金ナノロッドコア/銀シェルナノ構造の遺伝毒性におけるROSと細胞周期停止の調査

概要

銀ナノ粒子（AgNPs）と銀イオンによる肝臓での遺伝毒性誘導を理解するため、設計された金ナノロッドコア/銀シェルナノ構造（Au@Ag NR）と人間化肝細胞HepaRG細胞を用いました。コメットアッセイ、γ-H2AXアッセイ、ミクロン核試験により、0.4-20µg mL⁻¹ Au@Ag NRによるDNAと染色体損傷における酸化ストレスと細胞周期停止の関与を調査しました。さらに、Au@Ag NRの分布を解析しました。結果は、Ag⁺とAu@Ag NRの両方がHepaRG細胞でDNA切断と染色体損傷（切断性）を引き起こし、核内に残留したAu@Ag NRがさらにAg⁺を放出し、損傷を悪化させる可能性があることを示しました。これらの損傷は主に細胞周期停止とROS生成によって引き起こされます。結果は、細胞内蓄積、Ag⁺イオン放出、AgNPsの潜在的遺伝毒性の相関を明らかにしています。

はじめに

1-100nmサイズの銀ナノ粒子（AgNPs）は、病原体に浸透し、その代謝酵素の内部スルフヒドリル基を不活性化することで、広範な抗菌特性を示すことができます[1]。それらは大腸菌、淋菌、クラミジア・トラコマチスで強力な静菌作用と殺菌作用を示し、医療コーティング、家庭用製品[2]、創傷被覆材[3]として広く使用されています。説得力のある証拠は、ナノ粒子が核に侵入し、DNAの合成と転写プロセスに干渉できることを示しています[4]。以前の研究では、5mg/kgのAgNPs単回静脈投与がスプラグ・ドーリー系ラットの骨髄細胞で顕著な染色体切断を引き起こすことを報告しました[5]。10mg/kg以上のAgNPs単回腹腔内投与は、DNAと染色体損傷の両方を誘導しました[6]。Flowerら[7]は、50および100μg mL⁻¹のAgNPsが投与後5分以内にDNA損傷を引き起こす可能性があることを示唆し、急速に放出される銀（Ag）の遺伝毒性を強調しました。過剰曝露のリスクを考慮し、ナノ遺伝毒性学、すなわち設計ナノ材料のDNA損傷と発がん可能性の調査が多くの注目を集めています[8]。

AgNP誘導遺伝的損傷の主要メカニズムは、反応性酸素種の過剰生成、炎症、細胞周期障害と考えられています[9, 10]。以前の研究で示唆されているように、AgNPsは酸化的損傷を介してDNAと直接相互作用するか[11]、DNAレベルでの間期と染色体レベルでの有糸分裂に干渉するか、または核タンパク質と有糸分裂紡錘体装置と相互作用して細胞周期チェックポイントを攪乱する可能性があります[12]。しかし、AgNPsによる遺伝毒性がナノ粒子に部分的に起因するのか[13, 14]、完全に放出されたAg⁺イオンに起因するのかは不明です[15, 16]。

AgNPsの遺伝毒性調査は、組織内での銀の不安定で断続的な放出により、AgNPsの局在化とナノコアとAgの区別が困難であるため難しいです。我々のグループは最近、ナノ粒子による毒性研究のために金ナノロッドコア/銀シェル（Au@Ag NR）ナノ構造を開発しました[17]。Au@Ag NRの金コアは組織内で生理的に固有であり、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）で測定されるAg/Au比の変化を監視することで、ロッドからのAg⁺イオン放出を監視する内部標準として使用できます[18]。この方法により、毒性の異なる起源を特定できます。以前の研究では、Au@Ag NRシェルから放出されるAg⁺イオンが腎臓酸化損傷を引き起こし、最終的に糸球体の濾過機能の形態変化と障害をもたらすことが示されています[19]。Jiangら[20]は、Au@Ag NRによる粒子固有活性と細胞内銀イオン放出の両方が顆粒膜細胞の毒性応答に寄与することを示唆しました。また、Au@Ag NRをモデルとして用いてAgNPsの生体内遺伝毒性可能性を研究し、Agシェルと放出されたAg⁺イオンの両方によって誘導される遺伝毒性の主要形態は切断性であり、変異原性ではないことを実証しました。また、それらの毒性パターンに差はありませんでした[21]。

肝臓はAgNPs蓄積しやすい主要臓器の1つであり、AgNP誘導遺伝毒性の標的臓器/組織と認識されています。以前の研究では、Au@Ag NR単回静脈投与から8週間後、SDラットの肝臓に銀（8.26±3.90μg/g）と金（80.07±64.72μg/g）が一部残留することを示しました[21]。本研究では、Au@Ag NRを用いてヒト肝腫瘍由来HepaRG細胞におけるAgNP誘導染色体およびDNA損傷における細胞周期停止と反応性酸化ストレスの役割を特定しようとしました。遺伝毒性アッセイ（コメットアッセイ、γ-H2AXアッセイ、ミクロン核試験）を酸化ラジカルスカベンジャーと並行して実施し、DNA/染色体損傷における反応性酸素種（ROS）の寄与を探りました。また、細胞アポトーシス、細胞周期、関連タンパク質を測定し、AgNPsがDNA合成と複製をどのように阻害するかのメカニズムを探りました。さらに、ICP-MSと透過電子顕微鏡（TEM）を組み合わせてAu@Ag NRの細胞内蓄積と分布を調査し、ナノ粒子と放出Agイオンの役割を区別しました。

材料と方法

細胞培養と処理

ヒト肝腫瘍細胞株HepaRG（Thermo Fisher Scientific）を本研究で使用しました。細胞は、10%胎児牛血清（FBS、オーストラリア産、Gibco）と1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン溶液（Gibco）を含むRPMI 1640で、5% CO₂、37°Cの湿潤雰囲気で培養しました。細胞は、細胞生存率アッセイで推定されたIC₅₀に従って決定された濃度で、24時間または72時間、増加する濃度のAu@Ag NRで処理されました。ROSの役割を遺伝毒性で調査するため、1mM N-アセチル-L-システイン（NAC、Sigma-Aldrich）をAu@Ag NR処理の1時間前に適用しました。

ATP細胞増殖/生存率アッセイ

細胞を96ウェルプレートに5×10³/wellの密度で播種しました。24時間培養後、培地を除去し、細胞を24時間または48時間、それぞれ異なる濃度のAu@Ag NRに曝露させました。広範囲の濃度を調製し、1処理期間あたり4ウェルずつ実施しました。Au@Ag NRの細胞毒性は、アデノシン三リン酸（ATP）アッセイ（CellTiter-Glo® 2.0 Assay、Promega）で検討しました。これは、生存細胞の重要な代謝パラメータであるATP量を定量化することで細胞代謝活性を測定します。生存細胞量を反映する発光信号は、VICTORマルチラベルプレートリーダー（2030-0050、PerkinElmer）で検出し、IC₅₀値はGraphPad Prism 7（GraphPad Prism 7、CA、USA）で半最大生存率となるAu@Ag NR濃度として推定しました。生存率は以下の式で計算しました：

$${\text{Viability}}\,{\text{Ratio}}\,\left( \% \right) = {\text{RLU}}_{{{\text{sample}}}} /{\text{RLU}}_{{{\text{vehicle}}}} \times {1}00\%$$

ここでRLUは4ウェルの平均値として表される相対光単位、RLU_vehicleはナノロッド非処理細胞、RLU_sampleは異なる濃度のAu@Ag NRで処理された細胞を表します。

細胞内銀と金の濃度測定

細胞サンプルをマイクロ波消化システムで硝酸消化しました。消化後、サンプルを1%硝酸と塩酸の混合物で調製しました。溶液中のAgとAu量をICP-MS（NexION300X、PerkinElmer）で測定しました。TEM分析で細胞内Au NRとAu@Ag NRの存在を確認しました。細胞サンプルを2.5%グルタルアルデヒドと2%パラホルムアルデヒド混合物で4°Cで2時間固定しました。細胞ペレットを固定し、リン酸緩衝液（pH 7.4）で3回洗浄し、1%四酸化オスミウムで4°Cで2時間後固定しました。その後、蒸留水で3回洗浄し、エタノール（50%、70%、90%、100%）で順次15分ずつ脱水しました。その後、プロピレンオキシドを1:1と1:3希釈で20-26°Cで2時間レジンに適用しました。重合は、35°Cで16時間、45°Cで8時間、55°Cで14時間、65°Cで48時間の段階的加熱で実施しました。超薄切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で25分染色し、透過電子顕微鏡（H-7650、HITACHI、日本）で分析しました。

従来型および修正コメットアッセイ

細胞を12ウェルプレートに、24時間または72時間処理用にそれぞれ2×10⁵/wellまたは3×10⁵/wellの密度で播種しました。過酸化水素（H₂O₂）を200μmol濃度で細胞に曝露し、1時間陽性対照としました。各サンプルについて、従来型処理とホルミドピリミジン糖基化酵素（Fpg）処理用にそれぞれ2ウェルずつ準備しました。従来型コメットアッセイはアルカリ条件（pH > 13）で以前の記述[21]通りに実施しました。Fpg処理ウェルでは、DNA解旋手順前に追加のFpg処理を適用し、スライドを酵素バッファー（0.1M KCl、0.5mM EDTA、40mM HEPES、0.2mg mL⁻¹ BSA）に3回5分ずつ浸漬しました。Fpg（New England Biolabs、Inc.、UK）を酵素バッファーで1:50,000に希釈しました。希釈酵素100ミリリットルを顕微鏡スライド上の各ゲルに添加し、37°Cの湿潤チャンバーで30分インキュベートしました。残りの手順は従来型処理と同じです。コメットアッセイは三重で実施しました。少なくともサンプルあたり50細胞をNikon Eclipse 80i蛍光顕微鏡（Nikon、東京、日本）で独立してスコアリングし、Komet 6.0（Andor Technology、ベルファスト、UK）で各サンプルのテイルDNA割合中間値とオリーブテイルモーメント（OTM）を分析しました。

フローサイトメトリーとハイスループットスクリーニングによるγ-H2AXフォーカスの定量

フローサイトメトリーによる定量では、24時間または72時間処理用にそれぞれ2×10⁵/wellまたは3×10⁵/wellの密度で12ウェルプレートに細胞を播種しました。ハイスループットスクリーニングアッセイでは、24時間または72時間処理用にそれぞれ6×10³/wellまたは1×10⁴/wellの密度で96ウェルプレートに播種しました。陽性対照として、2μMメチルメタンスルホネート（MMS、Sigma-Aldrich）を細胞と並行して1時間適用しました。細胞をTBS（トリス緩衝生理食塩水）で洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで室温で15分固定しました。TBSで洗浄後、細胞を氷冷メタノール50μLで-20°Cで30分インキュベートしました。さらにTBSで3回洗浄し、ブロッキング試薬（0.3% Triton X-100と10%ヤギ血清含有TBS）を1時間適用しました。一次抗体（マウス抗ホスホ-H2AX Ser139、Millipore）をブロッキング試薬で1:200に希釈し、4°Cで一晩細胞とインキュベートしました。プレートを再度TBSで3回洗浄し、二次抗体（Alexa Fluor 488ヤギ抗マウス、Life Technologies）をブロッキング試薬で1:20比で希釈して添加しました。サンプルを室温で暗所1時間保管し、2μg mL⁻¹（20μL/well）DAPI（Invitrogen）を各ウェルに添加しました。蛍光をフローサイトメトリー（FACSCalibur、BD Bioscience、NJ、USA）またはハイスループット分析システム（Operetta CLS、PerkinElmer）で測定しました。フローサイトメトリーアッセイでは、グループあたり少なくとも10,000細胞のデータを分析し、実験を三重で実施しました。ハイスループット分析では、ウェルあたり20視野とグループあたり少なくとも5ウェルを分析しました。

サイトカイネシスブロックミクロン核サイトーム（CBMN-cyt）アッセイ

CBMN-cytはFenechら[22]の手順に従って実施しました。細胞を24時間または72時間処理用にそれぞれ2×10⁵/wellまたは3×10⁵/wellの密度で12ウェルプレートに播種しました。0.2μg mL⁻¹ミトマイシンC（MMC、東京化成工業株式会社、日本）を陽性対照として細胞に24時間曝露しました。24時間または72時間処理後に3μg mL⁻¹シトカラシンBを適用してサイトカイネシスプロセスをブロックし、40時間後に細胞を回収しました。サンプルを、予温した0.075mol L⁻¹KClでの低張性処理とメタノールと酢酸の3:1混合物での固定後、5%ギムザ染色しました。グループあたり三重ウェルを準備し、ウェルあたり少なくとも1000双核細胞を検査しました。

MDA、総GSH、SOD含量の測定

細胞を24時間または72時間処理用にそれぞれ5×10⁵/wellまたは3×10⁵/wellの密度で12ウェルプレートで培養しました。その後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄しました。細胞ホモジネート中のマロンジアルデヒド（MDA）量をチオバルビツール酸法（南京建成生物工程研究所、南京、中国）で測定しました。総グルタチオン（GSH）とスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）量をそれぞれ総グルタチオン定量キットとSODアッセイキット（同仁化学株式会社、熊本、日本）で測定しました。各ウェルの光学密度（O.D.）をVICTORマルチラベルプレートリーダー（2030-0050、PerkinElmer）で測定しました。

細胞周期のフローサイトメトリー分析

細胞を24時間または72時間処理用にそれぞれ1×10⁶/wellまたは5×10⁵/wellの密度で6ウェルプレートで培養し、その後70%エタノールで4°Cで一晩固定しました。サンプルをPBSで3回洗浄し、PI/Rnase染色バッファー（BD Biosciences）で室温で15分染色しました。20,000細胞中のG0/G1、S、G2/M期細胞集団をFL2面積対FL2幅の領域を用いて決定しました。分析はフローサイトメトリー（FACSCalibur、BD Bioscience、NJ、USA）とFlowJo（BD Bioscience）で実施し、実験を三重で行いました。

細胞アポトーシスのフローサイトメトリー分析

細胞を24時間または72時間処理用にそれぞれ1×10⁶/wellまたは5×10⁵/wellの密度で6ウェルプレートで培養しました。その後、PBSで2回洗浄し、500μL 1×結合バッファー（FITC Annexin Vアポトーシス検出キットI、BD Bioscience）で懸濁液を約1×10⁶細胞/mLに調整し、さらに100μL希釈液を5µL FITC Annexin Vと5µL PIと混合しました。サンプルを室温で15分染色し、少なくとも10,000細胞を分析してFL1H対FL2Hの領域を用いて初期および後期アポトーシス細胞集団を決定しました。フローサイトメトリー（FACSCalibur、BD Bioscience、NJ、USA）とFlowJo（BD Bioscience）を使用し、実験を三重で実施しました。

ウェスタンブロット分析

細胞を24時間および72時間処理用にそれぞれ1×10⁷/wellと6×10⁶/wellの密度で75cm²フラスクで培養しました。細胞をプロテアーゼ阻害剤（PMSF）含有RIPA溶解バッファーで溶解し、タンパク質濃度をBCAタンパク質定量キット（Beyotime Biotechnology、中国）で測定しました。サンプル濃度をRIPA溶解バッファーで調整し、95°Cで3分加熱変性しました。タンパク質サンプルを12% SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動分離し、ニトロセルロース膜（Millipore）に転写しました。膜を5%脱脂乳で30分ブロッキングし、一次抗体p53（SC-137174、Santa Cruz）、p21（SC-6246、Santa Cruz）、β-アクチン（sc-47778、Santa Cruz）と二次抗体ゴート抗マウスIgG（H+L）-HRP（SE131、solabio）でそれぞれインキュベートしました。サンプル中の標的タンパク質発現レベルを増強化学発光（ECL）法で可視化し、ImageJシステム（国立衛生研究所）で分析しました。

統計解析

データを平均±SEMで表示しました。陰性対照と処理群間の差の統計的有意性を検定するために一元配置分散分析（ANOVA）を使用し、Dunnett多重比較検定（SPSSバージョン22、IBM、Armonk、NY、USA）を実施し、P < 0.05で統計的有意とみなしました。図はGraphPad Prism 7 for Windows（GraphPad Software、La Jolla、CA、USA）で作成しました。

結果

Au NRとAu@Ag NRの特性評価

金ナノロッド（Au NRs）、金ナノロッドコア/銀シェルナノ構造（Au@Ag NR）は、以前の記述[21]通りに設計、調製、特性評価されました。簡潔に言うと、平均直径と長さはAu NRsで15.0±2.5nm、66.7±2.5nm、Au@Ag NRsで26.2±3.0nm、72.7±8.9nmです。Agシェル厚は約5nmです。水中分散したPDDACコートAu NRsとAu@Ag NRsのゼータ電位はそれぞれ37.7±1.6mVと52.5±1.4mVでした。調製Au@Ag NRのAg/Au重量比は2.3と推定されました。特性評価結果を図1に示します。

細胞生存率

Au@Ag NRのHepaRG細胞に対する細胞毒性をATP生存率アッセイで調査しました（表1）。細胞を0.125-160μg mL⁻¹の濃度で24時間または48時間Au@Ag NRに曝露しました。Au@Ag NRは24時間と48時間曝露後、時間と用量依存的に有意な細胞毒性効果を誘導し、GraphPad Prism 7.0ソフトウェアでフィッティングした%生存率IC₅₀はそれぞれ20µg mL⁻¹と6µg mL⁻¹でした。全体的な細胞毒性を考慮し、処理期間を24時間と72時間に調整し、適用濃度を0.8µg mL⁻¹、4µg mL⁻¹、20µg mL⁻¹と決定しました。さらに、Au NRを不活性対照として含め、Au NR群のAu含有量を20µg mL⁻¹ Au@Ag NRと同じ16µg mL⁻¹としました。対照的に、1mM NAC前処理をAu@Ag NR + NAC群で酸化ストレス応答の対照として採用しました（Au@Ag NR濃度は20µg mL⁻¹）。

Au NRとAu@Ag NRの細胞内分布

HepaRG細胞内のAuとAg含有量をICP-MSで分析しました。表2と3に示すように、Ag含有量は用量依存的に増加しました。しかし、抗酸化剤N-アセチル-L-システイン（NAC）はフリーラジカルスカベンジャーとしてナノ粒子の細胞取り込みを制限する可能性があり、同じ濃度のAu@Ag NR（20µg mL⁻¹）を適用してもAg含有量が少なく観測されました。24時間から72時間へのAg/Au比の低下は、Au@Ag NRシェルからのAg⁺の持続的放出を示しています。また、Agの細胞取り込みはAuよりはるかに多いです（表4）。さらに、TEMデータは、ほとんどのAu NRとAu@Ag NRが凝集体として細胞内に残留することを示しました。ナノロッド構造は、Au NRまたはAu@Ag NR曝露を受けた細胞内で明確に観察され、核には侵入していません（図2）。

DNA損傷

Au@Ag NRによるDNA損傷をコメットアッセイとγH2AXアッセイで評価しました（図3）。コメットアッセイから、0.8-20µg mL⁻¹ Au@Ag NRが有意なDNA損傷を導入することが観測されました。Au@Ag NRへの24時間または72時間曝露後、細胞の%テイルDNAとOTMは時間と濃度依存的に増加しました。さらに、Fpg酵素修飾コメットアッセイにより、20µg mL⁻¹ Au@Ag NR処理細胞で酸化ストレス誘導に関連するDNA損傷が観測されました（図3a、b）。二本鎖切断の程度を評価するため、これは癌発生との相関が高いため、γ-H2AX陽性細胞とγ-H2AX陽性細胞の平均蛍光強度の両方を分析しました。Au@Ag NRへの24時間曝露後、γ-H2AX陽性細胞では群間に差は見られませんでした。しかし、4µg mL⁻¹ Au@Ag NR群は72時間処理後に有意な増加を示しました。72時間後、すべてのAu@Ag NR群で車両対照と比較して蛍光強度の有意な増加が観測されました（図3c-e、P < 0.05）。

染色体損傷

ミクロン核形成は、DNA切断よりも遺伝物質へのより深刻な損傷である染色体損傷を特定する重要なバイオマーカーです。双核細胞におけるミクロン核含有比をスコアリングしました（図4c）。Au@Ag NRは濃度依存的にミクロン核形成を増加させました。24時間曝露後、4µg mL⁻¹ Au@Ag NRと20µg mL⁻¹ Au@Ag NR処理細胞で観測されたミクロン核比はそれぞれ1.133±0.145%と1.567±0.318%で、両方とも車両対照群より有意に高かったです。72時間曝露後、4µg mL⁻¹ Au@Ag NR処理細胞のミクロン核比は1.767±0.233%で車両対照群より有意に高く、20µg mL⁻¹ Au@Ag NR処理細胞では2.167±0.252%で車両対照群と16µg mL⁻¹ Au NR群（0.700±0.153%）の両方より有意に高かったです。対照的に、20µg mL⁻¹ Au@Ag NR + NAC処理細胞と車両対照群間に差は見られず、Au@Ag NR誘導染色体切断へのROS参加を示唆しています。

Au@Ag NRによるROS形成への影響

Au@Ag NR誘導DNAおよび染色体損傷におけるROS形成の役割をさらに探るため、MDA、GSH、SODレベルを推定しました。20µg mL⁻¹ Au@Ag NR曝露後、24時間と72時間の両方でMDA形成の有意な増加（P < 0.05）が観測されました（図5a）。さらに、Au@Ag NR曝露細胞のGSHとSODレベルは、時間と濃度依存的に有意な減少（P < 0.05）を示しました。これらの結果は、Au@Ag NR曝露によって生成される酸化と抗酸化の不均衡を示唆しています（図5b、c）。

Au@Ag NRによる細胞周期とアポトーシスへの影響

Au@Ag NRへの72時間曝露後、4µg mL⁻¹ Au@Ag NR、20µg mL⁻¹ Au@Ag NR、Au@Ag NR + NAC群でG2/M期細胞数の増加が観測され、割合はそれぞれ32.63%±1.77%、32.267%±2.17%、32.967%±4.25%で、車両対照群（22.37%±0.92%）より有意に大きかったです（図6a、b）。同時に、Au@Ag NR誘導細胞アポトーシスは72時間曝露後に観測され、20µg mL⁻¹ Au@Ag NRと20µg mL⁻¹ Au@Ag NR + NAC処理細胞の後期アポトーシス率はそれぞれ78.90±1.19%と70.20±4.50%でした（図6c、d）。Au@Ag NRは初期アポトーシスより後期アポトーシスを多く誘導し、NAC処理はAu@Ag NR誘導後期アポトーシス率を緩和できました。

p21とp53発現レベルをウェスタンブロットで検出し、類似パターンが観測されました。4µg mL⁻¹と20µg mL⁻¹ Au@Ag NR処理細胞のp53とp21発現レベルは著しく増加（P < 0.05）し、20µg mL⁻¹ Au@Ag NRとNAC併用処理細胞では有意に減少しました（P < 0.05、20µg mL⁻¹ Au@Ag NR群と比較、図6e-h）。p53タンパク質はDNA損傷応答でG2/Mチェックポイント活性化を媒介する核心分子であり、p21はp53依存性細胞周期阻害因子として知られています。したがって、Au@Ag NRはDNA複製を妨害し、細胞周期停止によりDNA修復を阻害する可能性があります。

考察

現在、放出されたAg⁺とAgNPsの遺伝毒性生成における役割は明確ではありません。我々のグループの以前の研究[21]と他の研究[13]は、Ag⁺が毒性導入の主要源である一方で、ナノ粒子も高毒性である可能性を示しています。例えば、AgNPsはヒドロキシルラジカル形成誘導により遺伝毒性に寄与する可能性があります[13]。さらに、Ag⁺単独と比較して、AgNPによりより深刻な染色体損傷、酸化ストレス、アポトーシスが導入され、異なる経路が関与する可能性を示唆しています[23]。我々はAu@Ag NRをモデル材料として用い、細胞内でのAgNPsの形態と分布を理解し、ICP-MSで細胞内AgとAu量を測定しました。調製Au@Ag NRのAg/Au重量比は2.3と推定されました。しかし、24時間曝露後、Au@Ag NR処理細胞でこれが急激に16.5に増加し、その期間内にAu@Ag NRシェルから大量のAgが放出されたことを示唆します。Au@Ag NR曝露期間を72時間に延長すると、Au/Ag重量比が1.7に低下し、Ag⁺が細胞外に放出され、その時期にはナノロッドが細胞内でのAu@Ag NR主要形態であることを示しています。したがって、Au@Ag NRが細胞に入ると、Ag⁺が24時間以内にシェルから急速に溶出し、徐々に細胞外環境に放出される一方、Au@Ag NR自体はより長期間細胞内に残留すると推測できます。

酸化ストレスは、ナノ粒子の最も重要な毒性学的メカニズムの1つと見なされています[24]。N-アセチルシステイン（NAC）はチオールであり、粘液溶解剤およびL-システイン前駆体としてグルタチオンを還元します。NACはまた、細胞内スルフヒドリル基の供給源であり、OH^·とH₂O₂と相互作用することでROSスカベンジャー活性を発揮します[25]。本研究では、Au@Ag NR曝露後にGSHとSODレベルが有意に減少し、MDAレベルが濃度と時間依存的に増加し、Au@Ag NRが細胞内で酸化ストレスを導入することを示しています。

AgとAu@Ag NRの遺伝物質への干渉可能性を、一連の遺伝毒性アッセイでさらに調査しました。注目すべきは、Au@Ag NRとNACの共培養がROS形成を改善し、これがAu@Ag NR誘導遺伝毒性への酸化ストレス参加を支持することです。本研究では、コメットアッセイとγ-H2AXアッセイを実施し、Au@Ag NRがDNAと相互作用しDNA損傷を誘導することを確認し、コメットアッセイに修復エンドヌクレアーゼFpgを含めて酸化DNA損傷を特定しました[26]。Fpgは酸化ピリミジンを認識し、8-ヒドログアニンなどの酸化プリンを除去し、アプルインまたはアピリミジン部位を作成してDNA鎖にギャップを導入します。追加FpgによるコメットアッセイでさらにDNA切断が検出されることは、Au@Ag NRがDNA損傷を引き起こす可能性を示唆しています。Meiら[28]は、5nmサイズAgNPsがコメットアッセイでhOGG1、EndoIII、Fpgエンドヌクレアーゼを用いて酸化病変特異的DNA損傷を誘導することを観測しました。Liら[29]も、PVPコートとシリカコートAgNPs（それぞれ15-100nmと10-80nm）が、hOGG1とEndoIII存在下でマウス肝細胞でのDNA切断有意増加を引き起こすことを示唆しました。γ-H2AXフォーカス形成は、遺伝毒性ストレスへの初期細胞応答を表し、DSB検出の最も感度と特異性が高いバイオマーカーです[30]。本研究で実証されたように、Au@Ag NR曝露細胞のγ-H2AXフォーカスは24時間後に著しく増加し、72時間後にさらなる増加が観測されました。20µg mL⁻¹群での減少は、高濃度でのHepaRG細胞への細胞毒性による可能性があります。異なるコーティングAgNPsで類似結果が観測されています[31, 32]。さらに、本結果はAu@Ag NRがHepaRG細胞で染色体損傷を誘導する可能性を示唆しています。ミクロン核率が有意に増加したためです。これは、HaCaTとTK6細胞でAgNP誘導ミクロン核率増加が報告された以前の研究と一致します[33]。対照的に、酸化ラジカルスカベンジャーNAC添加がAu@Ag NR誘導ミクロン核形成を抑制できました。総じて、これらのデータは酸化ストレスがAgNP導入切断性リスクにin vitroで参加することを示唆しています。

以前の研究では、AgNPs誘導細胞周期停止と細胞毒性が調査されています[33,34,35]。曝露時間延長により、AgNPsの細胞周期とアポトーシスへの影響が増強され、細胞毒性と遺伝毒性を悪化させる可能性があります。通常、細胞周期チェックポイント（例：G2/M）は、DNA損傷経験時に細胞によって開始され、このメカニズムは細胞が有糸分裂（M期）に入るのを防ぎます。G2/M細胞周期停止は、DNA修復のためにG2期で阻害される細胞割合増加を示します。DNA修復に成功した細胞はさらに有糸分裂に進みますが、致死的損傷を持つ細胞では不可逆的G2/M細胞周期停止と細胞アポトーシスが起こります[36]。Au@Ag NRが大多数のHepaRG細胞をG2/M期で停止させ、後期細胞アポトーシスを誘導し、細胞周期調節に関連する重要タンパク質であるp53とp21発現レベルを増加させることを観測しました[37]。p53はDNAが適切に修復できないときにアポトーシスを誘導することもできます[38]。p21は、DNA複製と細胞周期調節の核タンパク質ICBP90をダウンレギュレートすることで、p53依存性経路で細胞周期停止を介して間接的にアポトーシスに参加する可能性があります[39]。さらに、p53/p21システム活性化によるアポトーシスとG2/M停止が、ニンニク抽出物投与後のHepG2細胞で報告されています[40]。したがって、酸化ストレス誘発DNA/染色体損傷がp53とp21発現を促進し、これが細胞周期停止を誘導すると推測できます。Au@Ag NRのDNA/染色体への曝露期間延長は、複製中に遺伝毒性またはアポトーシスをさらに悪化させる可能性があります。

結論

AgNPsによる遺伝毒性は、ナノ粒子による酸化ストレスと放出イオンの両方に起因する可能性があります[41]。本研究では、Au@Ag NRをモデルとして用い、ナノ粒子が細胞内に入った後のAgの分布と放出挙動を決定しました。Au@Ag NRの細胞内での異なる形態を考慮すると、曝露後Ag⁺が銀シェルから急速に溶出しました。Ag⁺とAu@Ag NRは細胞で細胞毒性と遺伝毒性（切断性）を導入し、核内に残留したAu@Ag NRがさらにAg⁺を放出して損傷を悪化させる可能性があります。これらは主に細胞周期停止とROS形成によって引き起こされます（図7に要約）。総じて、これらのデータは細胞内蓄積、Ag⁺放出、AgNPsの潜在的遺伝毒性の相関を明らかにしています。