miR-410/Wnt-11標的化による骨形成促進と破骨細胞抑制を介した大腿骨頭壊死治療

概要

背景

マイクロRNA-410（miR-410）が大腿骨頭壊死（ONFH）において果たす機能的役割についてはほとんど知られていません。本研究の目的は、miR-410がWnt-11を標的として骨形成と破骨細胞機構を調節し、ONFHを予防するメカニズムを解明することです。

方法

ONFH検体15例と正常検体15例を収集し、大腿骨頭の病理変化、骨芽細胞、破骨細胞を観察しました。ONFHラットモデルにアゴミア-miR-410、Wnt-11-siRNA、またはoe-Wnt-11を注射しました。miR-410、Wnt-11、骨芽細胞関連因子（アルカリホスファターゼ[ALP]、骨ガンマカルボキシグルタミン酸タンパク[BGLAP]、Collα1）、破骨細胞関連因子（酸性ホスファターゼ5[ACP5]、カテプシンK[CTSK]、MMP9）、ならびにBcl-2とBaxの発現をRT-qPCRとウェスタンブロットで解析しました。骨形成機能指標（ALP、オステオカルシン[OCN]）と破骨細胞機能指標（NTX-1、CTX-1）を血清中でELISAにより測定しました。

結果

臨床検体のONFH組織では、miR-410、ALP、BGLAP、Collα1が低下し、Wnt-11、ACP5、CTSK、MMP9が上昇していました。miR-410の上昇とWnt-11の低下は、ラットの骨ミネラル密度（BMD）と骨量率（BV/TV）を向上させ、大腿骨幹、大腿骨頭、脊柱のBMDを高め、血清カルシウムとリン酸レベルを上昇させました。また骨細胞のアポトーシスを抑制し、OCN、ALP、BGLAP、Collα1発現を上昇させ、ACP5、CTSK、NTX-1、CTX-1、MMP9発現を低下させました。

結論

本研究は、miR-410の上昇またはWnt-11の低下が骨芽細胞を増加させ破骨細胞を減少させ、ONFHの発症を緩和することを示唆しています。したがって、miR-410はONFH治療の潜在的標的となり得ます。

はじめに

大腿骨頭壊死（ONFH）は股関節に影響を与える最も一般的な疾患の一つであり、激しい疼痛や関節機能障害を引き起こし、主に中年層に発症します[1]。中国には成人ONFH患者が812万人存在し、その治療は外科医にとって依然として課題です[2]。高脂血症、自己免疫疾患、凝固障害、アルコール依存、高コルチゾール症など多くのリスク因子がONFH発症に関連しています[3]。外科治療にはコア減圧術（自家骨髄移植などの併用あり）や、関節温存療法が無効な高齢者や末期壊死に対する人工股関節全置換術（THR）があります[4]。しかし、THRを頻繁に必要とする患者ではONFHの予後は不良です[5]。したがって、ONFH治療のための正確な治療標的を探索する緊急の必要性があります。

マイクロRNA（miRNA）は細胞機能と遺伝子発現の主要な調節因子であり、内皮ホメオスタシスに大きな影響を与え、新たな治療法となり得ます[6]。miR-410は子宮内膜がん、肺がん、骨髄腫、乳がんなど複数の悪性腫瘍で異常発現し、腫瘍抑制因子として機能することが報告されています[7-10]。別の研究では、miR-410がPTEN/AKT/mTORシグナル経路を抑制することで、6-ヒドロキシドパミン誘導パーキンソン病細胞モデルに神経保護効果を示すことが明らかにされました[11]。また、miR-410がFKBP5とAKTシグナル経路を標的として小児急性リンパ性白血病の悪性生物学的挙動を調節することも報告されています[12]。さらに、miR-410がアンジオテンシンII型1受容体を標的として膵臓がんに抑制効果を示すことも示されています[13]。Wntタンパク質はシステイン豊富な分泌型リポ糖タンパク質であり、発達と疾患に重要な役割を果たします[14]。Wnt-11はWntシグナル経路に属し、発癌において重要な役割を果たす陽性調節因子です[15]。扁平上皮がん抗原とWnt11の発現が子宮頸がんにおいて臨床的意義を持つことが報告されています[16]。さらに、TGF-β1とWnt11の相乗シグナルがRhoキナーゼ-アクチン-MRTF-Aシグナル経路を介して平滑筋におけるsm-α-アクチン発現を駆動することが示されています[17]。以上の文献に基づき、本研究はmiR-410がWnt-11を調節することでONFH予防に果たす役割を調査し、miR-410がWnt-11を標的として骨形成と破骨細胞機構を調節しONFHを予防するという仮説を立てました。

材料と方法

倫理声明

本研究は首都医科大学附属北京石景山病院の機関審査委員会の承認の下で実施され、ヘルシンキ宣言の原則に従いました。参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供しました。すべての動物実験は国立衛生研究所の実験動物飼育および使用ガイドラインに準拠し、首都医科大学附属北京石景山病院の動物実験倫理委員会の許可を得ています。

研究対象

2017年1月から2018年9月までに首都医科大学附属北京石景山病院整形外科で治療を受けた30例の患者を選択しました。其中15例はONFHでTHR手術を受け、中央年齢50.6±4.3歳、体重57.0±5.6 kg、男性7名、女性8名（ONFH群）。もう15例は大腿骨頸部骨折でTHR手術を受け、中央年齢59.6±3.3歳、体重50.0±5.6 kg、男性9名、女性6名（対照群）。両群間で性別、年齢、体重に有意差はありませんでした（P>0.05）。大腿骨頭の軟骨下壊死領域の組織を大腿骨頭の縦軸に沿って採取し、-80℃で保存しました。各群を病理学的および分子生物学的に検討しました。

ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色

検体を4%パラホルムアルデヒドで固定し、10%エチレンジアミン四酢酸で脱灰し、脱灰液を週1回交換しました。骨検体の色を観察し脱灰度を測定しました。完全脱灰後、パラフィン包埋し、4μm厚で切片作製しました。焼付け切片をキシレンI、IIで各10分脱パラフィンし、絶対エタノールI、II、95%、80%、70%エタノールで各2分脱水しました。その後、ヘマトキシリンで3分染色、1%塩酸アルコールで2分脱色しました。次に50%、70%、80%アルコールで各2分、エオシンで5秒染色しました。次に95%アルコール、絶対エタノールI、IIで各3分、キシレンI、IIで各5分処理し、中性ガムで封入し顕微鏡で観察しました。

アルカリホスファターゼ（ALP）染色

各検体から1切片を選択し、60℃で60分焼付けしました。パラフィン切片をキシレンI、IIで各15分脱パラフィンし、絶対エタノールI、II、95%、90%、80%、75%エタノールで各5分脱水し、三重蒸留水で2分×3回洗浄しました。ALP染色キット（南京建成生物工学研究所）で調製した基質液を切片に滴下し、試料を完全に覆うようにして37℃で遮光下15分インキュベートしました。余分な染色液を廃棄し、直ちに発色剤Aを5分滴下、三重蒸留水で30秒洗浄しました。次に発色剤Bで30秒染色し、対比染色試薬で30秒対比染色しました。200倍光学顕微鏡で撮影し、顕微鏡画像解析システム（Image-Pro Plus 6.0）で骨芽細胞数を計測しました。

酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）染色

各検体から1切片を選択し、60℃で60分焼付けしました。パラフィン切片をキシレンI、IIで各15分脱パラフィンし、絶対エタノールI、II、95%、90%、80%、75%エタノールで各5分脱水しました。調製した固定液で30秒固定しました。切片を染色ラックに入れ、新調したTRAP染色液（シグマ社）を含む暗箱に入れ、染色液が切片を完全に覆うようにして37℃水浴で1時間インキュベートしました。次にヘマトキシリンで2分対比染色し乾燥させました。TRAP染色は時間経過で減衰するため、封入せず直接顕微鏡で観察しました。200倍光学顕微鏡で撮影し、画像解析システムで破骨細胞数を計測しました。

免疫組織化学染色

脱灰後、パラフィン包埋し4μm厚で切片作製しました。切片を慣習的なキシレンで脱パラフィンし、勾配アルコールで脱水し、3% H₂O₂（シグマアルドリッチ社）で7℃、30分処理し、0.01 Mクエン酸緩衝液で95℃、20分加熱抗原活性化しました。正常羊血清作業液で10分ブロッキングし、一次抗体Wnt-11（1:100、インビトロジェン社）を4℃で一晩反応させ、二次抗体（既製二次抗体キットPV-6000、ZSGB-BIO社）で20分、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン作業液（S-A/HRP、北京コムウィンバイオテック社）で2分反応させました。ジアンミノベンジジン（DAB、シグマアルドリッチ社）で発色し、ヘマトキシリン（上海ボグー生物技術社）で対比染色し封入しました。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を一次抗体の代わりに陰性対照としました。光学顕微鏡下で陽性細胞は細胞質に褐色反応物を示し、強陽性は暗褐色、弱陽性は淡褐色、陰性は無着色でした。各切片で5視野（400倍）を観察し、視野あたり100細胞を計測、平均値を各切片の観察結果としました。陽性細胞の割合と分布に基づき、陰性（-、単一細胞染色、陽性細胞<5%）、弱陽性（+、散在または小細胞塊染色、5-24%）、陽性（++、片状または集簇染色、25-50%）、強陽性（+++、弥漫性染色、>50%）と判定しました。免疫組織化学結果は2名が独立に盲検スコアリングで評価しました。

逆転写定量PCR（RT-qPCR）

トリゾール抽出キット（インビトロジェン社）で組織検体から総RNAを抽出し、濃度と純度を測定しました。プライマーはタカラバイオ社（大津市）で設計・合成しました（追加ファイル1: Table S1）。PrimeScript RTキット（タカラバイオテクノロジー社、大連市）でRNAをcDNAに逆転写しました。SYBR® Premix Ex Taq™ IIキット（タカラバイオテクノロジー社）の指示に従い蛍光定量PCRを実施しました。ABI PRISM® 7300システム（アプライドバイオシステムズ社）を使用しました。U6をmiR-410の内部標準、グリセラールデヒドリン酸脱水素酵素（GAPDH）をWnt-11、ALP、BGLAP、Collα1、ACP5、CTSK、MMP9、Bcl-2、Baxの内部標準としました。標的遺伝子の相対転写レベルを2^(-ΔΔCt)法で算出しました[18]。

ウェスタンブロット解析

大腿骨頭組織から総タンパク質を抽出し、各検体のタンパク質濃度を測定し、脱イオン水で調整してローディング量を揃えました。ドデシル硫酸ナトリウム分離ゲルとスペーサーゲル（10%）を調製しました。アイスバスと遠心分離後、同量を電気泳動で分離し、ゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に転写しました。膜を5%脱脂粉乳で4℃一晩ブロッキングし、一次抗体：Wnt-11（1:150、サンタクルーズバイオテクノロジー社）、ALP（1:100、シグマ社）、BGLAP、Collα1、MMP9（1:1000）、ACP5（1:100）、CTSK（1:500、アブカム社）、Bcl-2とBax（1:500、プロテインテック社）で一晩反応させました。二次抗体IgG（1:1000、武漢ボスター生物技術社、HRP標識）で1時間インキュベートしました。膜を強化化学発光反応液（ピアース社）に1分浸し、液を除去後フード保存フィルムで覆い、現像・定着後観察しました。GAPDHを内部標準とし、タンパク質バンド画像をImageJ2xソフトウェアで解析しました。

ラットONFHモデルの確立

体重300-350 gの雄スプラーグ・ドーレー（SD）ラット90匹（上海SLAC実験動物社）を選択しました。環境を18-25℃、湿度45-70%に設定し、騒音を避けるため個別ケージで飼育しました。1週間の順化飼育後、後続実験を実施しました。

外傷性ONFHでモデルを確立しました。SDラットを腹腔麻酔し、除毛・皮膚準備後、皮膚を切開し組織を分離、大腿骨頭露出後に円靭帯を切断しました。ラット大腿骨頸部の骨膜を剥離し、大腿骨頭周囲の血液供給を破壊しました。関節包、筋肉、皮膚を層ごとに縫合し、再度消毒しました。

動物群分け

成功モデル70匹を7群に分け、各群10匹：ONFH群；アゴミア-NC群（ONFH確立1週間後、股関節周囲に0.5 mLのmiR-410アゴニストNC（200 nM、広州リボバイオ社）を注射）；アゴミア-miR-410群（同上、miR-410アゴニスト）；siRNA-NC群（ONFH確立1週間後、股関節周囲に0.4 mLのWnt-11サイレンシングベクターNC（1×10⁹ PFU含有、上海ジーンファーマ社）を注射）；Wnt-11-siRNA群（同上、Wnt-11サイレンシングベクター）；アゴミア-miR-410+OE-NC群（miR-410アゴニスト0.5 mLとWnt-11過剰発現ベクターNC 0.4 mLを注射）；アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群（miR-410アゴニスト0.5 mLとWnt-11過剰発現ベクター0.4 mLを注射）。同時に正常群（生理食塩水を腹腔注射のみ、10匹）を対照としました。ONFH確立4週間後、マイクロCT、骨形態計測、X線観察、骨密度測定、血清カルシウム・リン測定を実施しました。

マイクロCT検査と骨形態計測解析

ラットの右大腿骨頭をマイクロCT装置（GE社）に載せ、標準ファントムも同時スキャンしました。スキャンパラメータ：分解能27×27×27 μm、管電流450 mA、管電圧80 kV、単一スキャン時間88分。ラット大腿骨頭の微細構造を詳細に観察しました。仕様に従い校正後、各群からランダムに3つの直方体関心領域（ROI、0.5×0.5×0.5 cm³）を選択し再構築しました。画像処理はGE Microviewソフトウェアで実施し、ROIを骨形態計測で再構築・解析しました。骨ミネラル密度（BMD）と骨量率（BV/TV）を選択しました。

X線観察、BMD測定、血清カルシウム・リン測定

手術4週間後、各群ラットに10%クロラール水和物を腹腔注射し麻酔後、仰臥位で四肢を固定しX線撮影しました。大腿骨頭の形状と密度の変化を観察しました。左大腿骨幹、大腿骨頭、脊柱の骨密度を二重エネルギーX線骨密度測定装置で測定しました。手術4週間後、各群ラットを12時間絶食後、朝に心穿刺で血液（5 mL）を採取し、真空清潔凝固管に入れました。3000 rpm、15分遠心分離で血清を分離し、自動生化学分析装置で血清カルシウムとリンレベルを測定しました。

電子顕微鏡観察

ラット骨組織を3.5%グルタルアルデヒドで固定し、5%塩酸と1%オスミウム酸で脱灰し、勾配アセトンで脱水し、酢酸ウランとクエン酸で二重染色し、最後にEpon-61で包埋しました。半薄切片作製後、超薄切片を透過型電子顕微鏡で観察しました。

TUNELアッセイ

パラフィン包埋切片を慣習的な脱パラフィン・脱水処理後、ペプシン（0.25-0.5%塩酸溶液）で25分処理し、50 μL TUNEL反応混合液を滴下し湿箱で60分、50 μLアジェント・ペルオキシダーゼを滴下し湿箱で30分インキュベートしました。DAB試薬で発色し、着色有無を顕微鏡で観察しました。水で発色停止し、ヘマトキシリンで2分対比染色しました。95%エタノールI-II、絶対エタノールI-IIで各3-5分、キシレンI-IIで各3-5分処理し、中性ガムで封入しました。光学顕微鏡で解析しました。

酵素免疫測定法（ELISA）

麻酔後、大腿動脈から血液を採取し、1時間静置後遠心分離で血清を回収しました。ELISAキット（上海酵素免疫バイオテクノロジー社）の仕様に従い、7つの標準孔に各濃度標準液（100 μL）を順次添加、ブランク孔に標準希釈液（100 μL）、残りの孔に検体（100 μL）を添加しました。酵素プレートをフィルムで覆い1時間放置後、液を廃棄しました。溶液A（100 μL）を全孔に添加しフィルムで覆い1時間放置。洗浄後、溶液B（100 μL）を全孔に添加しフィルムで覆い30分放置。テトラメチルベンジジン基質液（90 μL）を添加しフィルムで覆い10-20分、終止液（50 μL）を全孔に添加しました。マイクロプレートリーダーで各孔の光学密度（OD）を測定し、検体の実濃度を算出しました。

二重ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ

バイオインフォマティクスソフトウェア（https://www.targetscan.org）でmiR-410とWnt-11 3'非翻訳領域（UTR）の結合部位と標的関係を予測しました。miR-410結合部位を含むWnt-11 3'UTRプロモーター領域配列を合成し、pMIR-REPORT™ルシフェラーゼベクタープラスミド（アンビオン社）に挿入してWnt-11 3'UTRワイルド型プラスミド（Wnt-11-WT）を作製しました。また、プラスミドと変異結合部位に基づきWnt-11 3'UTR変異型プラスミド（Wnt-11-MUT）を作製しました。購入したプラスミド抽出キット（プロメガ社）の手順に従い、対数増殖期細胞を96ウェルプレートに播種しました。細胞コンフルエンス約70%時にリポフェクタミン2000でトランスフェクションしました。Wnt-11-WTとWnt-11-MUTをそれぞれミミックNCとmiR-410ミミック（上海ジーンファーマ社）と混合し、293T細胞に共トランスフェクションしました。トランスフェクション48時間後、細胞を回収・溶解し、ルシフェラーゼ検出キット（バイオビジョン社）とGlomax 20/20ルミノメーター（プロメガ社）でルシフェラーゼ活性を測定しました。

統計解析

全データをSPSS 21.0ソフトウェア（IBM社）で処理しました。測定データは平均±標準偏差で表現しました。多群比較には一元配置分散分析（ANOVA）、二群比較にはt検定を用い、ANOVA後にはフィッシャーの最小有意差t検定（LSD-t）を実施しました。P<0.05を統計的有意差としました。

結果

臨床検体ONFH組織の病理変化

大腿骨頸部骨折群（対照群）とONFH群の大腿骨頭病理変化をHE染色で観察しました。対照群では骨梁密度が均一で構造が完全でした。一方ONFH群では、骨小梁に多数の空洞が見られ、骨細胞が減少し、骨梁が連続的に変化していました。さらに骨小梁周囲に他組織の増生が認められました（図1a）。

TRAP染色では、TRAPは主に破骨細胞に見られ、成熟破骨細胞の同定に用いられます。対照群と比較してONFH群ではTRAP陽性破骨細胞数が増加し、破骨細胞の形態は多様で、大型の多核細胞が観察されました。破骨細胞に隣接する骨小梁に明らかな骨欠損が見られ、骨吸収が示唆されました（図1b）。

ALP染色では、ALPは骨芽細胞分化・成熟のマーカー酵素で、骨基質成熟石灰化の調節に関与するため、骨芽細胞の同定に用いられます。成熟骨芽細胞の細胞質に褐色またはコーヒー色の顆粒が観察されました。対照群と比較してONFH群ではALP陽性骨芽細胞数が減少しました（図1c）。

臨床検体ONFH組織におけるmiR-410、ALP、BGLAP、Collα1の低下とWnt-11、ACP5、CTSK、MMP9の上昇

ウェスタンブロットとRT-qPCRにより、ONFH群では対照群と比較してmiR-410発現が低下し、Wnt-11発現が上昇；骨芽細胞関連因子ALP、BGLAP、Collα1発現が低下；破骨細胞関連因子ACP5、CTSK、MMP9発現が上昇していました（全てP<0.05）（図2a-c）。

免疫組織化学でWnt-11発現を検証したところ、Wnt-11タンパク質は主に細胞質に発現し、陽性発現は概ね褐色または茶色でした。対照群と比較してONFH群ではWnt-11タンパク質陽性率が上昇していました（P<0.05）（図2d）。

miR-410上昇とWnt-11低下によるラットBMDとBV/TVの上昇

マイクロCTでは、正常群では大腿骨頭外観が円形で頸部厚が均一、骨梁構造が連続的で均等に分布していました。ONFH群、アゴミア-NC群、siRNA-NC群、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群では、ラット大腿骨頭が徐々に崩壊し、骨吸収領域が出現、大腿骨頸部が細くなり、骨梁が断裂し連続性が破壊されました。一方、アゴミア-miR-410群、Wnt-11-siRNA群、アゴミア-miR-410+OE-NC群では、ラット外観が保たれ、崩壊や明らかな骨吸収領域はなく、骨梁が正常に配列し構造が完全でした（図3a）。

骨形態計測では、正常群と比較してONFH群ではBMDとBV/TVが低下（両方P<0.05）。アゴミア-NC群とsiRNA-NC群と比較して、アゴミア-miR-410群とWnt-11-siRNA群ではBMDとBV/TVが上昇（全てP<0.05）。アゴミア-miR-410+OE-NC群と比較して、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群ではBMDとBV/TVが低下（両方P<0.05）（図3b, c）。

miR-410過剰発現とWnt-11低発現による大腿骨幹・大腿骨頭・脊柱BMDおよび血清カルシウム・リン上昇

X線観察では、正常群では大腿骨頭外観が円形で密度均一、構造完全でした。ONFH群、アゴミア-NC群、siRNA-NC群、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群では、ラット大腿骨頭が薄くなり骨吸収領域が出現しました。アゴミア-miR-410群、Wnt-11-siRNA群、アゴミア-miR-410+OE-NC群では、大腿骨頭外観が均一で厚みが完全でした（図4a）。

BMDと血清カルシウム・リン測定では、正常群と比較してONFH群では大腿骨幹、大腿骨頭、脊柱のBMDおよび血清カルシウム・リンレベルが低下（全てP<0.05）。アゴミア-NC群とsiRNA-NC群と比較して、アゴミア-miR-410群とWnt-11-siRNA群ではこれらが上昇（全てP<0.05）。アゴミア-miR-410+OE-NC群と比較して、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群ではこれらが低下（全てP<0.05）（図4b, c）。

Wnt-11サイレンシングとmiR-410上昇によるラット組織病理変化の改善と骨細胞アポトーシス抑制

HE染色では、正常群では骨梁が整然と規則正しく緊密に配列し、骨細胞が骨腔を満たし、石灰化帯が軟骨下骨梁とよく連結していました。ONFH群、アゴミア-NC群、siRNA-NC群、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群では、骨梁が疎で薄く、断裂し構造が無秩序で、一部に破片が見られました。一部の骨細胞が壊死し、多数の骨腔が空洞化し、壊死骨梁空間に明らかな肉芽組織増生が観察され、壊死骨梁を包み込んでいました。アゴミア-miR-410群、Wnt-11-siRNA群、アゴミア-miR-410+OE-NC群では、ラット外観が保たれ、明らかな骨吸収領域はなく、骨梁が正常に配列し構造が完全でした（図5a）。

電子顕微鏡観察では、正常群では骨細胞形状が骨腔と一致し、細胞と骨腔壁の間に小さな隙間があり、細胞小器官が豊富で、核は卵形、核膜は完全、クロマチンは凝集せず、細胞質偽足が骨小管に伸び隣接骨細胞と連結していました。骨芽細胞は骨梁表面に位置し、紡錘形で多数の細胞小器官を有していました。ONFH群、アゴミア-NC群、siRNA-NC群、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群では、骨芽細胞細胞質に大量の脂質沈着、骨膜と骨腔の隙間が拡大、核膜と細胞質間に浮腫性明帯、核周辺化、核膜完全、ミトコンドリア腫脹、小胞体とゴルジ体消失が見られました。アゴミア-miR-410群、Wnt-11-siRNA群、アゴミア-miR-410+OE-NC群では、ラット骨芽細胞形態は正常で、少数細胞核にクロマチン凝集、細胞質に明らかな脂滴なし、核膜完全でした（図5b）。

TUNEL染色では、正常群と比較してONFH群で骨細胞アポトーシス率が上昇（P<0.05）。アゴミア-NC群とsiRNA-NC群と比較して、アゴミア-miR-410群とWnt-11-siRNA群でアポトーシス率が低下（両方P<0.05）。アゴミア-miR-410+OE-NC群と比較して、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群でアポトーシス率が上昇（P<0.05）（図5c, d）。

ウェスタンブロットとRT-qPCRでは、正常群と比較してONFH群でBcl-2発現低下、Bax発現上昇（両方P<0.05）。アゴミア-NC群とsiRNA-NC群と比較して、アゴミア-miR-410群とWnt-11-siRNA群でBcl-2上昇、Bax低下（全てP<0.05）。アゴミア-miR-410+OE-NC群と比較して、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群でBcl-2低下、Bax上昇（両方P<0.05）（図5e-g）。

miR-410過剰発現とWnt-11低発現による骨芽細胞増加と破骨細胞減少

TRAP染色では、正常群ではTRAP陽性破骨細胞の形態は多様で、多くは紡錘形、少数の大型破骨細胞は多角形、多くは骨小梁周囲に分布していました。ONFH群、アゴミア-NC群、siRNA-NC群、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群では、TRAP陽性細胞が増加し、大型多角形・多核細胞で形態多様、隣接骨梁に骨吸収と典型的吸収窩が形成されていました。アゴミア-miR-410群、Wnt-11-siRNA群、アゴミア-miR-410+OE-NC群では、TRAP陽性細胞数が減少し、長条形で形態規則的、多角形多核破骨細胞は稀、隣接骨梁構造が比較的完全でした（図6a）。

ALP染色では、正常群ではALP陽性骨芽細胞は小型円形で凝集分布し、多くは骨髄腔骨梁空間と一部骨梁表面に位置していました。ONFH群、アゴミア-NC群、siRNA-NC群、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群では、ALP陽性骨芽細胞数が減少し、骨髄腔骨梁空間に分散分布していました。アゴミア-miR-410群、Wnt-11-siRNA群、アゴミア-miR-410+OE-NC群では、骨芽細胞陽性細胞数が増加し、骨髄腔骨梁空間と一部骨梁表面に分布していました（図6c）。

正常群と比較してONFH群では単位面積あたり骨芽細胞数が抑制され、破骨細胞数が増加（両方P<0.05）。アゴミア-NC群とsiRNA-NC群と比較して、アゴミア-miR-410群とWnt-11-siRNA群で骨芽細胞数増加、破骨細胞数減少（全てP<0.05）。アゴミア-miR-410+OE-NC群と比較して、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群で骨芽細胞数減少、破骨細胞数増加（両方P<0.05）（図6b, d）。

高発現miR-410と低発現Wnt-11によるONFHラットにおけるOCN、ALP、BGLAP、Collα1上昇およびNTX-1、CTX-1、ACP5、CTSK、MMP9低下

ELISAでは、正常群と比較してONFH群で骨形成機能指標ALPとOCNレベルが低下、破骨細胞機能指標NTX-1とCTX-1が上昇（全てP<0.05）。アゴミア-NC群とsiRNA-NC群と比較して、アゴミア-miR-410群とWnt-11-siRNA群でALPとOCN上昇、NTX-1とCTX-1低下（全てP<0.05）。アゴミア-miR-410+OE-NC群と比較して、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群でALPとOCN低下、NTX-1とCTX-1上昇（全てP<0.05）（図7a）。

ウェスタンブロットとRT-qPCRでは、正常群と比較してONFH群で骨芽細胞関連因子ALP、BGLAP、Collα1発現低下、破骨細胞関連因子ACP5、CTSK、MMP9発現上昇（全てP<0.05）。アゴミア-NC群とsiRNA-NC群と比較して、アゴミア-miR-410群とWnt-11-siRNA群でALP、BGLAP、Collα1上昇、ACP5、CTSK、MMP9低下（全てP<0.05）。アゴミア-miR-410+OE-NC群と比較して、アゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群でALP、BGLAP、Collα1低下、ACP5、CTSK、MMP9上昇（全てP<0.05）（図7b-d）。

ONFHラット組織におけるWnt-11上昇とmiR-410低下、およびWnt-11がmiR-410の標的遺伝子であることの確認

オンライン解析ソフトウェアでmiR-410とWnt-11遺伝子の標的関係を解析しました。Wnt-11遺伝子配列とmiR-410配列の間に特定の結合領域が存在し、Wnt-11がmiR-410の標的遺伝子であることが示唆されました（図8a）。ルシフェラーゼ活性アッセイでこの関係を検証しました（図8b）。NC群と比較してmiR-410ミミック群でルシフェラーゼ活性が低下（P<0.05）しましたが、MUT 3'UTRでは有意差なし（P>0.05）であり、miR-410がWnt-11に特異的に結合することを示しました。

ウェスタンブロットとRT-qPCRでは、正常群と比較してONFH群でmiR-410発現低下、Wnt-11発現上昇（両方P<0.05）。アゴミア-NC群と比較してアゴミア-miR-410群でmiR-410上昇、Wnt-11低下（両方P<0.05）。siRNA-NC群と比較してWnt-11-siRNA群でWnt-11低下（P<0.05）。アゴミア-miR-410+OE-NC群と比較してアゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群でWnt-11上昇（P<0.05）（図8c-e）。

免疫組織化学でWnt-11発現を検証しました。Wnt-11タンパク質は主に細胞質に発現し、陽性発現は主に褐色または茶色でした。正常群と比較してONFH群でWnt-11タンパク質陽性率が上昇（P<0.05）。アゴミア-NC群とsiRNA-NC群と比較して、アゴミア-miR-410群とWnt-11-siRNA群でWnt-11陽性率低下（両方P<0.05）。アゴミア-miR-410+OE-NC群と比較してアゴミア-miR-410+OE-Wnt-11群でWnt-11陽性率上昇（P<0.05）（図8f, g）。

考察

ONFHは血液供給不全と凝固・線溶系障害により引き起こされる骨破壊疾患であり、最終的には大腿骨頭崩壊を招きます[19]。先行研究では、ホルモン誘導ONFHマウスの骨髄間葉系幹細胞におけるmiRNA発現[20]、ステロイド誘導ONFHにおける骨髄由来間葉系幹細胞の骨形成関連miRNA発現プロファイル[21]が報告されています。また、Li-nHA/GM/rhEPOステントがWntとHIF-1/VEGF経路を上昇させ骨形成と血管新生を促進し、糖尿病ステロイド誘導ONFH修復に有益であることも示されています[22]。これらの事実に基づき、本研究はmiR-410がWnt-11を標的としてONFH予防に及ぼす効果を探索することを目的としました。

本研究は、ONFH組織においてmiR-410、ALP、BGLAP、Collα1が低下し、Wnt-11、ACP5、CTSK、MMP9が上昇することを実証しました。最近の研究では、骨肉腫におけるmiR-410発現低下と抗腫瘍効果[23]、ヒトエストロゲン受容体陽性乳がん組織でのmiR-410発現低下[24]が報告されています。分泌因子Wnt-11発現は大腸がんを含む複数のがん種で上昇し、がん細胞の遊走と浸潤を促進します[25]。同様に、ホルモン非依存性前立腺がんでWnt-11発現上昇が証明されています[26]。ALPは疾患の状態診断と臨床予後の有用な指標です[27]。OCN（BGLAP）は骨基質石灰化に関連する広く保存された分子です[28]。ACP5は破骨細胞分化と骨吸収に必要で、接着キナーゼリン酸化を調節し細胞運動を促進します[29]。CTSKはオステオポンチン、I型コラーゲン、その他骨基質タンパク質を分解する重要なプロテアーゼです[30]。MMPsは細胞外マトリックスと基底膜の大部分を分解・修飾し、がん浸潤と転移に大きな影響を与えます[31]。また本研究ではWnt-11がmiR-410の標的遺伝子であることを明らかにしました。同様にZhangらはmiR-410がWnt3a 3'-UTRの推定結合部位を標的としてWntシグナル経路を調節することを発見しています[32]。

さらに、miR-410上昇とWnt-11低下がONFHラットのBMDとBV/TVを上昇させることが明らかになりました。先行研究では、非外傷性ONFH患者で脊柱BMD低下と尿中DPD/Cr比上昇[33]、ONFH群で大腿骨頭と腰椎BMDが対照群より低下[34]が報告されています。また、ムスクオンが壊死大腿骨頭のBMDとBV/TV比を回復させ、組織学的検査でアルコール誘導ONFHに対するムスクオンの保護効果が確認されています[35]。本研究データから、高発現miR-410と低発現Wnt-11が骨細胞アポトーシスを抑制することが明らかになりました。miR-410サイレンシングが酸化LDL誘導ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖誘導とアポトーシス減少を示す研究[36]、低下したmiR-410発現と上昇したSOCS3発現が抗アポトーシス因子Bcl-2を減少させ細胞アポトーシスを促進する報告[37]があります。また、アンドロゲン欠乏LNCaP細胞ではWnt-11低下が神経内分泌様分化を防止し前立腺がん細胞アポトーシスを誘導します[26]。本研究ではWnt-11低下とmiR-410上昇がALP、BGLAP、Collα1発現を増強し、ACP5、CTSK、MMP9発現を減少させることも示しました。Wnt-11発現上昇が子宮頸がん細胞でJNK-1活性化とリン酸化をもたらしWnt/Jnk経路を活性化し腫瘍細胞増殖と遊走/浸潤を促進する研究[15]、Wnt-11遺伝子サイレンシングが大腸がん細胞株の浸潤能を低下させる報告[25]があります。さらに、miR-410過剰発現がTRIM44を直接標的として骨肉腫細胞の浸潤、遊走、増殖、上皮間葉転換を抑制すること[23]、miR-410上昇がキモ癌移植マウスモデルでアポトーシス誘導により腫瘍増殖を抑制すること[38]も報告されています。

結論

まとめると、本研究はONFHにおいてmiR-410が低発現、Wnt-11が高発現であり、miR-410上昇またはWnt-11低下が骨芽細胞を増加させ破骨細胞を減少させONFHを緩和することを明らかにしました。しかし、miR-410とWnt-11のONFH治療効果を検証するため、さらなる臨床研究が必要です。

略語

ALP:

アルカリホスファターゼ

ANOVA:

分散分析

BMD:

骨ミネラル密度

EDTA:

エチレンジアミン四酢酸

ELISA:

酵素免疫測定法

GAPDH:

グリセラールデヒドリン酸脱水素酵素

GE:

ゼネラル・エレクトリック

HE:

ヘマトキシリン・エオシン

LSD-t:

最小有意差t検定

miR-410:

マイクロRNA-410

miRNAs:

マイクロRNA

NC:

ネガティブコントロール

OD:

光学密度

ONFH:

大腿骨頭壊死

PBS:

リン酸緩衝生理食塩水

ROI:

関心領域

RT-qPCR:

逆転写定量PCR

SD:

スプラーグ・ドーレー

SDS:

ドデシル硫酸ナトリウム

THR:

人工股関節全置換術

TRAP:

酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ

TUNEL:

末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング