ナノ粒子/薬物相互作用によるマウスの金ナノ粒子の毒性は急性腎障害を誘発する

はじめに

ナノテクノロジーは21世紀においてますます重要な役割を果たしており、ナノ材料はナノテクノロジーの進歩の根底にあります。ナノ粒子の製造における最近の開発は、世界中で革新的なナノ材料の使用を支援してきました[1、2]。ナノ材料の直径は100nm以下であり、例としては、金、銀、シリカ、白金、二酸化チタンのナノ粒子、フラーレン、カーボンナノチューブなどがあります[3、4]。これらの材料は、電子ストレージ技術、遺伝子/再生医療、および電子デバイスに応用できる可能性があり、21世紀の新産業の基盤となっています[5]。しかし、PM2.5などのナノ粒子は、深刻な環境汚染、喘息などの呼吸器疾患、および虚血性心疾患を引き起こします[6]。さらに、自動車から放出されるディーゼル粒子は、脳や生殖器官に侵入することで生物学的影響を与える可能性があり[7]、アスベストなどの繊維状微粒子は中皮腫を誘発し、カーボンナノチューブなどの工業用繊維状ナノ材料は人間の健康に悪影響を与える可能性があります[8、9]。したがって、ナノ粒子の生物学的効果に関しては多くの未知数が残っています。

金（Au）は、イオン化傾向が低く、安定性が高く、古くから装飾用の貴金属として使用されてきました。最近開発された金ナノ粒子は、その特徴的な光学特性[10、11]により、医療およびエンジニアリングアプリケーションで広く使用されており、その優れた光電子特性により、有機太陽電池、センサープローブ、および導電性材料での使用が実現しています[12、13]。 。金ナノ粒子は、化学工業でアクリル樹脂合成の触媒として使用されています。また、白金ナノ粒子と比較して、COを酸化するための優れた低温触媒活性を示し、排気ガス精製触媒として使用されます。金ナノ粒子のさらなる応用が将来期待されていますが、金ナノ粒子の毒性とそれらの薬物との潜在的な相互作用に関する研究はほとんどありません。

研究者がナノ粒子の安全性、薬理学、および薬物動態を探求するにつれて、ナノテクノロジーの分野は拡大しています。シリカナノ粒子は細胞毒性、肝毒性、および胎盤損傷を引き起こすことが示されており[14、15]、カーボンナノチューブは肺中皮腫を誘発する可能性があります[16]。ただし、ナノ粒子と薬物間の相互作用から生じる薬理学的効果についてはほとんど知られていません。この研究では、哺乳類における安全性を明らかにするために、マウスにおける直径10、50、および100 nmの金粒子（それぞれGnP10、GnP50、およびGnP100）の毒性を調査しました。さらに、パラコート（PQ、よく知られているヘパトキシンおよび腎毒性）[17]、シスプラチン（CDDP、広く使用されている抗腫瘍剤）[18、19]、および5-アミノサリチル酸の毒性に対するこれらのナノ粒子の影響を調べました。酸（5-ASA、一般的な抗炎症薬）[20]。

結果と考察

まず、ゼータサイザーを使用して金ナノ粒子の粒子サイズを測定し、次に透過型電子顕微鏡を使用して粒子を観察しました（図1a、b、c）。 GnP10、GnP50、およびGnP100ナノ粒子の平均直径は、それぞれ15.7±7.0、53.3±14.2、および97.0±27.1 nmでした（補足図1）。さらに、金ナノ粒子は、電子顕微鏡で測定すると凝集しますが、マウスに投与すると凝集しません。また、ICP-MSで金イオン濃度を測定しましたが、イオンは検出されませんでした（データ未掲載）。金ナノ粒子の表面は、水に対するナノ粒子の親和性を高めるためにクエン酸で修飾されましたが、この修飾は他の機能を示しませんでした。

金ナノ粒子の超微細構造。 GnP10の電子顕微鏡写真（ a ）、GnP50（ b ）、およびGnP100（ c ）ナノ粒子

尾静脈からマウスに最大4mg / kgの用量を投与することにより、GnPが肝毒性および腎毒性を示すかどうかを調べた。金ナノ粒子のみを投与した場合、肝毒性または腎毒性は観察されませんでした（図2）。 GnP10、50、および100のみを投与したマウスのALTおよびAST値（図2a、b）は、BUNおよびCr値と同様に、対照値と同様でした。 GnPをマウスに単回投与しても、肝臓や腎臓の損傷、心臓、肺、脾臓の損傷は誘発されませんでした（補足図2）。これは、金ナノ粒子をマウスに単独で投与した場合に無毒であることを示しています。

シスプラチン誘発毒性に対する金ナノ粒子の効果。マウスにシスプラチン（CDDP）を0（白棒）または100μmol/ kg（黒棒）で腹腔内注射し、ビヒクルまたは金ナノ粒子（4 mg / kg）を静脈内注射しました。注射後24時間で、肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼの血清レベル（ALT;パネル a ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST;パネル b ）、および血中尿素窒素の血漿レベル（BUN;パネル c ）、およびクレアチニン（Cr;パネル d ）は、市販のキットを使用して決定されました（「生化学的分析」のセクションを参照）。データは、平均±平均の標準誤差（SEM; n ）として表されます。 =4）。大きな違い（* P <0.05、** P <0.01）ビヒクル治療群とCDDP治療群の間

肝臓と腎臓の損傷は、シリカナノ粒子、ナノクレイ、またはポリスチレンナノ粒子と薬物または化学物質の同時投与によって誘発されることが報告されています[14、21、22]。したがって、金ナノ粒子をPQ（肝臓-腎臓毒素）または薬物CDDPまたは5-ASA（肝臓腎毒性の悪影響を引き起こす）と同時投与しました。図2は、金ナノ粒子とCDDP間の相互作用の結果を示しています。 GnP10またはGnP50とCDDPの同時投与はALTを増加させ、肝障害を誘発し（図2a）、GnP10とCDDPの同時投与はBUNとCrを増加させ、腎障害を誘発しました（図2c、d）。次に、GnPと、肝臓や腎臓に損傷を与える広く使用されている抗炎症薬である5-ASAとの相互作用を調査しました。 GnP10またはGnP50とCDDPの同時投与は、ALTを増加させ、肝障害を誘発しましたが（図3a）、5-ASAとの同時投与は、BUNおよびCrを増加させ、腎障害を誘発しました（図3c、d）。次に、肝臓と腎臓の損傷を引き起こす広く使用されている農薬であるGnPとPQの相互作用を調査しました。 GnP10とPQの同時投与は、BUNおよびCrレベルを増加させ、腎障害を誘発しましたが（図4c、d）、肝臓障害は誘発しませんでした（図4a、b）。テストされた最小の金粒子であるGnP10とCDDP、5-ASA、またはPQの同時投与は、この研究で観察された最高のALT、BUN、およびCr値をもたらしました。 GnP100の10倍大きい粒子は、CDDP、5-ASA、またはPQと同時投与した場合、肝臓または腎臓の損傷を引き起こしませんでした。これらの結果は、直径100 nm未満の粒子をCDDP、5-ASA、またはPQと同時投与すると、GnPが有毒であることを示しています。

5-アミノサリチル酸誘発毒性に対する金ナノ粒子の影響。マウスに、ビヒクルまたは金ナノ粒子（4 mg / kg）のIV注射とともに、0（白棒）または500 mg / kg（黒棒）の5-アミノサリチル酸（5-ASA）を腹腔内注射した。注射後24時間で、肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT; a ）の血清レベル ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST; B）、および血中尿素窒素の血漿レベル（BUN; c ）およびクレアチニン（Cr; d ）は、市販のキットを使用して決定されました（「生化学的分析」のセクションを参照）。データは、平均±平均の標準誤差（SEM; n ）として表されます。 =4）。大きな違い（* P <0.05、** P <0.01）ビヒクルおよび5-ASA治療群間

パラコート誘発毒性に対する金ナノ粒子の影響。マウスに、0（白棒）または50 mg / kg（黒棒）のパラコート（PQ）を腹腔内注射し、ビヒクルまたは金ナノ粒子（4 mg / kg）を静脈内注射しました。注射後24時間で、肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT; a ）の血清レベル ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST; b ）、および血中尿素窒素の血漿レベル（BUN; c ）およびクレアチニン（Cr; d ）は、市販のキットを使用して決定されました（「生化学的分析」のセクションを参照）。データは、平均±平均の標準誤差（SEM; n ）として表されます。 =4）。大きな違い（* P <0.05、** P <0.01）ビヒクル治療群とPQ治療群の間

GnP10とCDDP、5-ASA、またはPQの同時投与後の腎ヘマトキシリンおよびエオシン観察（図5）は、尿細管損傷を示し、急性腎障害の誘発を示唆しています。次に、血清中のIL-6とTNF-αを測定して、GnP10による急性腎障害の根本的な原因を調査しました。図6は、GnP10とCDDP、5-ASA、またはPQの同時投与の3時間後の血清IL-6レベルを示しています。 IL-6はGnP10単独群では検出されませんでしたが、GnP10をCDDP、5-ASA、またはPQと同時投与した場合にIL-6の増加が観察されました。 TNF-αはどのグループでも検出されませんでした（データは示していません）。これらの結果は、IL-6がGnP10およびCDDP、5-ASA、またはPQによって誘発される急性腎障害に関与していることを示唆しています。

金ナノ粒子で処理されたマウスの腎臓組織の組織学的分析。 GnP10のみのIV投与後24時間（ a ）、CDDPを使用したGnP10（ b ）、5-ASAを含むGnP10（ c ）、およびPQを使用したGnP10（ d ）、組織を収集し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。矢印は腎臓の損傷部位を示しています

ELISAで測定した血清中のIL-6レベル。マウスは、CDDP、5-ASA、またはPQを含むGnP10のIV注射を受けました。サイトカインレベルは投与の3時間後に測定されました。値は平均±標準誤差（SE; n =4）

金ナノ粒子と薬物の同時投与が副作用（肝臓と腎臓の損傷）に及ぼす影響を調査しました。最小の粒子サイズであるGnP10は、CDDP、5-ASA、またはPQとの同時投与時に腎臓および肝臓の損傷を誘発しました。また、GnP10をアセトアミノフェン、ストレプトマイシン、またはテトラサイクリンとマウスに同時投与したところ、肝臓や腎臓の損傷は観察されませんでした（データは示していません）。シリカナノ粒子は粒子サイズに応じて肝臓損傷を誘発し[23]、ポリスチレンナノ粒子は粒子サイズに応じて薬物との同時投与時に肝臓損傷を誘発する可能性があることを以前に報告しました[24]。 Xia etal。より小さな金ナノ粒子はinvitroでより遺伝子毒性があると報告されています[25]。まとめると、金のナノ粒子は、粒子サイズが小さくなると、薬物との相互作用により非常に毒性が高くなります。

Gnp10とシスプラチン、5-ASA、またはPQの同時投与は、IL-6レベルを増加させました（図6）。 IL-6は、GnP10単独投与（図6）またはCDDP、PQ、または5-ASA単独投与（データ未掲載）では上昇しませんでした。 IL-6は、肝臓[26]および急性腎[27、28]の損傷の誘発に関与していることが以前に報告されました。 Gnp10はIL-6を誘発し、IL-6は肝臓と腎臓の損傷を誘発すると考えられますが、根本的なメカニズムは不明なままです。バウザらIL-6が肝細胞に転写因子を誘導することにより肝障害を誘発することを報告している[29]。 IL-6によって誘発される肝臓と腎臓の損傷における細胞特異的転写因子の関与を理解するには、金ナノ粒子の細胞毒性の背後にあるメカニズムについてさらに実験する必要があります。

最近、ドラッグデリバリーシステムで使用される機能性生体材料として金ナノ粒子が注目されており[30]、金ナノ粒子を用いたがん治療の研究が活発に行われています。たとえば、Anselmo etal。 PEGでコーティングされたシリカ-金ナノ粒子は、光と熱溶解した固形腫瘍を吸収すると局所温度が上昇することを報告し[31]、金ナノ粒子が癌治療に有望な材料であることを示しています。しかし、抗がん剤であるシスプラチンと金ナノ粒子の相互作用が腎障害を引き起こすことを発見し（図2）、がん治療で金ナノ粒子を使用するには、薬剤と併用した場合の安全性を研究する必要があることを示唆しています。

結論

要約すると、Gnp10は、CDDP、PQ、または5-ASAとの同時投与時に腎障害を引き起こしました。 GnP50は5-ASAと同時投与した場合にのみ腎障害を引き起こしましたが、GnP100はそうではありませんでした。金ナノ粒子は腎臓の損傷を引き起こす可能性があり、この効果は化学物質や薬物との相互作用の結果として相乗的に悪化する可能性があることを実証しました。診断または治療用途に提案されたナノ粒子の毒物学的プロファイルを完全に解明するには、これらのデータに基づくさらなる研究が必要です。

材料と方法

資料

直径10、50、および100 nmのクエン酸リガンドでキャップされた金粒子の懸濁液は、NANOCOMPOSIX、INC。（San Diego、CA、USA）から入手しました。粒子のサイズ分布は、ゼータサイザー（シスメックス株式会社、神戸、日本）およびＴＥＭ ＪＥＯＬ ＪＥＭ－１０１１透過型電子顕微鏡を使用して分析された。平均直径は15.7±7.0、53.3±14.2、および87.0±27.1 nmでした（図1、補足図1）。水性懸濁液（1 mg / mL）を超音波処理により完全に分散させてから使用し、水で希釈しました。金ナノ粒子懸濁液中のイオン化金の存在をICP-MSで調べたところ、イオン化金は検出されませんでした。各懸濁液の同量を各実験のためにマウスに注射した。粒子の幾何学的サイズはTEMによって特徴づけられました。パラコート（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）、シスプラチン、および5-アミノサリチル酸（和光純薬工業、大阪、日本）を生理食塩水に溶解し、使用するまで-20°Cで保存しました。すべての試薬は研究グレードでした。

動物

8週齢のBALB / c雄マウスは、船橋農園株式会社（千葉県）から購入しました。動物は管理された環境（温度23±1.5°C;明るい12時間の明/暗サイクル）で維持され、標準的な齧歯動物の餌と水を自由に摂取できました。実験を開始する前に、マウスに順応させるために1週間与えた。実験プロトコルは、日本実験動物科学会の動物実験ガイドラインから編集された帝京平成大学大学院薬学研究科の倫理ガイドラインに準拠しています。

生化学的分析

血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、血中尿素窒素（BUN）、およびクレアチニン（Cr）は、市販のキット（Wako Pure Chemical Industries）を製造元のプロトコルに従って使用して測定しました。簡単に説明すると、収集した血清（10 mL）を1 mLのカラーA試薬（ウレアーゼを含む）と組み合わせ、37°C​​で15分間インキュベートしました。 1 mLのカラーB試薬を添加した後、サンプルを37°Cで10分間インキュベートしました。吸光度は570nmの波長で測定されました。インターロイキン（IL）-6およびTNF-αは、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）キット（BioSource International、CA、USA）を使用して分析しました。すべての分析は、製造元の指示に厳密に従って実行されました。

組織学的分析

投与後24時間で動物を屠殺し、肝臓を摘出し、4％パラホルムアルデヒドで固定した。処理と切片化に続いて、組織学的観察のために薄い組織切片をヘマトキシリンとエオシンで染色しました。

統計分析

統計分析は、Statcelアドインフォームの3rd Excel Software（EMS Publication Co.、Ltd。、埼玉県、日本）を使用して実行されました。すべてのデータは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表されます。対照群と実験群の間の有意差は、ダネット検定を使用して決定されました。 P 0.05未満の値は有意であると見なされました。

データと資料の可用性

該当なし。

略語

ALT：

アラニンアミノトランスフェラーゼ

AST：

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ

BUN：

血中尿素窒素

PQ：

パラコート

Cr：

クレアチニン