水分散PEG-ポリマー複合体化した4-チアゾリジノン系化学療法剤がラットグリオーマC6細胞に対するプロアポトーシス活性を増強

概要

目的

4-チアゾリジノン誘導体とPEG含有ポリマーナノキャリアの複合体の水性製剤化が、ラットグリオーマC6細胞に対するプロアポトーシス作用を増強するかどうかを検討する。

方法

4-チアゾリジノン誘導体の抗腫瘍効果メカニズムを、ラットグリオーマC6細胞でin vitro検討。細胞生存率、細胞周期パターン、Annexin V発現を評価し、DNA損傷をDNAコメットアッセイで推定。4-チアゾリジノン誘導体をポリマーナノキャリアと複合化した新規水性製剤を用いて、C6細胞へのプロアポトーシス作用増強を図った。

結果

検討した4-チアゾリジノン誘導体は、ラットグリオーマC6細胞をアポトーシス機構で殺傷することが、これらの細胞のpre-G1期におけるFACS解析、Annexin V陽性C6細胞の出現、より高いクラスのDNAコメット数増加で確認された。検討化合物をPEG含有ポリマーナノキャリアと複合化することで、上記全手法で測定されたラットグリオーマC6細胞へのプロアポトーシス効果が有意に増強された。

結論

4-チアゾリジノン誘導体をPEG含有ポリマーナノキャリアと複合化することで、水溶性を付与し、ラットグリオーマC6細胞におけるプロアポトーシス効果を増強した。

はじめに

化学療法は多くの腫瘍の主要治療法であり、特にがんが既に転移している場合に最後の選択肢として選ばれます[1]。しかし、多くの現在の抗がん剤の重篤な副作用が臨床効果を低下させています。したがって、副作用を軽減または最小限に抑えた代替または相乗的抗がん剤の開発には、継続的かつ極めて重要な必要性があります[2]。

抗がん剤の低水溶性は、その開発と臨床応用を妨げる一般的で深刻な問題であり、多くの高活性で有望な化学療法剤が低水溶性のために除外されてきました[3]。界面活性剤と共溶媒が高濃度で使用され、水不溶性抗がん剤を溶解させますが、これらの物質自体が有害副作用を生じるため、多くの抗がん剤の使用を制限しています[4]。

医薬品開発の大きな課題は、高活性薬物、特に全身毒性を示し使用を大きく制限する抗腫瘍薬の負の副作用を排除または少なくとも軽減することです[5,6,7,8,9]。この問題を克服する効果的な方法は、標的臓器や組織の特定細胞への送達部位で毒性抗腫瘍薬を結合できる多機能ナノキャリアを使用することです[8, 10, 11]。ナノ粒子の小さなサイズ、制御された特定構造、大きな表面積、形状は、他の材料に比べていくつかの利点を提供します[5, 8, 9]。ナノ粒子を使用すると、効率を最適化し、負の副作用を最小限に抑え、がん治療を改善できます[12, 13]。したがって、高い全身毒性で以前失敗した薬物も、バイオアベイラビリティと制御放出が改善された送達システムに組み込むことで、臨床使用の第二の機会を得られます。このような薬物-キャリア複合体は、血液脳関門や個々の細胞膜などの天然バリアをより容易に通過できます。ナノ粒子の大きな表面積により、特定のベクトル生体分子と複合体を形成し、標的臓器への薬物送達を支援し、負の副作用を大幅に減少または完全に排除し、単回投与での最小有効用量を増加させ、薬物作用の効果を高め、個別化薬物療法の開発に新たな刺激を与えます。さらに、ナノ粒子は特定薬物の溶解性、安定性、吸収を改善する分子をカプセル化できます[11, 13, 14, 15]。薬物送達システムは、血中での薬物の長期循環、病態生理学的プロセス中の薬物蓄積能力、活性物質分子を細胞と細胞小器官に効果的に移送する能力を提供できます。ナノ粒子は安定で、一定期間化学構造を維持し、同時に生分解可能でなければなりません[16, 17]。

新しい抗がん剤を評価するには、様々な標的ヒトがん細胞株とin vivo実験腫瘍モデルを用いて、それらの細胞毒性活性と強度を測定することが重要です。化学療法が失敗するのは、腫瘍形成の変化に連続的または結果として生じるアポトーシス過程の欠陥が、薬物誘導細胞死において極めて重要な役割を果たすためです[18,19,20,21]。

多くの悪性細胞がアポトーシス死を回避できるため、新しい抗がん剤の設計開発には合理的アプローチが必要です。新しい抗がん剤作成の主要目標は、(1) 個々のがん細胞の変異が薬物作用の独立したメカニズムに影響を与えるのを克服する方法を見つけること、および (2) 独立した経路を同時に標的とする化学療法レジメンを設計することです。がん遺伝学と治療感受性の関係をより良く理解することは、新しい効果的な抗がん剤開発の鍵となる問題です[22]。

以前の研究で、合成4-チアゾリジノン誘導体（Les-3288、Les-3833、Les-3882）が、ドキソルビシン（Dox）とは異なり、ラットC6グリオーマとヒトU251神経膠芽腫細胞をin vitroで殺傷するために、おそらく他の抗がん剤とは異なる作用機序を使用することを示しました。Les-3288は処理細胞の反応性酸素種（ROS）レベルに有意な影響を与えませんでした[23, 24]。これらの強力な抗腫瘍剤は、実験動物体内での一般毒性が、腫瘍細胞と動物での測定された毒性生化学パラメータで、Doxと比較して低いことを強調すべきです[7, 8]。したがって、抗腫瘍薬をポリマーナノキャリア（PNC）と結合し、安定した水性送達システムの形で薬物を適用することで、これらの物質が遊離形で作用する場合と比較して、動物臓器での毒性影響を軽減できます[7, 8]。

本研究の目的は、PEG含有PNCと複合化した4-チアゾリジノン誘導体の水性製剤によるラットグリオーマC6細胞株へのアポトーシス誘導をin vitroおよびin vivoで研究し、これらの誘導体を遊離形で使用した場合のアポトーシス誘導と比較することでした。

材料と方法

抗がん剤

ヘテロ環式4-チアゾリジノン誘導体（化合物Les-3288とLes-3833、図1）は、ダニロ・ハリツキー・リビウ国立医科大学（ウクライナ）薬学・有機・生物有機化学部門で、以前記述された方法で合成されました[25]。

検討化合物の構造—Les-3288とLes-3833

細胞培養使用前、これらの化合物をジメチルスルホキシド（DMSO、Arterium、リビウ、ウクライナ）に溶解。溶液をさらに沸騰水浴で5分保持し、蒸留水で希釈して作業濃度に達しました。培地中の最終DMSO濃度は0.1%未満。Doxはウクライナのファイザー（イタリア）代理店から地元薬局で購入。

ポリマーナノキャリア

薬物送達用PNCは、リビウ工科大学（ウクライナ）有機化学部門で、以前記述された方法論[26, 27]を用いて合成されました。ポリ(VEP-co-GMA)-graft-PEGの合成は以下の段階で実施。まず、5-tert-ブチルペルオキシ-5-メチル-1-ヘキセン-3-イン（VEP、0.41 g、0.5 mol）（記述法で合成したペルオキシドモノマー[28]）とグリシジルメタクリレート（GMA、7.72 g、12.2 mol）（Sigma-Aldrich、USA）を酢酸エチル（7.9 mL）（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）中で、アゾイソブチロニトリル（AIBN、0.129 g、0.05 mol）（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）をラジカル開始剤としてラジカル共重合。重合は65%の最大転化率に達するまで343 Kで実施。ポリ(VEP-co-GMA)を主鎖として、側鎖エポキシ基とポリ(エチレングリコール)メチルエーテル（mPEG）の付加反応で側鎖PEG鎖を導入。ホウ素トリフルオリドエーテル酸エステル（0.027 mL、0.031 mol）（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）をジオキサン（20 mL；Merck、ダルムシュタット、ドイツ）中の共重合体（1.0 g）溶液に添加、313 Kで3時間撹拌。mPEG（2.5 mg、3.35 mmol）（Sigma-Aldrich、USA）をジオキサン（15 mL）に溶解し、主鎖ポリマー溶液と混合、313 Kで6時間撹拌。未反応mPEGをダイアリシスバッグ（分子量カットオフMWCO 6-8 kDa、Sigma-Aldrich、USA）で除去。結果として得られた櫛状ポリ(VEP-co-GMA)-graft-PEGを室温で真空乾燥し恒量まで。PNCの構造と特性は図2に示し、以前記述されています[29]。

PNCの模式構造—ポリ(VEP-co-GMA)-graft-PEG、主鎖は不飽和ペルオキシド2-tert-ブチルペルオキシ-2-メチル-5-ヘキセン-3-イン（VEP、「k」で表記）の共重合体ベース、側鎖はグリシジルメタクリレート（GMA、「l」で表記）とポリエチレングリコール（PEG、「m」で表記）

水性PNC溶液調製のため、0.09 g PNCを0.9 mL DMSOに溶解。このPNC溶液を8.0 mLの0.9% NaCl溶液に添加。0.5時間撹拌後、10秒超音波処理。薬物-PNC複合体の水分散液は、4-チアゾリジノンとPNCのDMSO溶液を以下の順序で水中に滴下して得ました：0.045 g PNCを0.15 mL DMSO（Sigma-Aldrich、USA）に溶解、0.0015 g Les-3288（またはLes-3833）を0.10 mL DMSOに溶解。PNCと4-チアゾリジノン溶液を混合、4.25 mLの1%水性NaCl溶液に添加、10秒超音波処理。

この表面活性PNCは、疎水性主鎖に親水性PEG鎖がグラフトされています（図2a）。水溶液中で、両親媒性PNCはミセル様構造を形成し、水不溶性化合物（薬物など）を溶解化するか、これらの化合物がナノ粒子表面に吸着し、生体適合性を高めます。4-チアゾリジノン系化学療法剤の高安定水分散液を得るために開発された技術は、DMSO希釈溶液を、ナノ粒子表面にポリマー被膜を提供するポリマー界面活性剤PNCを含む沈殿食塩溶液に移す際に起こるナノスケール薬物粒子の核生成から成ります。その結果、凝集と沈殿により複合体が安定化し、分散が防止されました。さらに、4-チアゾリジノン誘導体のナノスケール複合体は、周囲の生物学的微小環境との相互作用から保護されます。この保護により、安定性を失うことなく体内に長く留まり、標的組織や臓器に蓄積し、負の副作用を引き起こさずに済みます。したがって、この修正により、抗がん化合物ナノ粒子の水分散液の凝集と沈殿安定性が向上します。

PNCのポリマーミセルサイズと、ヘテロ環式4-チアゾリジノン（Les-3833とLes-3288）とのPNC複合体ナノ粒子サイズを、動的光散乱（DLS）でゼータサイザーNano ZS（Malvern Instruments GmbH、シュトゥットガルト、ドイツ）とDynaPro NanoStar（Wyatt Technology、サンタバーバラ、CA、USA）を用い、25°Cで非侵襲バック散乱（NIBS）技術による光子相関スペクトルで測定。DLS測定用サンプルは上記通り調製、必要に応じて生蒸留水（pH 6.5-7.0）で希釈。各サンプルで3-5回測定（各測定は5サイクル、測定間隔5分）。図3にPNCミセル構造のサイズ分布と、ヘテロ環式4-チアゾリジノン（Les-3833とLes-3288）とのPNC複合体ナノ粒子のDLS解析を示す。PNCミセルおよびPNC被覆4-チアゾリジノンナノ粒子のサイズと形態を、透過型電子顕微鏡JEM-200A（JEOL、日本）、加速電圧200 kVで研究[30, 31]。サンプルは上記通り調製、必要に応じて生蒸留水で希釈。超音波分散器UZDN-1A（Ukrrospribor Ltd.、ウクライナ）で試験溶液を基板に噴霧し、均一な被膜を形成。銅グリッド上に薄いアモルファス炭素膜を基板として使用。DLSとTEM法で研究されたPNCミセルとヘテロ環式4-チアゾリジノン（Les-3288とLes-3833）との複合体のサイズと形態を図3に示す。

PNC（左）とPNC+Les-3833複合体（右）の透過型電子顕微鏡（TEM）像

DLSとTEM研究で、PNCミセルサイズが50 ± 25 nm、PNCとヘテロ環式4-チアゾリジノンLes-3833およびLes-3288複合体で形成されるナノ粒子がそれぞれ140 ± 25 nmと155 ± 30 nmであることを実証。PNCと4-チアゾリジノン誘導体複合体の分散液は高度に安定し、チアゾリジノンナノ粒子表面に吸着したPNCシェルにより凝集と沈殿から保護されます。図4に示すように、ナノ粒子分散液のサイズ変化は、水による複数回希釈でも、PNCと4-チアゾリジノン複合体の水系系の6ヶ月経時後でも無視できるレベルです。

PNCと複合体の流動直径DLS研究（a）とPNC-薬物複合体平均サイズの分散希釈依存性（b）：水分散液PNC（1）、Les-3833+PNC複合体（2）、Les-3288+PNC複合体（3）、およびLes-3833+PNC（1-3）とLes-3288+PNC（4-6）分散液の保存2日（1.4）、4ヶ月（2.5）、6ヶ月（3.6）後の流動直径（c）

細胞培養

ラットグリオーマC6細胞株を、ウクライナ国立科学アカデミー分子生物学・遺伝学研究所（キーウ、ウクライナ）細胞培養コレクションから入手。Dulbecco改変Eagle培地（DMEM、Sigma、USA）に10%胎児牛血清（Sigma、USA）を添加して培養。37°C、5% CO₂、95%湿度のCO₂インキュベーターで培養。細胞の継代は1:5比で2-3日ごとに実施。

検討物質の細胞毒性作用評価

細胞を24ウェルプレートに100,000 cells/mL濃度で各ウェルに播種（Greiner Bio-One North America, Inc.、Monroe、NC、USA）。播種後24時間の適応期間を経て、0.1、0.5、1.0 μM濃度で検討物質を添加。トリパンブルー染色（DV-T10282、Invitrogen、Thermo Fisher Scientific Corp.、Waltham、MA、USA）を0.01%最終濃度で、細胞懸濁液添加2分後に血球計算盤で定期的に細胞計数。死細胞はプラズマ膜損傷によりこの染料を取り込みます。

フローサイトメトリー

細胞周期とアポトーシス研究のため、C6細胞をLes-3288、Les-3833およびそれらのPNC複合体、遊離PNCで処理、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 7.4）で洗浄、4°Cで1000 rpm、5分遠心分離、冷PBS（200万 cells/mL）に再懸濁。次に、-20°Cに冷却した絶対エタノール4 mLを穏やかに混合しながら添加して固定。固定サンプルを-20°Cで保存（1週間以内）。蛍光活性化細胞選別（FACS）解析のため、サンプルを4°Cで1000 rpm、5分遠心分離、上清除去、細胞ペレットを1 mL PBSに再懸濁。DNaseフリーRNase（Sigma、USA）100 µL添加、37°Cで30分インキュベート。次に、プロピジウムヨウ化物（PI）（Sigma、USA、1 mg/mL）100 µL添加、室温で10分インキュベート。最後に、プラスチックファルコンチューブに移し、FACSCaliburフローサイトメーター（BD Biosciences、Mountain View、CA、USA）とSummit v3.1ソフトウェア（Cytomation, Inc.、Fort Collins、CO、USA）で細胞周期とアポトーシスパラメータを測定。

Annexin V陽性（アポトーシス）細胞測定はFACS解析で実施。ラットグリオーマC6細胞を、図示下に示す濃度（0.1、0.5、1.0 mg/mL）のPNC、Les-3288、Les-3833、およびそれらのポリマー共役体で処理。実験終了時、トリプシン-EDTA溶液で皿底から細胞剥離、PBSで2回洗浄、アポトーシス検出キット（BD Biosciences、San Jose、CA、USA）を用いてメーカー指示に従いAnnexin V-FITCで染色。洗浄細胞をAnnexin V結合バッファー（BD Pharmingen）中で15分インキュベート、FITC標識Annexin V溶液の1/50体積を含む。その後、適切な体積のAnnexin V結合バッファーで2倍に希釈し、フローサイトメーター（Becton Dickinson、USA）のFL1/FL2（FITC-PI）チャネルで即座に測定。Annexin V単独陽性細胞をアポトーシスと分類。

DNAコメットアッセイ

アルカリ条件下でDNAコメットアッセイを実施。1万細胞をサンプルあたり75 µLの低融点アガロース（0.5%）と混合。混合後、サンプルを予め1.5%通常融点アガロースで被覆したスライドガラスにピペッティング。サンプルを溶解液（2.5 M NaCl、100 mM EDTA、10 mM Tris-base、10% DMSO、1% Triton X-100）中で4°C、18時間インキュベート。DNA解旋とアルカリラビサイト損傷発現のため、スライドを室温でアルカリ溶液中20分インキュベート（暗所で実施）。電気泳動（~74 V/cm、30分）のため、スライドを水平チャンバーに移し、1x電気泳動バッファー（0.3 M NaOH、1 mM EDTA、pH>13）を添加。スライドを氷冷100%メタノールで固定、乾燥。80 µL 1×エチジウムブロマイド（EtBr）で5分染色後、冷蒸留水に浸して過剰染料除去。DNAコメットを顕微鏡（Carl Zeiss、ドイツ）で可視化、ソフトウェア「CASP」（Casplab-1.2.3b2、CASPlab、ヴロツワフ、ポーランド）で画像解析。サンプルあたり100コメットを計数。DNA損傷をコメットテイルサイズにより5段階の遺伝毒性レベルに分類：0（0-5%損傷）、1（5-25%）、2（25-45%）、3（45-70%）、4（70%以上）[32]。損傷指数（DI）を先行研究[33]に従い計算。

メチルグリーン染料を用いたDNAインターカレーションアッセイ

化合物Les-3288とLes-3833のDNA分子へのインターカレーション能力をメチルグリーンアッセイ[34]で調査。サケ精子DNA（10 mg/mL）を37°Cで1時間、メチルグリーン溶液（1 mg/mL、H₂O中）15 µLとインキュベート。化合物を1 µg/mLで添加、37°C暗所で2時間インキュベート。サンプル総最終体積1 mL。BioTek 76 883マルチチャンネルマイクロフォトメーター（BioTek、Winooski、VT、USA）で37°C、2時間インキュベーション後、630 nmでメチルグリーン吸光度測定。EtBrを陽性対照として使用。

データ解析と統計

全実験を3反復、各バリエーション3並列で実施。群間比較に分散分析（ANOVA）を使用。C6ラットグリオーマ細胞の細胞周期各期分布データを一元配置ANOVA、Tukey事後多重比較検定で解析。全データを平均±SDで提示。p<0.05を統計的有意とみなす。

結果

遊離形とポリマーナノキャリア複合体での4-チアゾリジノン誘導体の細胞毒性効果（トリパンブルー除外試験）

トリパンブルー除外試験結果は、Les-3288とLes-3833のPNC複合体水性形態が、これらの化合物遊離形使用時と比較して、グリオーマC6細胞に対する毒性が増強されていることを示しました（24時間および48時間処理）（図5、6）。Les-3288とLes-3833化合物のPNC複合体で0.1および0.5 μM用量で最高細胞毒性効果を観察、最高用量（1.0 μM）ではLes-3288の24時間処理でのみPNC複合化増強が検出されました（図5、6）。

Les-3288単独とそのPNC複合体作用比較、異なる濃度（0.1、0.5、1.0 μM）で24時間および48時間処理後のトリパンブルー除外試験による生存ラットグリオーマC6細胞数 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (対照比、100%)

Les-3833単独とそのPNC複合体作用比較、異なる濃度（0.1、0.5、1.0 μM）で24時間および48時間処理後のトリパンブルー除外試験による生存ラットグリオーマC6細胞数 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (対照比、100%)

ポリマーナノキャリアとの複合化がLes-3833とLes-3288化合物のラットグリオーマC6細胞に対するプロアポトーシス活性をin vitroで増強

選択した4-チアゾリジノン誘導体の細胞毒性ポテンシャルに対するPNCの調節効果を評価するため、2つの代替アプローチを使用。まず、薬物-PNC複合体の細胞周期への影響を調べるため細胞周期解析を実施。さらに、Annexin V/PI二重染色でこれらのナノコンポジットが誘導する細胞死の正確なタイプを区別。

Les-3288とLes-3833化合物を低用量（0.1 µg/mLと0.5 µg/mL）で処理しても、細胞周期進行やアポトーシス誘導に顕著な影響は見られませんでした（図7、表1）。しかし、両化合物をPNCと複合化すると、pre-G₁期細胞数が有意に増加（Les-3288で4倍、Les-3833で6倍）し、それらのプロアポトーシスポテンシャルの大幅な増強を示しました。遊離PNC形態が細胞周期やアポトーシス誘導に影響しないことを強調すべきです。したがって、チアゾリジノン-ナノキャリア複合体処理下で観察された大量pre-G1細胞集団の出現は、PNCと実験薬物の単純な相乗効果では説明できません。

遊離形とPNC複合体での4-チアゾリジノン誘導体Les-3288とLes-3833のC6ラットグリオーマ細胞細胞周期進行への影響。プロピジウムヨウ化物（PI）染色、フローサイトメトリー。R2、pre-G1；R3、G1；R4、S；R5、G2期。FL2-H、フローサイトメーター第2チャネル（585/40フィルター）ピーク放出値

観察されたsub-G1ピークがアポトーシス細胞で構成されることを確認するため、Annexin V/PI染色アッセイ結果を解析。C6グリオーマをLes-3288低用量（0.1、0.5 µg/mL）および高用量（1.0 µg/mL）で処理しても、初期アポトーシス主要マーカーであるホスファチジルセリン外部化（FITC標識Annexin Vで検出）の有意な増加は観察されず、この化合物が弱いアポトーシス誘導剤であることを示唆。代わりに、壊死細胞集団の増加（対照1.2%からLes-3288 1.0 µg/mLで11.25%へ）を発見、Les-3288が少なくとも部分的に壊死性細胞死を引き起こす可能性を示唆。しかし、Les-3288をPNCと複合化すると、この薬物の作用様式が完全に変化。初期アポトーシス（Annexin V(+)/PI(−)）細胞と後期アポトーシス細胞（Annexin V(+)/PI(+)）が大幅に増加、純粋な壊死細胞総量は対照（未処理）細胞レベルに維持（図8a）。したがって、Les-3288をPNCと結合することは、グリオーマ細胞へのプロアポトーシス活性を強く増強するだけでなく、潜在的プロウォール細胞死メカニズムを減少させます。これらの知見は、プロウォール薬物が大量の炎症を誘導し患者にとって不都合なため推奨されない臨床実践において重要な意味を持つ可能性があります。

Les-3288（a）とLes-3833（b）化合物とそれらのPNC複合体のラットグリオーマC6細胞に対するプロアポトーシス活性比較。Annexin V/PI二重染色、フローサイトメトリー。PI、プロピジウムヨウ化物

驚くべきことに、Les-3833+PNC複合体では同じ効果は観察されませんでした。実際、Les-3833+PNC複合体のプロアポトーシス活性は、全テスト濃度で遊離Les-3288より低かったです（図8b）。両化合物間のこの劇的な差は、それらの化学構造の特異性で説明される可能性があり、Les-3833の場合、より良い結果を得るためにポリマー構造を最適化すべきと推測されます。

遊離形とPNC複合体での4-チアゾリジノン誘導体によるラットグリオーマC6細胞DNA損傷のコメットアッセイ

アルカリコメットアッセイでアルカリラビサイトDNA部位での一本鎖DNA切断を検出。結果をオリーブテイルモーメント（OTM）平均値で推定。0.5 µg/mL濃度で3時間処理（図9、10）した場合、Les-3288、Les-3833、PNC（OTM = 0.7299 ± 0.1276、OTM = 1.466 ± 0.3086、OTM = 0.5846 ± 0.1078）は、対照未処理細胞（OTM = 0.4541 ± 0.07273）と比較して有意なDNA損傷を引き起こしませんでした。しかし、Les-3833+PNC複合体処理（OTM = 2.3880 ± 0.2212）では、遊離Les-3833処理より有意に多くのDNA損傷を引き起こしました。このような損傷増加はLes-3288+PNC複合体では観察されませんでした（図9、10）。

実験抗腫瘍化合物0.5 µg/mL濃度で3時間処理したラットグリオーマC6細胞のオリーブテイルモーメントによるDNA損傷評価。*P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC、ポリマーナノキャリア；Dox、ドキソルビシン（陽性対照）

実験抗腫瘍化合物0.5 µg/mL濃度で3時間処理したラットグリオーマC6細胞のコメットテイルDNA存在：（a）対照（未処理細胞）、（b）Les-3288、（c）Les-3288+PNC、（d）Les-3833、（e）Les-3833+PNC、（f）PNC、（g）ドキソルビシン

細胞インキュベーション時間を6時間に延長（図11、12）すると、全実験群（Les-3288、Les-3288+PNC、Les-3833、Les-3833+PNC、Dox（陽性対照））でより大きなDNA損傷が発生。しかし、Les-3288+PNCとLes-3833+PNC複合体の効果は、Les-3288とLes-3833遊離形の効果より低く見えました。両誘導体のPNC複合体によるDNA損傷効果が、これらの誘導体遊離形による効果より低いことに注意すべきです。

実験抗腫瘍化合物0.5 µg/mL濃度で6時間処理したラットグリオーマC6細胞のオリーブテイルモーメントによるDNA損傷評価。*P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC、ポリマーナノキャリア；Dox、ドキソルビシン（陽性対照）

実験抗腫瘍化合物0.5 µg/mL濃度で6時間処理したラットグリオーマC6細胞のコメットテイルDNA存在：（a）対照（未処理細胞）、（b）Les-3288、（c）Les-3288+PNC、（d）Les-3833、（e）Les-3833+PNC、（f）PNC、（g）ドキソルビシン

結果をTailDNA%平均値で評価。0.5 µg/mL濃度で3時間インキュベート（図13）した場合、Les-3288、Les-3288+PNC、Les-3833、PNC（TailDNA%：4.157 ± 0.682；3.530 ± 1.012；8.807 ± 0.878；3.298 ± 0.514）は対照（TailDNA% = 3.638 ± 0.406）と比較して有意なDNA損傷を引き起こしませんでしたが、Les-3833+PNC複合体（TailDNA% = 19.53 ± 1.48）は遊離Les-3833より有意に多くのDNA損傷を引き起こしました。インキュベーション時間を6時間まで延長（図14）すると、全ケースでDNA損傷が増大。再び、両誘導体のPNC複合体によるTailDNA%レベルが、これらの誘導体遊離形による指標レベルより低かったです。

実験抗腫瘍化合物0.5 µg/mL濃度で3時間処理したC6ラットグリオーマ細胞のコメットテイルDNA%によるDNA損傷評価。*P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC、ポリマーナノキャリア；Dox、ドキソルビシン（陽性対照）

実験抗腫瘍化合物0.5 µg/mL濃度で6時間処理したC6ラットグリオーマ細胞のコメットテイルDNA%によるDNA損傷評価。*P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC、ポリマーナノキャリア；Dox、ドキソルビシン（陽性対照）

また、DNA移動を分類する代替5カテゴリ分類システムを用い、DIを計算。表2に3時間処理時のラットグリオーマC6細胞の各遺伝毒性レベル割合を要約。対照（未処理細胞）でレベル0（81.3%）と1（18.6%）の細胞割合が、Les-3288とPNC処理細胞より高く検出。Les-3288のPNC複合化はDNAコメット分布パターンに大きな変化をもたらしませんでした。対照的に、Les-3833処理細胞ではレベル0細胞割合が低く（38.6%）、レベル1（60.0%）が高く、Les-3833+PNC処理細胞ではレベル0が有意に低く（8.0%）、レベル1（76.0%）、2（13.3%）、3（2.6%）が大幅に高いことを示しました。Les-3288とそのPNC複合体適用時のDNA損傷統合指標（DI）は、対照や遊離PNC使用時と有意差がなかった一方、Les-3833とそのPNC複合体使用時のDIはDox使用時よりさらに高かったです。

この時間区間で、Les-3833+PNC処理細胞は、Les-3288と他の実験化合物処理細胞よりレベル4（5.3%）DNA損傷細胞割合が高かったものの、レベル2と3割合（16.0%と12.0%）は他化合物処理より低かったです（表2）。表3に6時間処理後のラットグリオーマC6細胞DNA損傷割合を要約。一般に、Les-3833とLes-3288複合体使用時、これら遊離形誘導スペクトラムと比較して、より高クラスDNAコメット出現傾向が検出されました（表3）。しかし、Les-3833とLes-3288複合体作用で計算されたDNA損傷統合指標（DI）は、これら遊離形作用の指標より低いことが判明。一つの説明として、研究薬物6時間作用時のDIレベルが非常に高く、Dox作用時の指標レベルよりさらに高い可能性があります（表3）。したがって、Les-3833とLes-3288複合体によるDNA損傷の時間依存性を観察：3時間処理ではLes-3833複合体作用でDI増加（遊離Les-3833作用比）、しかし6時間処理では両Les-3833とLes-3288複合体作用でDNA損傷減少（これら遊離形作用観察損傷比）。PNC作用に有意な時間依存性なし、一方Dox作用で有意な時間依存（3から6時間）DI増加（41.2 ± 0.40から185.2 ± 0.23）を検出。

4-チアゾリジノン誘導体Les-3288とLes-3833によるDNAインターカレーション

Les-3288とLes-3833化合物は、サケ精子DNAにインターカレートしたメチルグリーン染料の約15%と10%置換で、DNA分子へのインターカレーション特定能力を示しました。よく知られたDNAインターカレーション剤EtBrを陽性対照として使用、メチルグリーン染料をはるかに効率的に置換（70%）（図15）。したがって、Les-3288とLes-3833は二本鎖DNAの相補的塩基対間への効果的なインターカレーション能力はありません。

Les-3288とLes-3833化合物（1.0 µg/mL）と陽性対照エチジウムブロマイド（EtBr）によるサケ精子DNAインターカレートメチルグリーン染料置換

考察

がん患者治療効率向上を阻害する2つの主要問題：(1) 多くの抗がん剤の非標的作用が正常組織・臓器損傷による全身毒性と重篤な副作用を導く；(2) 腫瘍細胞の適用抗がん剤への急速な（6-12ヶ月）耐性獲得が薬物作用効力喪失を導く。さらに、(3) 多くの抗がん剤の貧弱な水溶性という技術的問題も存在。しかし、これら薬物をナノスケール特定キャリアと結合することで溶解性問題解決に寄与可能。

本研究では、上記最初と3番目の問題に対し、(a) 高抗がん活性と腫瘍保持動物での低全身毒性を両立する新規合成物質（4-チアゾリジノン誘導体：Les-3288とLes-3833）選択[7, 8, 23]と、(b) 水不溶性4-チアゾリジノン誘導体とPEG化ポリマー複合体の安定水性形態を提供する新規薬物送達プラットフォーム適用により対処。

4-チアゾリジノン誘導体—Les-3288とLes-3833—は分子量400-600 Daのヘテロ環式化合物。これらと関連誘導体はリビウ国立医科大学（ウクライナ）で合成、大半が米国メリーランド州ベセスダ国立がん研究所開発治療プログラムで評価[35,36,37,38]。これら抗腫瘍活性評価に基づき、最も有望な物質を細胞毒性作用機序と抗がん効果の更なる研究対象に選択[25]。Les-3833はB16F10、WM793、SK-Mel-28メラノーマ細胞、ヒト肺A549、乳がんMCF-7、大腸HCT116、卵巣SKOV3がん細胞、白血病細胞（L1210、Jurkat、HL-60株）に高毒性[23, 25, 39]。Les-3288とLes-3833は哺乳類グリオーマ細胞（C6、U251、U373株）に高毒性[23, 24]。

以前、Les-3288とLes-3833が他の研究4-チアゾリジノン誘導体中でラットグリオーマC6細胞とヒトグリオブラストーマU251細胞に最も毒性が高いことを発見[23, 24]、ただし絶対的水不溶性のため細胞処理適用が非常に複雑。DMSO追加加熱のみが誘導体可溶性形調製に有効（「材料と方法」参照)。したがって、これら誘導体の標的細胞への送達改善法を探すのは合理的で、合成PNCを使用してこの課題を達成。検討4-チアゾリジノン誘導体を適用PNCと複合化することで、それらの抗腫瘍作用効果も増強。これら化合物のプロアポトーシス作用メカニズムはウェスタンブロットとFACS解析で実証[23, 24]。健康実験動物では、Les-3288とLes-3833が広く使用される抗がん化学療法剤Doxより、心毒性[40]、肝毒性[8]、腎毒性[7]など負の副作用がはるかに少ないことにも留意すべきです。

以前の研究で、Les-3288がプロアポトーシス作用中in vitroおよび実験動物でROS誘導を伴わないことを示し[23]、Les-3833作用ではROS生成あったがDoxより少ない。ROSは抗がん剤、特にDoxの負の副作用主要エフェクターと見なされる[41, 42]。したがって、Les-3288とLes-3833化合物は抗腫瘍活性を持ちながら、Doxのような効果的抗がん薬特有の全身毒性を示さないため、有望な抗がん剤候補となり得ます。

Les-3288とLes-3833を抗がん剤として推進する大きな障害は貧弱な水溶性。この問題はタキソール[2, 4]など他抗がん薬にも存在。パクリタキセルでは特別なオイル使用で医薬処方で解決[2, 4, 43]。しかし、特定送達プラットフォームが「スマート」薬物創出により有望と見なされる[3, 13]。ブロック、櫛状、ブロック/分岐構造を含む特定機能性ポリマー界面活性剤、PEG含有派生水性形態が、ドキソルビシン[26, 27]と金属化学療法剤KP-1019[10]送達キャリアとして、リビウ工科大学有機化学部門で開発提案されています。

4-チアゾリジノン誘導体が水不溶性化合物であるため、DMSOで水溶性形調製。DMSOのような有毒溶媒使用の負の帰結を避けるため、これら誘導体を上記PNCと複合化。高分散安定ナノスケール水分散液を得て、ラットグリオーマC6細胞処理に適用。

4-チアゾリジノン誘導体PNC複合体使用で、これら化合物の実験動物全身毒性が低減。以前、実験抗腫瘍剤（Les-3288、Les-3833、Les-3882）を合成ポリマーキャリア複合体で適用時、心毒性[40]、肝毒性[8]、腎毒性[7]に特徴的な血清生化学パラメータ変化が、Doxよりはるかに小さいことを発見。したがって、これら抗腫瘍剤をPNCと複合化し、水溶性安定送達システム形で適用することで、遊離形作用と比較して実験動物毒性影響を軽減[44]。パクリタキセル送達システムとして、ポリマーナノ粒子、脂質ベース処方、ポリマー共役体、無機ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶、シクロデキストリンナノ粒子など複数提案[43]。

したがって、Les-3288のPNC複合化がこの実験薬のプロアポトーシス活性を有意に増強し、動物腫瘍モデルでの前臨床研究へ前進可能に。同タイプナノキャリアでのLes-3833複合化は効率が低く、別タイプポリマー使用すべき。

開発水性複合体形態と遊離誘導体をラットグリオーマC6細胞処理に適用。PNCと4-チアゾリジノン誘導体—Les-3288とLes-3833—複合体水性形態がこれら化合物プロアポトーシス作用を増強することが判明。別研究で、Les-3288によるアポトーシス誘導がROS誘導を伴わないことを実証、DoxとLes-3833作用とは対照的[23]。したがって、NK/Lyリンパ腫移植BALB/Cマウスで悪性腫瘍標的とした場合、高抗腫瘍活性と低全身毒性を併せ持つLes-3288は、この実験抗がん化合物の大きな可能性を示唆。提示データはまた、PNC複合化Les-3288とLes-3833化合物のグリオーマ治療への潜在的有用性も予測。

細胞分裂、分化、死は多細胞生物組織ホメオスタシス調節主要生理プロセス。ゲノム完全性破綻と細胞死制御障害が制御不能細胞増殖を導く可能性。細胞死プロセス妥協もゲノム不安定性促進可能。細胞周期と細胞死プロセス調節不全が、がん、心血管疾患、感染、炎症、神経変性疾患など主要疾患発展に極めて重要な役割果たすことが明らかになりつつあります[45]。

一部4-チアゾリジノン誘導体、すなわちLes-3288とLes-3833が、ラットC6グリオーマとヒトU251グリオブラストーマ細胞in vitroでDoxより効果的にアポトーシス誘導することが発見[23, 24]。脳腫瘍は適用化学療法に最も抵抗性ある悪性腫瘍に属し、これら腫瘍患者生存率は極めて低いことに留意[44]。

このPNC複合化が4-チアゾリジノン誘導体（Les-3288とLes-3833）プロアポトーシス作用を増強すること示されています[44]。別研究[23]で、Les-3288アポトーシス誘導がROS誘導伴わないこと実証、Dox作用と対照的、Les-3833とは部分的に対照的。これらデータがLes-3288のDox比低全身毒性説明可能[23, 24]。

FACS解析結果は、研究4-チアゾリジノン誘導体プロアポトーシス作用増強が新規PNC複合化によるものとの示唆と整合。Les-3288とLes-3833のこのような複合化が、処理ラットグリオーマC6細胞集団中pre-G1細胞比増加、G1細胞比減少、G2/M細胞作用増加をもたらし、PNC複合化研究誘導体の細胞毒性作用（アポトーシス）と細胞静止作用（細胞周期G2/M期ブロック）両方増強示唆。一般に、グリオーマ細胞殺傷のLes-3288+PNC複合体とLes-3833+PNC複合体アポトーシス機構は、Annexin V単独陽性ラットグリオーマC6細胞出現FACS解析結果で実証。

研究4-チアゾリジノン誘導体作用へのアポトーシス機構関与は、DNAコメットアッセイ結果でも確認。Les-3833 PNC複合化が、遊離Les-3833比でラットグリオーマC6細胞「0」DNAコメット比減少と「1」、「2」、「3」コメット同時増加（3時間細胞処理）導くこと発見。6時間Les-3833+PNC複合体処理では、遊離Les-3833比で「1」コメット大幅増加、最も発現したDNA損傷「4」コメット細胞比増加、および「2」と「3」コメット比減少。Les-3288とLes-3833 DNA損傷効果が6時間測定でこれら誘導体PNC複合体効果より高いことに留意（表3参照）。一つの説明として、研究薬物6時間作用時DIレベルが非常に高く、Dox作用時指標レベルよりさらに高い可能性（表3）。PNC作用に時間依存性なし、一方Doxで有意時間依存（3から6時間）DI増加（41.2 ± 0.40から185.2 ± 0.23）検出。

したがって、4-チアゾリジノン誘導体—Les-3288とLes-3833—PNC複合化が、これら化合物のラットグリオーマC6細胞細胞毒性効果を増強、その効果はDNAコメットとして電気泳動細胞観察されるDNA損傷を含むアポトーシス機構で達成。

DNAインターカレーション試験で、4-チアゾリジノン誘導体直接DNA標的化調査、サケ精子DNAインターカレートメチルグリーン染料弱い置換のみ（Les-3288 15%、Les-3833 10%置換）明らか、陽性対照EtBr使用（70%置換）比較。

したがって、4-チアゾリジノン誘導体—Les-3288とLes-3833—新規PNC複合化水性形態使用でin vitro細胞毒性実験実施がより便利に。さらに、新規合成4-チアゾリジノン誘導体（Les-3833とLes-3288）がBALB/Cマウス移植NK/Lyリンパ腫に対するin vivo治療効果持ち、それら効果がDoxと比較可能であること実証。同時に、これら誘導体作用が、動物血液中赤血球、好中球、リンパ球数変化と血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼ活性変化として測定される負の副作用が、Dox作用比較ではるかに少ないことも示しました。

結論

Les-3288とLes-3833のPEG含有PNC複合化が、ラットグリオーマC6細胞への細胞毒性作用を増強。細胞毒性作用はアポトーシス機構で実現、FACS解析でラットグリオーマC6細胞pre-G1分画存在とAnnexin V単独陽性細胞で確認。DNAコメット解析で処理グリオーマC6細胞核DNA一本鎖切断明らか、これは検討化合物DNA分子インターカレーションによるものではない可能性。両親媒性PEG含有PNCで安定化されたLes-3288とLes-3833が水性形態となり、遊離薬物形態比較でin vitro抗腫瘍効果増強を提供。

略語

DMSO:

ジメチルスルホキシド

Dox:

ドキソルビシン

EtBr:

エチジウムブロマイド

FACS:

蛍光活性化細胞選別

ROS:

反応性酸素種

PBS:

リン酸緩衝生理食塩水

PEG:

ポリエチレングリコール

PI:

プロピジウムヨウ化物

PNC:

ポリマーナノキャリア

SEM:

走査型電子顕微鏡

TEM:

透過型電子顕微鏡

VEP:

2-tert-ブチルペルオキシ-2-メチル-5-ヘキセン-3-イン