グリオーマ標的療法：Gint4.T修飾DNA四面体によるドキソルビシン送達でPDGFRβ駆動細胞増殖を阻害

要旨

グリオーマは浸潤性増殖により最も致死的な原発性脳腫瘍の一つです。血液脳関門（BBB）と血液腫瘍関門（BTB）の存在、および薬物標的性の不足により、グリオーマ治療の効果は乏しいです。DNA四面体（TDN）は薬物送達キャリアとして大きな可能性を示し、グリオーマの新規治療戦略となり得ます。本研究では、TDNを用いてドキソルビシン（DOX）をグリオーマ療法に送達しました。腫瘍細胞上の血小板由来増殖因子受容体β（PDGFRβ）を認識するアプタマーGint4.Tを用いてTDNを修飾（Apt-TDN）し、標的薬物送達を実現しました。TDNはワンステップ合成で自己組立し、小サイズ（10 nm）と負電荷を示しました。胎児牛血清試験により薬物送達担体としての安定性が確認されました。Apt-TDNはU87MG細胞によって効果的に取り込まれました。DOXおよびDOX@TDN（DOX担持TDN）と比較して、DOX@Apt-TDN（Gint4.T修飾TDN担持DOX）はより高い初期アポトーシス率、より高い細胞周期停止、U87MG細胞に対するより高い細胞毒性を示しました。結論として、本所見はDOX@Apt-TDNがグリオーマ患者に対して有望な臨床応用を持つ新規療法を提供することを示唆しています。

はじめに

グリオーマは神経上皮由来の腫瘍であり、最も一般的な頭蓋内悪性腫瘍です。全脳腫瘍の約1/3がグリオーマであり、原発性悪性脳腫瘍の約4/5がグリオーマです[1-4]。現在、グリオーマに対する最も効果的な治療は手術切除と術後同時化学放射線療法ですが、残念ながら患者の予後は依然として不良です。従来のグリオーマ化学療法は、腫瘍標的性の低さ、血液脳関門（BBB）と血液腫瘍関門（BTB）による合併症、薬物標的性の不足により良好な結果を示しません。BBBは、ほぼすべての高分子（薬物や遺伝子を含む）が脳実質に送達され適切に機能することを阻害する最も重要な要因です。BBBを通過できない薬物は、関心領域で有効な治療濃度を達成するために十分高用量で投与される必要があります。しかし、過剰な薬物は重篤な全身副作用と非患部組織への望ましくない薬物蓄積を引き起こす可能性があります。さらに、既存の従来型抗グリオーマ薬は標的能力が不十分です[3, 4]。ナノ粒子は最も有望な薬物担持ツールとして浮上しています。サイズの利点により、ナノ粒子はBBBを通過し抗腫瘍効果を発揮できます。Kafaらは、ANGを標的とする化学修飾多層カーボンナノチューブ（f-MWNTs）を設計し、in vivoおよびin vitro実験でBBB通過能を確認しました[5]。しかし、これらのナノ材料は全身のさまざまな臓器に分布したり、中枢神経系（CNS）に進入して神経毒性を引き起こす可能性があります[6]。

DNAは、ワトソン-クリック塩基対形成により組立を精密に制御できるため、ナノ構造構築に理想的な材料です。これまでに、多数の二次元（2D）および三次元（3D）DNAナノ構造が設計・実証されています[8-10]。四面体DNAナノ構造（TDN）は、生体適合性、安定性、豊富な機能化修飾サイト、低免疫原性により大きな注目を集めています[11-13]。Turberfieldらはワンステップ合成法で高収率でDNA四面体ナノ構造を合成しました[14]。Walshらは、核酸プローブ含有DNA四面体がトランスフェクション試薬なしで哺乳類細胞に侵入できることを発見しました[15]。Leeらは、自己組立四面体ナノ粒子がin vivoで標的siRNA送達に使用できることを実証しました[16]。TDNは分子診断、分子送達、標的薬物療法において優れた応用展望を示し、乳がん[17]などさまざまな臓器の腫瘍研究にも広く用いられています。同様に、TDNは神経系疾患の研究にも使用されています。TianらはDNA四面体を基盤とし、アンジオペップ-2（ANG）で修飾してナノプローブANG-TDNを構築し、低密度リポ蛋白受容体関連蛋白1（LRP-1）を標的とした標的イメージングに成功しました[18]。研究ではANG-TDNがBBBを通過できることが示されています。Maらは四面体DNAナノ構造がトランスフェクション試薬なしで神経幹細胞（NSCs）に侵入し、神経幹細胞の移動、増殖、分化を促進することを示唆しました[19, 20]、神経組織修復と再生への大きな可能性を秘めています。したがって、グリオーマ療法へのTDN利用可能性とその標的能向上を調査しました。

血小板由来増殖因子受容体β（PDGFRβ）はチロシンキナーゼファミリーの重要なメンバーで、細胞増殖、遊走、血管新生に関与しています。複数の研究で、PDGFβが血管新生での役割から抗腫瘍療法の有望な標的であることが示されています[21, 22]。アプタマーは、指数関数的増幅による配位子の系統的進化（SELEX）法で作製される短い一本鎖DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドです。アプタマーは抗体と類似し、標的に対する高い親和性と特異性を持ちます[23]。その独自の特性により、アプタマーは化学療法剤、siRNA、薬物担持ナノ粒子の標的送達で重要な役割を果たします。Gint4.TはPDGFRβに特異的に結合するRNAアプタマーであり、PDGFRβ特異的拮抗薬でもあります[24]。Monacoらは、Gint4.Tアプタマーが血液脳関門（BBB）を通過し、特異的にPDGFRβを認識できることを示唆しました[25]。Gint4.T共役ポリマーナノ粒子（PNPs）は膠芽腫（GBM）細胞によって容易に取り込まれます。本研究では、Gint4.TアプタマーとTDNを組み合わせた新規薬物担持システムを報告します。Gint4.T修飾TDN（Apt-TDN）にDOXを担持させたDOX@Apt-TDNは、U87MG細胞に対する特異的な細胞取り込み増強と細胞毒性増強を示しました。

方法

材料

すべてのDNAオリゴヌクレオチドと2'-F-Py RNAオリゴヌクレオチドはSangon Biotech（上海、中国）から購入し、すべてのオリゴヌクレオチド配列は表1に記載。GelRed DNAゲル染色液はSangon Biotechから購入。胎児牛血清（FBS）とDulbecco変法Eagle培地（DMEM）はThermo Fisher（ニューヨーク、米国）から購入。ドキソルビシン（DOX）はMengbio Technology（重慶、中国）から購入。U87MG細胞はShanghai Life Academy of Sciences Cell Library（上海、中国）から購入。DAPIはZhongshan Golden Bridge Biotechnology（北京、中国）から購入。

DNAナノ構造の調製

DNA四面体を組立てるため（表1）、各オリゴヌクレオチド（S1、S2、S3、S4）2 μLを、TMバッファー（10 mM Tris-HCl、5 mM MgCl₂、pH = 8）42 μLに加えました。DNA溶液を95 ℃で5分間加熱し、その後Bio-Rad PCR装置（カリフォルニア、米国）を用いて4 ℃で2分間冷却しました[26, 27]。最終TDN濃度は2 μMです。TDN'はS1をS1'に置き換える以外同様に調製しました。Apt-TDNを合成するため、Gint4.TアプタマーをTDNと等モル比で添加し、37 ℃で60分間インキュベートしました。合成前に、アプタマーを短い変性-再生ステップ（85 ℃で5分、2分間で急速冷却、その後10分間で37 ℃に昇温）に曝露しました[25]。

アガロースゲル電気泳動

0.5× TEBバッファー中で3%アガロースゲルを100 V、30分間走行させました。電気泳動装置の温度を氷浴に装置を置くことで0 ℃に維持しました。電気泳動前にGelRedをアガロースゲルに添加し、DNA鎖を染色しました。プロセス完了後、Bio-Rad蛍光スキャナー（カリフォルニア、米国）でゲル画像を取得しました。

動的光散乱

Malvern Zetasizer ZS90（Malvern、英国）を用いてTDNの動的直径とゼータ電位を測定しました。TDN（100 nM）1 mLを動的光散乱（DLS）解析にかけました。

原子間力顕微鏡イメージング

TDNをTMバッファー（MgCl₂含有Tris-HClバッファー）で100 nMに希釈しました。各TDN試料10 μLを新しく剥離したマイカに添加し、10分間インキュベートしました。その後、原子間力顕微鏡（AFM）装置（Agilent 5500、米国）でACモードでイメージングしました。

調製TDNの薬物担持能測定

ドキソルビシンを脱イオン水に溶解し、500 μM貯蔵液を作製しました。異なる濃度（1〜20 μM）のドキソルビシンをTDN（100 nM）またはApt-TDN（100 nM）と混合し、室温（24〜26 ℃）で6時間反応させました。混合液を12,000×gで10分間遠心分離し、薬物担持TDNを得ました。上清50 μLを取り、PBSと1:1で混合しました。Varioskan LUXマイクロプレートリーダー（カリフォルニア、米国）を用い、ドキソルビシンの蛍光強度（λ_ex = 480 nm、λ_em = 590 nm）を測定して上清中のドキソルビシン量を決定しました[28]。ドキソルビシンの標準曲線と蛍光強度からTDN担持ドキソルビシン濃度を計算しました。また、ドキソルビシンとTDNを増加するモル比で混合しました。

TDNの血清中安定性（in vitro）

TDNを完全培地と混合し、37 ℃で0、2、4、6、8、10、12、24時間インキュベートしました。TDN溶液をFBSと1:1で混合し、37 ℃で1、3、5、7時間インキュベートしました。インキュベーション後、混合液を3%アガロースゲルで走行させました。

TDNの細胞毒性（in vitro）

TDNの細胞毒性を決定するため、U87MG細胞を1 × 10⁴ cells/wellの濃度で96ウェルプレートに播種しました。培地を除去し、0〜500 nM TDNを含む新鮮な培地を添加し、オーバーナイトインキュベーション後さらに24時間と48時間インキュベートしました。その後、各ウェルにCCK-8溶液10 μLを添加し、1時間インキュベートしました。マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定しました。

蛍光イメージング

蛍光顕微鏡（Olympus、東京、日本）を用いてDOXとTDNの細胞取り込みを調べました。U87MG細胞をカバーガラス上の24ウェルプレートに、10%熱不活性化胎児牛血清と1%ペニシリン・ストレプトマイシン含有培地で播種し、37 ℃、5% CO₂、湿潤雰囲気で少なくとも1日間培養し、細胞コンフルエンスが75%以上になるまで待ちました。インキュベーション後、培地を除去しました。100 nM Cy3標識TDNとCy3標識Apt-TDNを含む完全培地を添加し、3時間インキュベートしました。TDNとApt-TDNをCy3で標識し、ナノ粒子の細胞内取り込みを検出しました。DOXの細胞取り込みを評価するため、DOX（DOX 2 μM）、DOX@TDN（DOX 2 μM）、DOX@Apt-TDN（DOX 2 μM）をU87MG細胞に添加し、3時間インキュベートしました。3時間処理後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで20分間暗所で固定し、その後4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で5分間染色しました。細胞をPBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察しました。

フローサイトメトリー

合計1 × 10⁶ U87MG細胞を6ウェルプレートに植え付けました。オーバーナイトインキュベーション後、培地を除去し、100 nM Cy3-TDN、100 nM Cy3-Apt-TDN、または100 nM Cy3-Apt-TDN + 1 μMフリーAptを添加した培地で3時間インキュベートしました。その後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、フローサイトメトリーでCy3陽性細胞の割合を解析しました。

細胞周期とアポトーシス

DOX、DOX@TDN、またはDOX@Apt-TDNで24時間処理後、5 × 10⁵細胞を回収し、75%氷冷エタノールでオーバーナイト固定しました。その後、RNaseとヨウ化プロピジウムで37 ℃、暗所で30分間インキュベートしました。細胞周期をフローサイトメトリーで調べました。さらに、各処理後、Annexin V-FITC/DAPIで染色し、初期アポトーシスを調べました。

CCK-8アッセイ

細胞生存率を決定するため、U87MG細胞（5 × 10³）を100 μL培地で96ウェルプレートに播種し、5% CO₂、37 ℃でオーバーナイト培養しました。培地を除去し、DOX、DOX-TDN、またはDOX-Apt-TDNを含む新鮮な培地を添加しました。24時間インキュベーション後、CCK-8溶液10 μLを添加し、さらに1時間培養しました。マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定しました。

統計解析

本研究のすべての実験は3回繰り返し実施し、すべてのデータは平均値±標準偏差（mean ± SD）で示します。統計解析はSPSS 24.0プログラム（IBM、米国）で実施しました。有意差はStudentのt検定で決定し、P < 0.05を群間有意差としました。

結果

TDNとApt-TDNの合成と特性評価

TDNは4本のオリゴヌクレオチド（表1）から単一ステップ合成で自己組立されました（先行報告[18, 29]に基づく）。腫瘍標的アプタマーGint4.Tをワトソン-クリック塩基対形成によりTDNに修飾しました。DNA四面体は4つの面を持ち、各面は1本のオリゴヌクレオチドで形成されます。したがって、4本のオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズしてDNA四面体を形成します（図1a）。ゲル電気泳動解析でレーン4と5に単一の顕著なバンドが観測され、TDNとApt-TDNが成功裏に構築されたことを示唆します。Apt-TDNの移動度はTDNと比較して低下しており、Gint4.TアプタマーがTDNを成功裏に修飾したことを示しています。

a DNA四面体とGint4.T-TDNの合成。レーン1：S1；レーン2：S1+S2；レーン3：S1+S2+S3；レーン4：S1+S2+S3+S4（TDN）；レーン5：TDNとApt-tail（Gint4.T）混合；Apt-TDN。レーン1は核酸染料が一本鎖DNAを適切に染色できないため見えません。b AFM像ではTDNとApt-TDNの高さが約2 nm。c 動的光散乱（DLS）によるTDNとApt-TDNの粒子サイズとゼータ電位決定。TDNとApt-TDNの平均粒子サイズはそれぞれ10.10 nm（A）と13.54 nm（B）。TDNとApt-TDNの平均ゼータ電位はそれぞれ−5.69 mV（C）と−7.3 mV（D）。

TDNとApt-TDNのサイズはDLSとAFMで決定しました。TDNとApt-TDNの粒子サイズはそれぞれ10.1 nmと13.5 nmで、Gint4.Tリガンドの添加を反映しています（図1c（A）、（B））。動的直径には水分子が含まれるため、粒子は理論サイズより大きくなります。AFM像で決定されたTDNとApt-TDNの高さはともに約2 nm（図1b）で、アプタマー修飾が3D構造を変化させないことを示しています。TDNとApt-TDNの平均ゼータ電位はそれぞれ−5.69 mV（C）と−7.3 mV（D）でした（図1c（C）（D））。これらのパラメータに基づき、TDNとApt-TDNが成功裏に組立てられたと結論付けました。

TDNのin vitro安定性と細胞毒性

ゲル電気泳動解析では、TDNは37 ℃で完全培地中24時間インキュベートしても完全なままです（図2a（A））。さらに、胎児牛血清濃度を50%に増加させても、TDNは少なくとも7時間安定でした（図2a（B））、これは先行報告[18, 26]と一致します。ナノ構造の細胞毒性を決定するため、CCK-8アッセイでU87MG細胞の細胞生存率をさまざまな濃度のTDN処理後で評価しました。図2bに示すように、0〜500 nMのTDNで24時間および48時間共培養したU87MG細胞に有意な細胞毒性は観測されませんでした。したがって、DNAナノ粒子は薬物送達用の安定で生物学的に安全なキャリアとして使用できます。

a ゲル電気泳動でTDNが37 ℃完全培地中24時間安定（A）；胎児牛血清濃度50%で少なくとも7時間安定（B）。b U87MG細胞をさまざまな濃度（10〜500 nM）のTDNと24時間および48時間共培養。CCK-8アッセイでU87MG細胞の活性に影響なし、TDNの生物学的安全性を示す。

TDNとApt-TDNの薬物担持能

ドキソルビシンはDNA二重鎖に挿入可能な広範囲化学療法薬です。標準ドキソルビシン曲線を作成（図3a）し、ドキソルビシンのTDNへの挿入を調べました。TDNとApt-TDNへの挿入ドキソルビシン量は、ドキソルビシン濃度増加に伴い徐々に増加しました。ドキソルビシン濃度14 μMで、TDNとApt-TDNへの挿入ドキソルビシン濃度がそれぞれ5.5 μMと6.0 μMでピークに達し、その後プラトーしました（図3b）、DNA鎖が完全に占有されたことを示します。同時に、ドキソルビシンとTDNを増加するモル比で混合しました。ドキソルビシンの蛍光スペクトルを走査し解析しました。図3cに示すように、ドキソルビシンの蛍光スペクトルはモル比0.05で消光されました。これらの所見に基づき、単一TDNには約55分子のドキソルビシンが含まれ、単一Apt-TDNには約60分子のDOXが含まれると結論付けました。

a PBSバッファー中のDOX濃度標準曲線；λex = 480 nm、λem = 590 nm。TDNとApt-TDNのDOX担持量。b DOXがTDNとApt-TDNの二本鎖DNAに挿入。DOX濃度14 μMで挿入DOX濃度がTDNとApt-TDNでそれぞれ5.5 μMと6.0 μMでピーク、単一DNA四面体が55 DOX分子、単一アプタマー修飾DNA四面体が60 DOX分子を担持。c 上清中DOX蛍光スペクトル。DOXをTDNと増加モル比（上から0、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05）で混合。モル比1:20で蛍光消光。

Apt-TDNの標的細胞取り込み

DNAは負電荷を帯びた高分子であり、負電荷を帯びた細胞膜への侵入を困難にします。通常、個々のDNA分子はトランスフェクション試薬の助けを借りて細胞に入ります。ここでは、TDNとApt-TDNをCy3で標識し、ナノ粒子の細胞内取り込みをモニターしました。U87MG細胞と3時間インキュベート後、細胞質に赤色Cy3蛍光信号が現れ、TDNがトランスフェクション試薬なしで細胞膜に結合し細胞内に取り込まれたことを示しました（図4a）。Apt-TDNはより高い赤色蛍光を示し、Gint4.Tアプタマーの存在がU87MG細胞によるDNA四面体取り込みを有意に増加させることを示唆します。しかし、フリーアプタマーを添加すると、Cy3蛍光はTDN単独のレベルまで低下しました。フリーアプタマーによる競合阻害により、TDN上のアプタマーがTDN取り込みを促進できなかったと推測されます。この競合阻害に基づき、Apt-TDNがU87MG細胞を標的できることを証明しました。フローサイトメトリーでも、Apt-TDN群のCy3陽性U87MG細胞割合がTDN群より高いことがさらに証明されました。フリーAptはApt-TDN群のCy3陽性U87MG細胞割合を低下させました（図4b）。

a U87MG細胞によるTDNとApt-TDN（TDN-Gint4.T）取り込み。TDNはトランスフェクション試薬なしで直接U87MG細胞に入り、アプタマーGint4.Tと連結したApt-TDNの取り込みは有意に増加し、フリーApt（Gint4.T）により競合阻害される。アプタマーGint4.Tが細胞標的化に重要な役割を果たすことを示す。スケールバーは50 μm。b 3時間インキュベーション後のTDN、Apt-TDN、Apt-TDN+Aptの細胞内取り込みを示すフローサイトメトリー曲線。

DOX@TDNとDOX@Apt-TDNの細胞取り込み

ドキソルビシンの特性蛍光スペクトルを用いて薬物取り込み効率を評価しました。3時間処理後、細胞内ドキソルビシンを蛍光顕微鏡でイメージングしました（図5a）。フリー ドキソルビシンはU87MG細胞に入り核に局在しました。DOX@TDN添加でフリー ドキソルビシンより蛍光が高くなりました。この結果はDNAナノ粒子がドキソルビシンの細胞取り込みを向上させることを示唆します。DOX@Apt-TDN添加では、DOX@TDN添加細胞よりも核内赤色信号がさらに高くなりました。細胞内DOX取り込みの半定量解析により、Apt-TDNが単独薬物と比較して2倍以上の細胞内DOX取り込み増加を促進することがさらに確認されました。これはGin4.Tの受容体特異的結合により、より多くのナノ粒子が細胞内に入れるためと推測されます。リソソームでの消化後、ドキソルビシンは細胞質に放出され、さらに核で機能します。

a DOX、DOX@TDN、DOX@Apt-TDNの細胞取り込み。アプタマーGint4.T修飾により、Apt-TDNはTDNより多くのドキソルビシンをU87MG細胞に送達可能。また、TDNは薬物単独より多くの薬物を細胞に運搬可能。スケールバーは50 μm。b PBS、DOX、DOX@TDN、DOX@Apt-TDN処理時のドキソルビシン蛍光強度半定量解析（ブランク比：*p < 0.05、**p < 0.01）

DOX、DOX@TDN、DOX@Apt-TDNの細胞毒性

細胞毒性試験では、U87MG細胞3群を異なる濃度のドキソルビシンで処理しました（図6a）。DOX処理のIC₅₀値は13.39 μM、DOX@TDN処理で7.826 μM、DOX@Apt-TDN処理で4.205 μMでした。3処理のうち、DOX@Apt-TDNが24時間で最も高い細胞毒性を示し、Apt-TDNのU87MG細胞に対する特異性を示しました。24時間後、DOX、DOX@TDN、DOX@Apt-TDN群の細胞を回収し初期アポトーシスを調べました。データはDOX@Apt-TDN群の初期アポトーシス率が他の2群より高いことを示しました（図6b）。さらに、DOX-Apt-TDN群ではG0/G1期細胞割合がDOX群とDOX-TDN群と比較して増加（p < 0.01）、S期細胞比率が減少（p < 0.01）しました（図6c）。G2期細胞割合は変化しませんでした（データ未示）。

a さまざまな濃度でのDOX、DOX@TDN、DOX@Apt-TDNの細胞毒性。U87MG細胞の阻害率はDOX濃度増加とともに有意に増加したが、DOX@TDNとDOX@Apt-TDN群はDOX群と比較して有意に細胞毒性増加を示した。DOX@Apt-TDN群の細胞阻害率はDOX@TDN群よりも有意に高かった（DOX比：**p < 0.05；DOX比：***p < 0.01；DOX@Apt-TDN比：#p < 0.05）。b PBS、DOX、DOX@TDN、DOX@Apt-TDNで24時間インキュベーション後のU87MG細胞アポトーシス。c PBS、DOX、DOX@TDN、DOX@Apt-TDNで24時間インキュベーション後のU87MG細胞周期フローサイトメトリーヒストグラム（対照比：**p < 0.05；対照比：***p < 0.01；DOX@Apt-TDN比：#p < 0.01）

考察

in vitroまたはin vivo実験を問わず、薬物とそのキャリアの安定性を決定する必要があります。TDN組立後、まずin vitroで安定性を決定しました。本研究では、DNAナノ粒子の3D構造が酵素結合を阻害することで血清中の安定性を向上させることを示しました。関連ナノ構造の生物学的安全性は応用における最重要要件です。さまざまな濃度のTDNで24時間または48時間共培養したU87MG細胞に有意な細胞毒性は観測されませんでした。本研究で使用したDNA配列のいずれも遺伝情報をコードしておらず、細胞毒性試験で副作用は報告されていません。したがって、TDNは安全で安定な薬物キャリアとして機能できます。

アプタマー修飾ナノ構造の標的効率は、がん細胞への選択的薬物送達に不可欠です。抗体とは異なり、アプタマーは化学的に安定、安価、大量生産可能です。さらに、他の材料とは異なり、アプタマーは塩基相補の原理でDNA四面体に容易に結合できます。したがって、アプタマーとDNA四面体の組み合わせは、標的薬物送達と次世代治療の基盤を築きます。本結果は、TDNがトランスフェクション試薬なしで細胞に入れることを示し、WalshらとMaらの結果[15, 19]と類似しています。TDNと比較して、Apt-TDNのU87MG細胞への取り込みは有意に増加しました。フリーアプタマー添加後、この増加は消失しました。この結果はGint4.TがPDGFRβ特異的拮抗薬であることを示唆します[25]。本研究は、グリオーマ細胞表面にPDGFRβが高発現しているため、Gint4.TアプタマーがU87MG細胞を標的できることを実証しました。Camoraniら[24]も、Gint4.TアプタマーがPDGFRβの細胞外ドメインと特異的に相互作用することで腫瘍細胞を標的できることを示しています。Gint4.Tアプタマー標的化の利点はin vitro研究である程度実証されましたが、更なるin vivo試験でこれらの所見を確認する必要があります。本研究はまた、DOX@Apt-TDNがDOXやDOX@TDNより細胞毒性が高いことも確認しました。これは2つの要因に起因すると考えられます。第一に、Gint4.TアプタマーがPDGFR細胞外ドメインに特異的に結合し、腫瘍細胞増殖をブロックし腫瘍細胞成長を阻害します[24]。これは実験結果と一致します。対照群と比較して、DOX、DOX@TDN、DOX@Apt-TDN処理後のU87MG細胞周期変化はG0/G1期腫瘍細胞で有意に増加し、S期細胞で減少し、腫瘍細胞をG0/G1期でブロックしました。これはU87MG細胞の細胞周期を阻害し増殖を抑制できることを示します。DOX群とDOX@TDN群と比較して、DOX@Apt-TDN群はU87MG細胞増殖阻害能が有意に強かったです。さらに、Gint4.Tが特異的に腫瘍細胞に結合し、DOX@Apt-TDN複合体の細胞標的化を強化します。したがって、薬物標的効率を向上させ、抗腫瘍薬の全身投与量を減らし、全身副作用を防止できます。

結論

Gint4.T修飾により、グリオーマ細胞で大量発現するPDGFRβを標的とすることで、グリオーマ治療におけるTDNの特異性と効率が向上しました。さらに、Apt-TDNに担持させることでDOXの抗グリオーマ効果を有意に促進できました。したがって、DOX@Apt-TDNは患者に対するグリオーマの有望な治療戦略となり得ます。本研究の欠点はin vitro検証のみであることです。今後、動物モデルでさらに検証します。

データと材料の入手可能性

関連データは記事内に含まれています。

略語

BBB:

血液脳関門

BTB:

血液腫瘍関門

TDN:

四面体DNAナノ構造/DNA四面体

DOX:

ドキソルビシン

PDGFRβ:

血小板由来増殖因子受容体β

Apt-TDN:

Gint4.T修飾TDN

DOX@TDN:

DOX担持TDN

DOX@Apt-TDN:

Gint4.T修飾TDN担持DOX

CNS:

中枢神経系

ANG:

アンジオペップ-2

LRP-1:

低密度リポ蛋白受容体関連蛋白1

SELEX:

指数関数的増幅

PNPs:

ポリマーナノ粒子

GBM:

膠芽腫

FBS:

胎児牛血清

DMEM:

Dulbecco変法Eagle培地

DLS:

動的光散乱

AFM:

原子間力顕微鏡

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

Cy3:

スルホ-シアニン3

DAPI:

4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール