急速な止血のための肝臓へのエレクトロスピニングされた医療用接着剤繊維の電場修飾されたその場での正確な沈着

背景

肝切除は、肝臓のがんを治療する効果的な方法です[1]。しかし、この特別な部位には血管が豊富であるため、通常、肝切除では大量の出血が発生します[2]。適時に出血を止めないと、深刻な臓器不全につながる可能性があり、人命を脅かす可能性さえあります[3]。出血を止める現在の方法は、主に縫合や結紮などの機械的方法、電気焼灼などの熱的方法[4]、フィブリンシーラント[5、6]、ゼラチンマトリックス[7]、キトサンヒドロゲル接着剤[8]などの止血法剤の使用に焦点を当てています。 ]。もちろん、それらすべてには明らかな利点と制限があります。たとえば、出血を止めるには縫合が最も効果的な方法ですが、タイムリーで細心の注意を払う必要があります。そうでなければ、それは長期の虚血を引き起こします[9]。同様に、熱的方法は局所組織に損傷を与える可能性があり、容易に区別できない正常組織とは異常になる可能性があります[10]。さらに、止血に広く使用されているフィブリンシーラントは、ヒトの免疫応答に悪影響を及ぼしやすく、貯蔵寿命が短く、微生物の侵入を受けやすく、価格が高いなどの欠点もあります[11]。対照的に、e-spinningテクノロジーは、表面が不規則な場合でも、使用量の削減や創傷部位へのコーティングなどの特殊な機能により、止血に優れた可能性を示します[12、13]。しかし、止血のための既存の電子紡糸技術および装置には、克服すべきいくつかの問題がまだあります。同じ止血効果を実現し、手術後の組織癒着を引き起こす可能性があり、（3）都市の電力供給に依存するため、電力供給のない屋外および遠隔地での使用には適していません[15]。私たちのグループは最近、エアポンプブロワーを利用して繊維の配向堆積を可能にする気流支援電子紡糸技術を報告しましたが[12]、エアポンプに追加の電源が必要です。したがって、主に電気に依存しないが、急速な止血のために繊維の配向された堆積を達成することもできる携帯型の電子紡糸技術および装置が強く望まれている。

静電界に置かれた金属板は、静電相互作用によりその表面に誘導電荷を生成し、それが新しい電界を誘導して、元の静電界分布を変化させる可能性があります[16、17、18]。一方、e-spinningプロセスは、静電界中の帯電ジェットの不安定なホイップとスプリットを利用して、マイクロ/ナノファイバーを実現し、最終的には接地されたコレクターに堆積します[19、20]。帯電したジェットは静電界の分布に敏感であるため、通常、電圧を変えることでより細い繊維が得られます[21、22]。したがって、上記の原理に基づいて、e-スピニングプロセスに金属板を導入し、静電界の分布を変化させることによってフライングジェットの発散角を減少させることにより、より配向した堆積を生成することができます。さらに、止血用の厚膜を形成するためにクリニックでは通常大量の投与量が必要となるため、止血薬として臨床的に使用されているシアノアクリレート（CA）医療用接着剤[23]を使用します[24]。ただし、このフィルムは、CA医療用接着剤の厚さが厚いために剛性があります。それどころか、e-スピニング法によって生成された高分子繊維膜は、多くの場合、柔軟性があり、十分にコンパクトです[25]。したがって、急速な止血のために肝臓に正確に沈着するCA医療用接着剤をe-スピニングするために静電界修正法を使用することは非常に重要です。

本研究では、肝切除部位への医療用接着剤繊維の制御可能な正確な堆積を実現するために、電界を修正した電子紡糸技術を提案します。電子紡糸繊維の堆積範囲は、金属コーンのサイズを変更することによって調整可能です。この電界修正電子紡糸法は、医療用接着剤 N をその場で正確に堆積させるためにさらに使用されました。 -ラット肝臓の切除部位にオクチル-2-シアノアクリレート（NOCA）繊維を塗布し、10秒以内に急速な止血を実現します。術後の病理学的結果は、従来の気流支援グループと比較して、この電場修飾電子スピニンググループでは炎症反応と組織癒着が少ないことを示しています。この技術を当社が設計したハンドヘルドe-spinningデバイスと組み合わせると、その携帯性と正確な沈着特性により、救急医療、診療所、フィールドサバイバル、在宅医療で使用できます。

メソッド

資料

N で構成される急速医療用接着剤α-シアノアクリレート（CA） -オクチル-2-シアノアクリレートおよび医療グレードのポリメチルメタクリレート（PMMA、粘度を上げるための添加剤）は、Guangzhou Baiyun Medical Adhesive Co.、Ltd。から提供され、さらに精製することなく使用されました。抱水クロラールはアラジンから購入し、さらに麻酔をかけるために10％に希釈しました。

InVivo止血実験

ラット肝臓切除後の止血実験は、体重300〜350gの40匹の成体雄SDラットで実施されました。これらのラットは、insitu気流支援（ n ）のためにランダムに2つのグループに分けられました。 =20）および電場で修飾されたe-スピニング（ n =20）治療。すべてのラットは、手術前に0.7 mlの10％抱水クロラールを受け入れ、次に開腹術、ローブフリー、50％肝切除、続いてその場で電界を変更しました（電極側の長さ2.5 cm、電極角度60°、e -回転距離10cm、電圧10 kV）または気流支援（出口直径1.2 mm、電圧10 kV、流量120μlmin ^-1 、およびe-spinning距離10 cm）e-spinningNOCAファイバー。全体のプロセスは、各ラットで約20分かかりました。すべての操作手順は、国立動物実験大学規則および大学動物研究委員会管理規則に準拠していました。

血液検査と病理学的セクショニング

血液サンプルは、白血球（WBC）カウントの検出と肝機能検査のために、手術後3日目と5日目に心臓穿刺によって収集されました。ラットを安楽死させ、手術後7日目に葉を切除し、4％中性ホルマリン溶液で葉をさらに固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン（HE）で染色しました。

電界シミュレーション

有限要素解析法を使用して、電界分布をシミュレートしました。幾何学的モデルは、12 kVの電源、銅の円錐が取り付けられた銅の針、および空気中のアルミニウムの収集プレートで構成されています。針の長さ、円錐の直径、および受信距離のパラメータは、それぞれ3、5、および10cmに設定されました。

特性評価

SEMイメージングは​​、HitachiTM-1000走査型電子顕微鏡で実施しました。フーリエ変換赤外（FTIR）スペクトルは、繊維の分子間構造を分析するためにNicoletIn10分光計で測定されました。光学顕微鏡（オリンパスBX51）を使用して、堆積境界を見つけ、堆積領域を評価しました。 Casio Exilimカメラを使用して、invivo肝切除プロセスを記録しました。

結果と考察

電場-正確な堆積のための修正されたE-スピニング

図1および追加ファイル1：図S1は、電界を変更したe-spinning技術を備えた自家製のハンドヘルドe-spinningデバイスを示しています。高電圧コンバーターを備えた電源として、水銀を含まないアルカリAAAバッテリー（直径10 mm、高さ44 mm、LR03、福建南平、南平バッテリー、中国）を2つ使用し、大幅に発展する都市電力供給の制限を取り除きます。屋外でのポータブル使用。重要なのは、最近報告された電子紡糸装置[11]とは大きく異なり、紡糸針には調整可能なサイズの金属コーンが装備されていることです。金属コーンの導入は、元の電磁界分布を変化させ、e-スピニングプロセスに影響を与えます。感電などの安全上の問題は、通常、高電圧ではなく高電流によって引き起こされることに注意してください。この研究では、ハンドヘルドデバイスには、安全性を確保するために高電圧と低電流を維持するために使用されるコンバーターがあります。

肝切除止血のための電界修飾e-スピニングNOCAファイバーの概略図

図2aは、医療用接着剤からのNOCA繊維のSEM画像を示しています。 NOCA繊維の直径は約1〜3μmであり、これらの繊維は連続的な繊維形態を示します。図2bは、これらのNOCAファイバーのFTIRスペクトルを示しています。 714 cm ^-1 のピーク 、2761 cm ^-1 、および1732 cm ^-1 –CH ₂ の振動に対応します –、–C≡N、および–C =O。 3127 cm ^-1 のピーク =CH–に対応するものはほとんどなくなります。これは、e-スピニングプロセス中の重合プロセスによって、モノマー分子のほとんどのアルケニルC =C結合がポリマー鎖に変換されるためです。さらに、金属コーンのサイズと配向堆積との関係を調査します。図2cに示すように、針先とコレクターの間の距離が10 cmに固定されている場合、金属コーンのサイズが小さくなると、堆積領域の直径は小さくなります。この現象はおそらく、金属コーンのサイズが小さくなると静電界がより狭い範囲に拘束され[26、27]、したがって、e-スピニングのホイッププロセスがより制限され、堆積面積が小さくなるためです。 。さらに、e-スピニング距離と堆積面積の関係も調べました（図2d）。追加ファイル1：表S1は、e-スピニング距離を長くした場合の3つの異なるe-スピニング方法の堆積幅を示しています。コンクリート堆積は、堆積面積が電子紡糸距離の増加とともに増加することを発見しました。これは、従来の電子紡糸の結果と一致しています。しかしながら、従来の電子紡糸と比較して、金属コーンを用いた電界修飾電子紡糸は、より小さな堆積面積、すなわちより良い配向の堆積をもたらす。最近報告された気流支援e-スピニングと比較しても、この電界修飾e-スピニングはより良い配向の堆積を示します。図2c、dに示すように、e-spinningの距離と金属コーンの側面の長さを調整すると、電界を集中させ、より強い収束力をもたらすことができます。腹部の皮膚や筋肉などのより近い部分では、フライングジェットを引き付ける力が発生する場合がありますが、これら2つのパラメータを調整して、より強い収束力を生成し、引き付け力によるこの悪影響を減らすことができます。さらに、エアフローアシストe-spinningには、エアポンプへの追加の電源が必要であり、このフィールドで変更されたe-spiningはそれを取り除くことができ、より便利になります。

a SEM画像と b 電場支援電子紡糸装置によって得られたNOCA繊維のFTIRスペクトル。 c の関数としての堆積領域のサイズ 金属コーンの直径と d e-回転距離

正確な堆積のメカニズム分析

金属コーンを備えたこの電子紡糸装置がより小さな堆積面積をもたらすことができる理由を理解するために、それらの電界シミュレーションをさらに行った。図3は、金属コーンを備えた場合と備えていない場合のe-spinningモデルの電界分布を示しています。赤い矢印は電界線を表しており、その方向と長さはそれぞれこの時点での電界の方向と強さを表しています。従来のe-spinningは、金属コーンのないものであり（図3a）、電界で変更されたe-spinningは、金属コーンのあるものです（図3b）。図3に示すように、針から収集プレートに向かう方向に沿って電位（カラーバー）が大幅に低下するため、収集プレート上に正に帯電したファイバーを組み立てることができます。さらに興味深いことに、図3aとbを比較すると、図3bでは電界強度が強く、電界方向の発散角が小さいことが観察されました。これらの現象は、金属コーンの近くにあるとより明白になります。電界の変化に対するその効果は、凸レンズによる光への収束効果のように機能します。電界線は収束しているため、電界方向の発散角は小さくなります。また、この収束と電界の重ね合わせの原理により、同じ位置での電界強度も大きくなります。挿入図は、同じ領域から拡大して選択された代表的な電界線です。電界強度は4×10 ⁵ 図3bの挿入図のV / mは、3×10 ⁵ よりも大きい 図3aの挿入図のV / mは、金属コーンを追加した後、空間でより大きな電界強度が発生することを示しています。また、電界方向の発散角は、図3bの挿入図では6°であり、図3aの挿入図では20°よりも小さくなっています。これらの結果は、より小さな堆積面積をもたらす金属コーンを備えたこの電界修正電子紡糸は、より強い電界強度およびより小さな発散角に起因する可能性があり、それにより、より狭い空間を飛ぶ正電荷の繊維を収縮させ、それによって閉じ込めることを意味するより小さな領域への堆積。

a を装備したe-spinningモデルの電界分布 なしおよび b 金属コーン付き。挿入図は同じ領域の拡大画像であり、力線と垂直方向の間の角度を示しています

InVivoでの急速な止血と分析

図4a–cは、ラット肝切除における止血の主なプロセスを示しています。迅速で効果的な止血は、この電界修正e-spinning技術を使用して、NOCAファイバーによって10秒以内に達成されました。これは、気流支援e-spinningよりも高速です。この現象は、図2dで検証された気流支援e-spiningよりも電界修飾e-spiningのより適切な方向付けの堆積に起因する可能性があります。つまり、同じ量の医療用接着剤を創傷部位により正確に堆積させることができます。同じe-スピニング時間。実際、診療所で使用されるNOCA医療用接着剤は通常、噴霧方法を採用しますが[28,29,30]、沈着面積が比較的大きいため、深刻な組織癒着が発生し、縫合糸の除去などの術後手術を行うことが困難になります。二次的な損傷を引き起こすことさえあります。より良い配向の沈着は、より速い止血を可能にするだけでなく、組織の癒着を回避することもできます。図4dは、止血のために肝臓表面に沈着したNOCA繊維の断面SEM画像を示しています。これは、NOCA繊維が肝臓部分の表面にしっかりと付着し、10秒のe-spinning時間で厚さが約50μmのコンパクトな繊維膜を形成したことを示しています。この10秒間の短い電子回転時間の間、通常は疲労に起因する握手によって引き起こされる距離の変化は小さく、通常は1 cm以下であるため、堆積範囲の変動は小さくなります。さらに興味深いことに、肝臓部分の表面は滑らかではありませんが、形状が不規則です（図4c）が、NOCA繊維はこの不規則な表面に均一な厚さで沈着する可能性があり（図4d）、この電界が変化したe -スピニング技術は、臓器の一部の不規則な表面でも急速な止血に独自の利点があります。

insitu電場支援e-スピニングによるラット肝臓切除モデルの止血。 a 肝臓を解離させ、肝葉を露出させた。 b 葉は自由であり、肝臓の血流を一時的に遮断するために外科用縫合糸で固定された。 c 肝切除が行われ、NOCA医療用接着剤繊維が当社の電界支援電子紡糸装置を使用して創傷部位に沈着した。 d 止血のために肝臓表面に沈着したNOCA医療用接着剤繊維の断面SEM画像

WBCカウントテスト（図5a）を使用して、ラットの肝切除および止血によって引き起こされた術後感染症を評価しました。手術から5日後、WBCの数（ P 電場修飾電子紡糸群の<0.05）は、従来の噴霧群および気流支援群（ P ）よりも有意に低かった。 <0.01）。さらに、それは偽手術群（対照群）に近く、電界修飾電子紡糸群の5日後の急性炎症が正常な状態に落ち着いたことを示しています。それどころか、噴霧群と気流補助群のラットは、深刻な炎症反応とより遅い退行を示しています。

血液検査。 a WBC数。 b – d 肝機能酵素検査。 b アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）。 c アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）。 d グルタミルトランスアミナーゼ（GGT）

肝機能は、血清ALT（図5b）、AST（図5c）、およびGGT（図5d）の濃度によって評価されました。ここで、ALTおよびAST濃度は、肝細胞損傷の程度を敏感に反映することができます。高濃度のGGTは、肝炎、閉塞性黄疸、胆汁うっ滞、およびその他の症状を反映している可能性があります。図5b–dに示すように、5日間の操作後の電界修飾e-spinningグループの肝機能酵素レベルは、基本的に偽グループ（コントロールグループ）のレベルに近く、従来のグループよりも大幅に低かった。噴霧群と気流補助群は、電場修飾電子紡糸群と偽群のラットの生理学的状態が類似していたことを示しています。しかし、噴霧群と気流補助群のGGTは、手術後5日目でも高水準を維持していました（ P <0.001）、胆汁うっ滞や肝障害などの深刻な問題があることを示しています。

止血後の肝臓組織の病理学的生検をさらに行った。図6aとcは、それぞれ気流支援および電場修正e-spinningによる止血後の肝臓の病理切片であり、図6bとdはそれらの拡大画像です。気流支援e-スピニンググループと比較して、電界修飾e-スピニンググループの肝臓組織の境界は比較的明確で、カプセルが薄くなっています。これらの結果は、肝臓の再生能力が電界修飾群の方が優れていることを示しています。さらに、カプセル内で観察された炎症細胞が少なく、電界修飾法によって作製されたNOCA線維性膜が炎症反応を少なくすることができることを示しています。これらの結果は、電界修正法が気流支援法よりも配向性の高い沈着を示し、同じ止血効果を達成するために使用されるNOCA医療用接着剤の量を減らし、組織の癒着を減らし、それによって炎症を引き起こすという事実に起因する可能性があります。応答。さらに、図6a、bからもわかるように、医療用接着剤が肝臓組織から分離されました。これは、エアブローが原因である可能性があります。これは、エアフローアシスト電子スピニングを使用した場合の接着力が肝臓組織ほど強くないことを示しています。電場で修飾されたe-スピニング。

a で観察されたHE染色による組織病理学的検査 、 c 倍率×100および b 、 d 倍率×200。組織病理学的検査では、7日目に2つのグループの肝細胞に炎症反応と肝障害が見られます。 2つのグループは a 、 b 気流支援グループと c 、 d 電界修飾グループ（青い矢印：炎症細胞、赤い円：医療用接着剤、黒い矢印：充血ゾーンの厚さ）

結論

要約すると、我々は、繊維の制御可能な正確な堆積を実現するために、紡糸ノズルに取り付けられた金属コーンを用いた電界修正電子紡糸技術を提案する。電子紡糸繊維の堆積範囲は、金属コーンのサイズを変更することによって調整可能であり、そのメカニズムは、理論的シミュレーションによって検証された集束電界に起因します。この電界修正電子紡糸法をさらに使用して、医療用接着剤NOCA繊維をラット肝臓の切除部位に正確にその場で沈着させ、10秒以内に急速な止血を実現しました。術後の病理学的結果は、従来の気流支援グループと比較して、この電場修飾電子スピニンググループでは炎症反応と組織癒着が少ないことを示しています。この技術を当社が設計したハンドヘルドe-spinningデバイスと組み合わせると、その携帯性と正確な沈着特性により、救急医療、診療所、フィールドサバイバル、在宅医療で使用できます。

略語

ALT：

アラニンアミノトランスフェラーゼ

AST：

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ

CA：

シアノアクリレート

E-spinning：

エレクトロスピニング

FTIR：

フーリエ変換赤外

GGT：

グルタミルトランスアミナーゼ

HE：

ヘマトキシリンおよびエオシン

NOCA：

N -オクチル-2-シアノアクリレート

PMMA：

ポリメチルメタクリレート

SEM：

走査型電子顕微鏡

WBC：

白血球