考察

PEは、蛋白尿と高血圧またはその他の有害状態を特徴とする多系統妊娠障害で、広範な母体内皮機能不全と関連しています。hucMSC-Exoが、胎盤組織での細胞アポトーシス抑制と血管新生促進を用量依存的に介して、PEラットの胎盤組織形態を改善することが報告されています。ある研究では、miR-18b発現がPEでの細胞遊走、生存率、侵襲に影響することが報告されています。また、早期発症PEで母体LEP濃度上昇と胎盤LEP低メチル化が検証されています。本研究は、エクソソームとmiR-18b-3p標的LEPのPE発症への効果を探索するために設計されました。本研究の知見は、hucMSC由来エクソソームmiR-18b-3pがLEPを減少させることでPE進行を抑制することを明らかにしました。

本研究の知見に基づき、PEラット胎盤組織でmiR-18b-3pが減少し、LEPが上昇していました。本研究と同様に、PE胎盤組織でのmiR-18b mRNA発現が正常胎盤組織と比較して著しく抑制されています。また、悪性黒色腫組織でmiR-18b含量が対応する隣接非腫瘍組織と比較して劇的に減少していることが明らかにされています。別の研究では、早産PEで胎盤LEP発現がコントロールと比較して上昇していることが検証されています。さらに、子癇前症胎盤でLEP発現が明らかに上昇していることが示されています。これらの文献は、PEにおけるmiR-18b-3pとLEPの異常発現を探索するための理論的基盤を提供しました。さらに、バイオインフォマティクスソフトウェアでLEPがmiR-18b-3pによって標的とされることが予測され、本研究でデュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイでこの標的関係がさらに確認されました。ある研究では、LEPが早期発症PEで3つのmiRNA（miR-1301、miR-223、miR-224）すべての標的であることが報告されています。別の研究では、LEPが変形性関節症と関節リウマチでmiR-93発現を減少させることが示されています。しかし、ヒト疾患、特にPEにおけるmiR-18b-3pとLEPの結合はほとんど研究されておらず、これが本研究の新規性です。さらに、本研究から得られた結果として、エクソソームがPEラット胎盤組織でmiR-18b-3pを増加させ、LEPを減少させることが報告されました。以前、大腸癌血漿エクソソームでmiR-18b-5p発現が著しく上昇することが記録されていますが、PEにおけるhucMSC-ExosとmiR-18b-3p/LEPの関係は更なる研究が必要です。

また、本研究の知見では、回復したmiR-18b-3pがPEラットのSBPと24時間蛋白尿を減少させ、胎盤重量を増加させ、血清と胎盤組織のTNF-α、IL-1β、IL-6含量を低下させ、細胞アポトーシスを抑制しました。これらのデータは、miR-18b-3p上昇がPEの症状と病理学的変化の軽減に寄与することを示しています。miR-18bの安定的上方制御が、メラノーマ細胞生存率阻害、アポトーシス誘導、in vivo腫瘍増殖抑制などの効果的な腫瘍抑制活性を生み出すことが実証されています。本研究の別の結果として、hucMSC-ExosがPEラットのSBPと24時間蛋白尿を減少させ、胎盤重量を増加させ、血清と胎盤組織のTNF-α、IL-1β、IL-6含量を低下させ、細胞アポトーシスを抑制しました。現在の研究知見では、エクソソーム処理PEラットモデルで胎仔の数と質、胎盤の質が増加し、細胞アポトーシスが有意に減少することが明らかにされています。興味深いことに、胎児牛エクソソーム添加がマクロファージTNF-αとIL-6含量を減少させることが以前実証されています。ある研究では、精製エクソソームがリポ多糖/ニゲリシン刺激マクロファージでのIL-1β産生を抑制することが明らかにされています。さらに、NongらはヒトiPS細胞由来MSC産生エクソソーム投与後、TNF-αやIL-6などの炎症マーカーが劇的に減少することを示唆しています。ある論文では、後にPEを発症する女性群でSBPが著しく上昇することが発見されています。PE患者がSBPと拡張期血圧、蛋白尿と正の相関を示すことが表示されています。また、最近の研究では、PE女性で妊娠進行に伴って蛋白尿が増加することが証明されています。重要な発見として、PE群ラットが正常妊娠群と比較してTNF-α増加を示しました。別の研究では、PE女性で血清IL-6とIL-1βがコントロールと比較して明らかに上昇していることが検証されています。上記知見は、PE患者が通常高SBP、蛋白尿、炎症因子レベルを示すことを示唆しています。したがって、本研究の結果から、hucMSC由来エクソソームmiR-18b-3pがPEに治療効果を持つと推測できます。

結論

結論として、本研究はhucMSC由来エクソソームがmiR-18b-3pを上方制御し、LEPを標的としてPEラット胎盤組織の炎症因子含量と細胞アポトーシス率を減少させ、PE発症を抑制する証拠を提供しました。したがって、エクソソームmiR-18b-3pは、LEPを標的としてPE治療の潜在的候補となり得ます。本研究は、PE発達中のhucMSC由来エクソソームmiR-18b-3pによるLEP標的化の役割を初めて特定し、PE治療への新たな知見を提供しました。しかし、既知研究の限界により、今後の臨床試験で厳密な監視と適切な報告が必要です。

データと材料の入手可能性

該当なし。