標的化学療法：アプタマー機能化メソポーラスシリカナノ粒子がドキソルビシンを白血病細胞へ直接送達

概要

抗がん剤を効率的かつ選択的に腫瘍細胞へ送達し治療効率向上させることは依然困難。本研究では、アプタマー修飾メソポーラスシリカナノ粒子ベース効率的細胞標的薬物送達システム（Sgc8-MSN/Dox）構築。アプタマーSgc8の腫瘍標的能利用しドキソルビシン（Dox）を白血病細胞へ標的送達、治療効率向上と毒性低減図る。本研究でSgc8-MSN/Dox持続的Dox放出示し、CCRF-CEMヒト急性Tリンパ芽球白血病細胞標的化し効率的殺傷、がん治療への可能性示唆。

はじめに

急性リンパ芽球性白血病（ALL）は人類健康深刻脅かす異質性悪性腫瘍[1–3]。米国で年間約6000例ALL診断、特に小児・思春期多発。20歳未満癌死因首位、小児最頻発癌[4]。

化学放射線療法と骨髄造血幹細胞移植がALL標準治療。放射線療法は全身副作用大きく最適照射部位不明確。骨髄移植はコスト、患者年齢、ドナー骨髄不足で往々実施困難。化学療法は遠隔巣排除で再発予防可能だが、循環経由で腫瘍到達する抗腫瘍薬はごく一部。薬物生体利用率低く、正常細胞vs病変細胞選択性乏しく、重篤副作用と薬剤耐性リスク増大。

ナノ薬物送達システムは抗腫瘍薬単体より遥か効果的・標的的送達可能、腫瘍微小環境特異条件トリガー薬物放出含む[5,6]。中でもメソポーラスシリカナノ粒子（MSNs）は巨大修飾可能表面、調整可能気孔容量（多様量・種類薬物搭載）、良好生体適合性で注目[7,8]。表面官能基修飾で特定条件下薬物放出MSNs作製、標的分子修飾で所望組織へ選択的薬物送達MSNs実現[9,10]。

MSNs相性良い標的分子一種アプタマー、標的特異的強力結合「化学抗体」機能単鎖DNA/RNA。抗体より小型・調製修飾容易、組織浸透性高く、低毒性・低免疫原性。故腫瘍検出と標的化学療法広く利用[11–13]。SELEX法でCEMヒト急性Tリンパ芽球白血病細胞特異的結合アプタマーSgc8同定[14,15]。Sgc8はCEM細胞膜上プロテインチロシンキナーゼ-7（PTK-7）認識。Sgc8を抗腫瘍薬・特定ナノ材料添加で白血病細胞標的化・殺傷改善[16,17]。

我々はSgc8アプタマー修飾蛍光シリカナノ粒子システム（Sgc8-FSNPs）設計、高感度・特異性白血病細胞検出実証、白血病診断のみならず抗白血病薬標的送達にも有用[18]。本研究ではドキソルビシン（Dox）をMSNs封入、Sgc8装飾（図1）。得られたSgc8-MSN/Dox良好形態・サイズで薬物送達適し、培養中白血病細胞選択的取り込み、腫瘍細胞効率的殺傷達成。本研究目的：アプタマー修飾メソポーラスシリカナノ粒子が腫瘍標的診断のみでなく薬物搭載で腫瘍殺傷可能実証、腫瘍標的セラノスティクスへの指針提供。

Sgc8アプタマー修飾メソポーラスシリカナノ粒子による効率的細胞標的薬物送達システム模式図。CEM細胞、CCRF-CEMヒト急性Tリンパ芽球白血病細胞；Dox、ドキソルビシン；MSN、修飾シリカナノ粒子；PTK-7、プロテインチロシンキナーゼ-7

実験材料と方法

試薬と材料

塩酸ドキソルビシン（Dox）北京華峰聯合技術（北京、中国）購入。分析級テトラエチルオルソシリケート（TEOS）と3-トリエトキシシリルプロピルアミン（APTES）上海化学試薬第一工場（上海、中国）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB、99%純度）上海吉智生化技術（上海、中国）購入。他試薬分析級。カルボキシル修飾Sgc8アプタマー（5′-ATCTAACTGCCGCCGCGGGAAAATGTACGGTTAG(T)₁₀-COOH-3′）[16]上海生物工程（上海、中国）合成。

細胞株

中国科学院上海細胞バンク購入：ヒト急性Tリンパ芽球白血病細胞株CCRF-CEM、ラモスヒトバーキットリンパ腫B細胞株、L02ヒト正常肝細胞株、293Tヒト胎児腎細胞株。全細胞株37°C、5% CO₂、10%胎児牛血清（FBS、Hyclone）とペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco、Grand Island、NY、USA）添加DMEM培養。

Sgc8-MSN/Dox調製

MSNs調製[19]：CTAB 0.50 gを超純水240 mL溶解、2 M NaOH溶液1.75 mL添加、油浴80°C加熱。強攪拌下TEOS 2.50 mL滴下添加、2時間連続攪拌白色沈殿得るまで。遠心分離10,000 rpm 10分、上清除去、沈殿超純水と無水エタノール交互3回洗浄、真空オーブン60°C一晩乾燥でMSNs取得。

Sgc8-MSN/Dox調製：MSNs 0.2365 gを三口フラスクに絶対エタノール23.65 mL分散、APTES 710 µL滴下、24時間リフラックス。メタノール-HCl溶液（4:1）と脱イオン水交互3回洗浄、乾燥でMSNs-NH₂取得。室温でMSNs-NH₂材料10 mL遠心チューブにPBS適量分散、Dox（5 mg/mL）滴下添加、24時間攪拌。最後にカルボキシル修飾Sgc8アプタマー（100 nM/mL）添加、1時間攪拌、遠心分離、PBSで無色化まで洗浄、Sgc8-MSN/Dox取得。

Sgc8-MSN/Doxキャラクタリゼーション

ナノ粒子X線回折（XRD）Bruker D4ディフラクトメーター（ドイツ）測定。N₂吸着-脱離等温線TriStar 3000比表面積・気孔径アナライザー（GA Inc.、USA）測定。BET比表面積BETプロット算出。気孔径分布BJH法吸着枝から推定。粒子サイズとゼータ電位Malvern Nano S動的光散乱アナライザー（UK）測定。各試料3回測定平均。粒子サイズ形態透過型電子顕微鏡（H-7650、東京、日本）100 kV加速電圧評価。同時Sgc8アプタマーMSN表面結合FT-IR分光法（Nicolet-5700、USA）評価。アプタマー修飾MSN/Dox効率検出 위해 Sgc8-MSN/Dox調製過程洗浄上清回収、260 nm紫外吸収値測定、標準曲線法で非結合アプタマー量決定。添加総量から非結合量差引でアプタマー修飾量算出。

Sgc8-MSN/DoxからのDox放出

Sgc8-MSN/Dox（10 mg）をpH 5.0または7.4緩衝液10 mL、37°C、100 rpm振盪溶解。予定時刻サンプル採取、5000 rpm 10分遠心、上清分光光度法でDox定量（Thermo Scientificマイクロプレートリーダー、81 Wyman Street、Waltham、USA、482 nm）[9]。

Sgc8-MSN/Dox標的能

CEMまたはRamos細胞（3×10⁶) PBS懸濁、15 mL遠心チューブ添加、Sgc8-MSN/DoxまたはMSN/Dox（アプタマー濃度200 nM）混合。37°C 20–30分インキュベーション、遠心分離回収、PBS 3回洗浄、4%パラホルムアルデヒド30分固定、PBS 3回洗浄。DAPI 1 mg/ml 5分染色、PBS 3回洗浄遠心。細胞ペレットPBS再懸濁、スライドガラス載せ蛍光共焦点顕微鏡（Nikon DS-Ri1、東京、日本）解析。

別実験：CEMとRamos細胞（3×10⁵、対数増殖期）50 µL PBS、45 µL結合緩衝液[PBS+5 mM MgCl₂、4.5 g/Lグルコース、1 mg/ml牛血清アルブミン（BSA）]、10 µL FBS[PBS+1 mg/ml BSA]含指定材料（アプタマー濃度200 nM）混合。暗所4°C 30分振盪。洗浄緩衝液洗浄、1000 rpm 5分遠心、さらに3回洗浄。最終的に500 µL洗浄緩衝液再懸濁、フローサイトメトリー（Beckman Coulter Epics X L、Beckman Coulter Inc.、Brea、CA、USA）解析。

MSNs細胞毒性

DoxなしアプタマーなしMSNs細胞毒性MTT法評価。CEM、Ramos、293T、L-02細胞（対数増殖期）96ウェルプレート（1.5×10⁴/ウェル）播種。MSNs（100 µL）各ウェル添加、5% CO₂インキュベーター37°C 24または48時間培養。MTT（20 µL）各ウェル添加、37°C 30分インキュベート、1500 rpm 10分遠心、培養上清廃棄。DMSO（200 µL）各ウェル添加、暗所10分振盪、570 nm光学密度（OD）自動マイクロプレートリーダー測定。各試料6反復、平均±SD表示。

Sgc8-MSN/Dox細胞殺傷

CEM、Ramos、293T、L-02細胞96ウェルプレート（1×10⁵細胞/ウェル）播種、遊離Dox、MSN/Dox、Sgc8-MSN/DoxをDox濃度1、5、10、15、20 µg/mLで24時間インキュベーション。Sgc8-MSN/Doxがアプタマー受容体通じCEM細胞標的殺傷確認ため、十分Sgc8アプタマーCEM細胞2時間事前インキュベート、その後sgc8-MSN/Dox（Dox濃度20 µg/ml）24時間共インキュベート。生存率「MSNs細胞毒性」節記載MTT法比較。

統計解析

Student's t検定と最小有意差検定付き一元配置分散分析で統計解析。GraphPad Prism 6.02（GraphPad Software、San Diego、CA、USA）使用。

結果と考察

Sgc8-MSN/Doxキャラクタリゼーション

XRDデータで合成ナノ粒子X領域典型的六方メソポア回折ピーク示す（図2a）、MSN構造確認。MSN比表面積、気孔径分布、メソポーラスパラメータ詳細検討ためN₂吸着-脱離試験実施。MSN N₂吸着-脱離等温線（図2b）IV型等温線特性示しメソポーラス特性確認。BETモデル比表面積1389 m²/g。BJH曲線で気孔径分布狭窄（図2bインセット）。気孔径5.23 nm、気孔容積2.51 cm³/g。巨大比表面積と気孔容積、豊富メソポアで強力薬物担持力、優秀薬物キャリア潜在性示唆。電子顕微鏡でSgc8-MSN/Dox良好分散性と均一サイズ、球状/楕円形確認（図3a）。PBS中MSN/Dox平均ゼータ電位−26.53 mV、Sgc8-MSN/Doxで−33.87 mV低下（図3b）、Sgc8アプタマー負電荷反映[20]。メソポーラスシリコン表面気孔チャネル観察。PBS中MSN/Dox平均水和粒子径98.35 nm、Sgc8アプタマー連結後Sgc8-MSN/Doxで103.24 nm増大（図3c,d）。Sgc8-MSN/Dox成功結合確認ためFT-IR分光解析実施。赤外スペクトル図3e。3400 cm⁻¹、1100 cm⁻¹、500 cm⁻¹シリカ特徴ピーク。~2400 cm⁻¹ CTABテンプレート剤ピーク。~1600 cm⁻¹ NH₂ピーク。~1700 cm⁻¹ MSNs載Doxクラスタ塩基C=O伸縮特性ピーク。新規1650 cm⁻¹ピーク、Sgc8とNH₂-MSN/Dox反応生成シッフ塩基（–C=N–）起因。これら証拠でSgc8-MSN/Dox薬物送達システム成功調製証明。アプタマー修飾Sgc8-MSN/Dox効率検出ため紫外分光光度計でアプタマー260 nm吸収度（OD）測定、ナノ粒子表面アプタマー修飾前後OD値変化ベースでアプタマー修飾効率算出。アプタマー溶液と上清UV-Visスペクトル図3e。計算でSgc8アプタマーSgc8-MSN/Dox修飾量約6.87 nmol mg⁻¹ Sgc8-MSN/Dox。

a XRDとb窒素吸着-脱離等温線MSN；（インセット）MSN気孔容積と気孔径分布プロット

ナノ材料キャラクタリゼーション。a Sgc8-MSN/Dox電子顕微鏡像。b ナノ粒子電位図。粒子径分布c MSN/Doxとd Sgc8-MSN/Dox。e ナノ材料FT-IRスペクトル：a MSN、b MSN/Dox、c Sgc8-MSN/Dox。f UV-Visスペクトルa Sgc8アプタマー溶液、b Sgc8-MSN/Dox調製過程洗浄上清

Sgc8-MSN/DoxインビトロDox放出

MSN/DoxとSgc8-MSN/Dox pH 7.4で薬物緩徐放出：96時間以内薬物50%超放出なし（図4）。MSNs内部チャネル全体薬物拡散故96時間持続緩徐放出支持示唆。pH 5.0で放出大幅加速、48時間60%、96時間>80%放出率到達。Sgc8-MSN/DoxとMSN/Dox放出曲線ほぼ同一、アプタマー連結ナノ粒子構造影響なし示唆。酸性pH高放出有用、腫瘍細胞弱酸性環境、Sgc8コートNPsエンドソーム内在化[15]。メソポーラスシリコン酸性環境薬物放出加速支持[21,22]。

Sgc8-MSN/DoxとMSN/DoxインビトロpH 5.0または7.4ドキソルビシン放出

Sgc8-MSN/Doxインビトロ白血病細胞標的化

標的細胞CEM Tリンパ芽球白血病細胞、非標的細胞Ramos Bリンパ腫細胞でナノ粒子取り込み検証。フローサイトメトリーベース非標的細胞MSN/DoxとSgc8-MSN/Dox同程度内在化、標的細胞アプタマーコートナノ粒子MSN/Dox比較大幅多内在化（図5a）。共焦点顕微鏡蛍光像でSgc8-MSN/Dox暴露CEM細胞内強いDox蛍光（赤）観察、同条件Ramos細胞内観察なし（図5b）。これら結果Sgc8アプタマー白血病細胞標的能確立反映[20]。Sgc8はCEM細胞表面PTK-7認識[18]、ナノ粒子表面リクルート、取り込み効率化[23]。Sgc8-MSN/DoxがPTK-7発現癌細胞原発・転移巣や循環中標的化可能性示唆、転移制御有用。他アプタマー他標的特異性MSNアプローチ拡張可能性[24,25]。

インビトロSgc8-MSN/Dox白血病細胞標的化aフローサイトメトリーとb蛍光顕微鏡解析。CCRF-CEMとRomas細胞MSN/DoxまたはSgc8-MSN/Doxインキュベート、DAPI（青）染色。Dox赤表示。スケールバー100 µm

MSNs細胞毒性

ナノ薬物送達システム生物安全性重要性[25]鑑み、空白MSNs CEM、Ramos、293T、L-02細胞毒性まず検証。全細胞株生存率100 µg/mL MSNs 48時間インキュベーション後も90%以上維持（図6）。MSNsほぼ無細胞毒性示唆。

インビトロMSNs細胞毒性。a CEM、b Ramos、c 293T、d L-02細胞指示濃度MSN処理、細胞生存率測定

次に標的腫瘍細胞（CEM）と非標的細胞（Ramos、293T、L-02）殺傷能Sgc8-MSN/Dox検証。細胞遊離Dox、MSN/Dox、Sgc8-MSN/Dox各濃度24時間インキュベート、MTT法生存率評価。標的CEM細胞対遊離Doxわずか高毒性、Sgc8-MSN/Dox同薬物濃度でMSN/Dox比有意高毒性（図7）。Ramos、293T、L-02対遊離Dox有意高毒性、MSN製剤Sgc8あり/なし同程度毒性。Sgc8-MSN/Doxがアプタマー受容体PTK-7通じCEM細胞標的殺傷確認ため、十分Sgc8アプタマーCEM細胞2時間事前インキュベート結合サイトブロック、その後Sgc8-MSN/Dox共インキュベート。MTT法で遊離アプタマーCEM細胞無毒性、十分Sgc8ブロック後Sgc8-MSN/Dox遊離Sgc8-MSN/Dox群比有意低毒性（図7e）。これら結果アプタマー標的薬物送達と標的細胞殺傷増強能力強調。標的化で非標的細胞薬物取り込み減少、低用量使用可能、両効果毒性副作用リスク低減[26]。

遊離DOX、MSN/Dox、Sgc8-MSN/Dox殺傷能a CEM細胞、b Ramos細胞、c 293T細胞、d L-02細胞。e CEM細胞殺傷能：遊離アプタマー、ブロック（CEM細胞十分Sgc8 2時間事前インキュベート後sgc8-MSN/Dox）、Sgc8-MSN/Dox

アプタマー薬物・各種マクロ分子/ナノキャリア腫瘍細胞送達ガイド分子、時にはアプタマー自体治療作用。例：AS1411アプタマーヌクレオリン特異的結合、ヌクレオリン腫瘍細胞発現・表面存在、細胞分化、生存、炎症、血管新生、腫瘍発達関与。AS1411アプタマーヌクレオリン結合で移植モデル（腎癌、肺癌、MX1乳癌、膵癌）増殖抑制誘導[27]。さらにAS1411アプタマー機能化ドキソルビシン載リポソーム（Apt-Dox-Lip）乳癌試験、大きな応用潜在性示唆[28]。アプタマー優秀特性で幅広臨床試験成功。初アプタマーFDA承認2005年[29]、以来ますます臨床試験到達。アプタマー抗腫瘍臨床試験適用：前立腺癌[30]、肺癌[31]、急性骨髄性白血病[32]等。アプタマー関連臨床試験従来療法スタイル変革新希望付与確実。

近年アプタマー様々ナノ材料結合腫瘍標的療法展開。アプタマー非凡分子認識標的能力明確。しかしアプタマー応用開発無視不能課題残存：ヌクレアーゼインビボアプタマー安定性影響、低分子アプタマー体内進入腎系迅速除去、インビボ実標的性能実現可能性等。アプタマーベース標的ナノ材料全潜在性活用ため、更インビボ試験と臨床関連実験が現在研究焦点。同時腫瘍セラノスティクス重要将来方向、更多機能生物機能材料設計調製が間違いなき発展トレンド。

結論

アプタマー修飾MSN送達システム構築、白血病細胞効率的標的化とDox取り込み促進実証。この標的化、MSNs酸性条件下緩徐優先的薬物放出能と相まって、送達システム腫瘍部位蓄積と持続的細胞殺傷助長可能。適切アプタマー選択でほぼ如何なる腫瘍細胞標的化可能。但Sgc8-MSN/Dox上述問題も無視不能、インビボ安定性標的性更研究必要。次段階で先行研究組合せ診断試薬と薬物両載セラノスティクス機能（標的診断と標的治療）付与予定。

略語

MSN:

メソポーラスシリカナノ粒子

Dox:

ドキソルビシン

Sgc8-MSN/Dox:

アプタマー修飾メソポーラスシリカ薬物送達システム

PTK-7:

プロテインチロシンキナーゼ-7

TEOS:

テトラエチルオルソシリケート

APTES:

3-トリエトキシシリルプロピルアミン

CTAB:

セチルトリメチルアンモニウムブロミド

CEM:

CCRF-CEM細胞

PBS:

リン酸緩衝生理食塩水