M1マクロファージ由来エクソソームmiR-326がNF-κBシグナル制御により肝細胞がん進行を抑制

概要

M1マクロファージ由来エクソソームから分泌されるマイクロRNA（miR）が肝細胞がん（HCC）進行を制御するという知見が蓄積している。しかし、M1マクロファージ由来エクソソームのmiR-326がHCCに及ぼす影響は報告されていない。本研究は、M1マクロファージ由来エクソソームmiR-326がHCC細胞進行を制御するメカニズムを解明することを目的とした。RT-qPCRでHCC細胞株のmiR-326発現を検出し、トランスフェクションでmiR-326発現を変化させ、CD206とNF-κB発現、細胞増殖、コロニー形成、遊走、アポトーシス、浸潤への影響を調べた。続いて、M1マクロファージからエクソソームを単離し、RT-qPCRでmiR-326発現を確認。エクソソーム内miR-326発現をトランスフェクションで変化させ、HCC細胞と共培養して生物学的進展への影響を検証。最後に、インビボ実験でインビトロ結果を検証した。miR-326はHCC細胞で低下し、M1マクロファージ由来エクソソームで富化していた。miR-326上方制御はHCC細胞増殖、コロニー形成、遊走、浸潤、CD206とNF-κB発現を抑制し、アポトーシスを促進、インビボでHCC腫瘍増殖を抑制した。一方、下方制御は逆の効果を示した。M1マクロファージ由来エクソソームはHCC細胞増殖、コロニー形成、遊走、浸潤、CD206とNF-κB発現を抑制しアポトーシスを増強し、miR-326過剰発現はこの効果を増強した。M1マクロファージ由来エクソソームmiR-326がNF-κB発現をダウンレギュレートすることで、HCCの増殖、遊走、浸潤を抑制しアポトーシスを促進することが明らかになった。

はじめに

肝細胞がん（HCC）は世界第5位のがんであり、原発性肝がんとして最も一般的である[1]。中国国家がん登録データによると、原発性肝がんの死亡率は第3位、発生率は一般的悪性腫瘍中第4位である[2]。HCCの主要リスク因子は、C型・B型肝炎ウイルス慢性感染、アフラトキシン汚染食品、肥満、喫煙、多量飲酒、2型糖尿病[3]。経動脈的化学塞栓療法（TACE）は中間期HCCの確立された治療法で、中間期または進行期HCC患者の大多数の生存を改善する[4]。現在、HCC診断は主に血清バイオマーカーと画像技術に依存する[5]。HCC関連5年生存率は約60%にとどまり、近年発生率は上昇傾向にある[6]。したがって、正確な治療標的の探索はHCC治療の優先課題である。

マクロファージは免疫系の効果細胞および主要制御因子であり、組織リモデリングと修復に大きな機能を持ち、インビボでほぼすべての組織において代謝機能を調整する[7]。M1マクロファージは腫瘍促進効果を発揮し、HCC細胞の運動性を高めることが明らかにされている[8]。エクソソームは直径40〜150nmの円盤状小胞である[9]。Xuらによると、エクソソーム由来マイクロRNA（miRNAs）は、標的細胞の遺伝子発現を調節することで、HCCの増殖、浸潤、転移、薬剤耐性に機能する[10]。miR-326含有エクソソームが多発性硬化症の潜在的臨床標的となり得ることが示されている[11]。miRNAsは、特定の配列でmRNA分解と翻訳阻害により多数のタンパク質コード遺伝子発現を調節することで、オンコジーンまたは腫瘍抑制因子として作用する[12]。miR-326が細胞周期進行の阻害とアポトーシス促進によりHCC細胞増殖を抑制し、上皮間葉転換（EMT）表現型低下により浸潤を抑制することが報告されている[13]。別の研究では、miR-326がHCC患者治療の潜在的治療標的となり得ることが報告されている[14]。したがって、本研究ではエクソソームmiR-326がHCC細胞の浸潤と遊走を制御するメカニズムについて議論した。

材料と方法

倫理的声明

すべての動物実験は、国際委員会による実験動物の飼育および使用ガイドラインに準拠した。プロトコルは吉林大学第3病院動物実験倫理委員会により承認された。

マクロファージの誘導と同定

ヒト単球性細胞株THP-1（中国科学院昆明動物研究所）を、10%熱不活性化胎仔牛血清（FBS）含有RPMI 1640培地（Gibco、Thermo Fisher Scientific）で培養した。THP-1細胞を150ng/mLホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA；Sigma-Aldrich）で処理し、RPMI培地で24時間培養してM0マクロファージを得た。ライト染色で誘導前後の細胞形態を観察。THP-1細胞と誘導マクロファージを5μL PBSに再懸濁し、ガラススライドに滴下、ライト染色液と緩衝液を1:2で混合、10分染色後流水で洗浄、顕微鏡で観察。さらに、M0マクロファージマーカー（CD68、CD206）をRT-qPCRで測定。次に、20ng/mLインターフェロン（IFN）-γ（R&D Systems）と10pg/mL LPS（Sigma-Aldrich）で18時間培養しM1マクロファージに誘導。M1マクロファージマーカー（IDO1、IL-12 p35）をRT-qPCRで検証[15]。

エクソソームの抽出

エクソソーム分離キット（ExoEasy Maxi Kit、Qiagen）でエクソソームを抽出した。無菌条件下でマクロファージ上清を15mL遠心チューブに回収し、0.8μMフィルターで濾過。各群の細胞上清にXBPバッファー（1:1）を添加し、exoEasy膜親和性遠心カラムで500g遠心。10mL XWPバッファーを添加し3000〜5000g遠心。exoEasy膜親和性遠心カラムに400μL XE溶出バッファーを添加し500g遠心。溶出バッファーを再度カラムに移し500g遠心。溶出バッファーを4℃で24時間保存後、同定に使用。残りは−80℃で保存。

TEM観察とナノ粒子トラッキング解析（NTA）

得られたエクソソームをカーボン支持膜銅メッシュに滴下し、2%ホスホタングステン酸を添加。TEMで観察し最適画像を取得・解析。PBS中の不純物と粒子を0.22μM微孔フィルターで除去。エクソソームの粒子密度に応じて濾過PBSを適切濃度に希釈し、Nanosight NS300ナノ粒子検出器（Malvern）で検出。同定後、miR-326インヒビターおよびネガティブコントロール（NC）、miR-326ミミックとmiR-326ミミックNCでトランスフェクションしたマクロファージ由来エクソソームをエクソソーム分離キット（Invitrogen）で抽出。

RT-qPCR

Trizol Reagent（Thermo Fisher）で全RNAを抽出し、SYBR-Green PCR Master Mix（Roche）とABI 7500 Real-Time PCR System（Life Technologies）でリアルタイムPCRを実施。プライマー配列は表1に示す。定量解析は2^−△△Ct法で行った。

ウェスタンブロット解析

細胞とエクソソームから全タンパク質を抽出。BCAキット（Boster Biological Technology）でタンパク質濃度を測定。サンプルバッファーを添加し95℃で沸騰、各ウェルに30μgロード。10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Boster Biological Technology）で分離し、ポリフリリデンジフルオライド膜に電気転写、5%ウシ血清アルブミン（BSA）でブロッキング。一次抗体：CD63（1:1000、Developmental Studies Hybridoma Bank）、CD181（1:1000、R&D Systems）、GAPDH（1:2000、Jackson ImmunoResearch Laboratories）、二次抗体（1:500、Jackson ImmunoResearch Laboratories、ペルオキシダーゼ標識）。Odysseyデュアルカラー赤外蛍光スキャンイメージングシステムで画像取得、Quantity One画像解析ソフトでバンド濃度を測定。

細胞培養とスクリーニング

正常肝細胞株HL-7702、ヒトHCC細胞株BEL-7404、HepG2、SMMC-7721、QGY-7703を選択し、10% FBS、ペニシリン（100U/mL）、ストレプトマイシン（100mg/mL）含有Gibco RPMI Media 1640で培養。RT-qPCRでmiR-326発現を検出し、適切な細胞株をスクリーニング。

エクソソーム標識と取り込み

エクソソームを250μL Diluent Cに再懸濁し優しくピペッティング。PKH67染料（1μL、Sigma-Aldrich）を250μL Diluent Cに加え500μLとしインキュベート。500μL 1% BSAを添加し37℃で1分インキュベート。120,000g 4℃で2時間遠心しエクソソームを回収。PKH67標識エクソソームを再度120,000g 4℃で2時間遠心回収。6mL RPMI-1640培地に再懸濁し遮光。標識エクソソームをHCC細胞と12時間共培養。培地除去後、PBSで3回、各5分洗浄し、内部取り込まれなかった蛍光標識エクソソームを除去。4%パラホルムアルデヒドで固定し、4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインダールで染色。封入後、レーザー共焦点顕微鏡で蛍光分布を観察。

細胞グループ分けと処理

HepG2細胞とSMMC-7721細胞を12ウェルプレートに0.5〜1×10⁶cells/wellで播種。50〜60%コンフルエント時にLipofectamine 2000（Invitrogen）でトランスフェクション。HepG2細胞をmiR-326ミミック群（miR-326ミミック トランスフェクション）とNCミミック群（miR-326ミミックNC トランスフェクション）に分類。SMMC-7721細胞をmiR-326インヒビター群（miR-326インヒビター トランスフェクション）とNCインヒビター群（miR-326インヒビターNC トランスフェクション）に分類。miR-326ミミック、インヒビターおよびそれらのNCをLipofectamine 2000と混合しトランスフェクション。無処理のHepG2とSMMC-7721をブランク群とした。miR-326ミミック、インヒビターおよびNCは広州RibBio Co., Ltd.（中国広州）が設計・合成（表1）。

M1マクロファージ由来エクソソームとHCC細胞の共培養

M1マクロファージ由来エクソソーム懸濁液のタンパク質濃度をBCA法で測定し、50μgタンパク質に相当するエクソソーム懸濁液量を算出。HepG2とSMMC-7721を12ウェルプレートに1×10⁵cells/mL/wellで播種。HepG2を4群に分類：コントロール群（エクソソーム非共培養）、Exo群（M1マクロファージ由来エクソソーム共培養）、Exo-miR-326ミミック群（miR-326ミミック トランスフェクション済みM1マクロファージ由来エクソソーム共培養）、Exo-NCミミック群（miR-326ミミックNC トランスフェクション済みM1マクロファージ由来エクソソーム共培養）。SMMC-7721も同様に4群：ブランク群、Exo群、Exo-miR-326インヒビター群、Exo-NCインヒビター群。

MTTアッセイ

トリプシンで細胞を剥離し、96ウェルプレートに4×10⁴cells/wellで播種。12、24、36、48、60時間培養後、培地を除去。500μL 0.5g/L MTT溶液でインキュベート、200μLジメチルスルホキシド溶液を添加しピペッティング・インキュベート。マイクロプレートリーダーで光学密度（OD、490nm）を測定。

コロニー形成アッセイ

24時間培養後トリプシンで剥離、35mmディッシュに300cells/dishで播種。培地を3日ごとに交換。10日培養後、40g/Lパラホルムアルデヒドで固定、1g/Lクリスタルバイオレットで染色乾燥。顕微鏡下でコロニー数（50細胞以上）を計測。

トランスウェルアッセイ

細胞（1×10⁵）を200μL無血清培地に懸濁。Transwellチャンバー（Corning Glass Works）の指示に従い実験（浸潤実験ではマトリゲル必要、遊走実験では不要）。下室にRPIM 1640（10% FBS、600μL）を添加。上室と下室をマトリゲルプレコート済みTranswell膜（BD Biosciences）で分離。24時間培養後、95%アルコールで固定、クリスタルバイオレット染色後、顕微鏡下5視野で細胞観察。

フローサイトメトリー

細胞周期：トリプシンで細胞剥離。細胞（1×10⁶）を0.5mL PBSに懸濁し単一懸濁液化。4.5mLプレコール70%エタノールと混合し氷上で、3000g遠心、5mL PBSで洗浄、再度3000g遠心。1mL PI/Triton X-100染色液（20μg PI/0.1% Triton X-100、0.2mg RnaseA含有）に懸濁。フローサイトメトリーで細胞周期検出。

細胞アポトーシス：トリプシン化細胞（1×10⁶）を1mL PBSに懸濁、ピペッティング、3000g遠心。インキュベーションバッファー（10mmol/L Hepes/NaOH、pH 7.4、140mmol/L NaCl、5mmol/L CaCl₂）で順次洗浄、3000g遠心。100μLマーキング液（FITC-Annexin VとPIをインキュベーションバッファーに添加し1μg/mL）でインキュベート、3000g遠心、インキュベーションバッファーで1回洗浄、蛍光（SA-FLOUS）液でインキュベート。フローサイトメトリーでアポトーシス検出。波長488nm、FITC蛍光は515nmバンドパスフィルター、PIは560nm以上で検出。結果はコンピューターで自動解析。

ヌードマウス腫瘍異種移植

マウス40匹（吉林大学動物科学学院、4〜6週齢）をランダムに8群に分け、各群5匹。SPFグレード動物実験室で1週間飼育、餌・敷材・水瓶を適時交換。毎日健康状態観察。1週間後、HCC細胞を細胞懸濁液に調製し、頸部と背部に皮下注射（0.1mL、1×10⁶cells）。3〜5日後から腫瘍増殖を観察。4日ごとにマウス体重と腫瘍体積を測定。注射後20日で安楽死処置。

統計解析

すべてのデータをSPSS 17.0ソフトウェアで解釈。測定データを平均±標準偏差で表示。2群間比較はt検定、多群比較は一元配置分散分析（ANOVA）。P値＜0.05を統計的有意差とした。

結果

M1マクロファージとエクソソームの同定

ライト染色でPMA誘導THP-1細胞の形態を観察。誘導前は細胞体積が小さく核質比が高かったが、誘導後は形態が不規則になり体積増大、核質比低下、細胞質が豊富で淡青色、多数の顆粒と少数の空胞、核は紫赤色でしばしば片寄り、マクロファージの典型的形態的特徴を示した（図1a）。

M1マクロファージとエクソソームの同定。a PMA処理前後のTHP-1細胞形態観察のためのライト染色。b RT-qPCRによるTHP-1細胞とPMA処理THP-1細胞のCD68、CD206発現。c マクロファージとM1マクロファージの形態。d RT-qPCRによるM0マクロファージとLPS/INF-γ処理M0マクロファージのIDO1、IL-12 p35発現。e エクソソーム観察のためのTEM。f NTAによるエクソソーム粒子径分布検出。g CD63、CD181タンパク質バンド。パネルb：*P＜0.05 vs THP-1細胞；パネルd：*P＜0.05 vs M0マクロファージ。測定データは平均±標準偏差（N=3）、2群間比較はt検定

マクロファージ誘導成功をさらに検証するため、誘導前後のCD68、CD206発現をRT-qPCRで測定。PMA誘導によりCD68、CD206発現が上昇し、THP-1細胞がM0マクロファージに誘導されたことを確認（図1b）。次に、LPSとINF-γでM0マクロファージをM1マクロファージに分化誘導。形態、M1マーカーIDO1、IL-12 p35発現を観察・測定。M0マクロファージは多様な不規則付着形態（円形、楕円形、紡錘形）を示した。IFN-γ刺激マクロファージはより多くの偽足と突起、紡錘形を示した（図1c）。RT-qPCRで（図1d）、LPS/INF-γ処理後、M1マクロファージでマーカー（IDO1、IL-12p35）が増加した。

続いて、マクロファージ由来エクソソームをTEMで観察。丸形または楕円形、膜構造を持ち、サイズ均一で汚染物質が少ない豊富なエクソソームが観察された（図1e）。NTAでは、MODE曲線の集中したピークと滑らかな直線により、エクソソームの直径が集中し不純物が少ないことが示された（図1f）。ウェスタンブロットでは、マクロファージ由来エクソソームで特異的マーカー蛋白CD63、CD181発現がマクロファージより高かった（図1g）。これらの結果は、単球からマクロファージへの分化誘導とM1マクロファージへの分極が成功したことを示す。

M1マクロファージ由来エクソソームがmiR-326をHCC細胞に輸送し、HCC細胞内miR-326発現に影響

M1マクロファージ由来エクソソームがmiR-326をHCC細胞に輸送するか検証するため、HepG2とSMMC-7721細胞をエクソソームと共培養。蛍光顕微鏡下で、4時間トランスフェクション後、多数のエクソソームがHepG2とSMMC-7721細胞に取り込まれたことを確認（図2a、b）。

M1マクロファージ由来エクソソームがmiR-326をHCC細胞に輸送し、miR-326発現に影響。a HepG2細胞によるM1マクロファージ由来エクソソーム取り込み。b SMMC-7721細胞による取り込み。c INF-γとLPS誘導前後のマクロファージエクソソーム中miR-326発現比較。d RT-qPCRによるHCC細胞株（BEL-7404、HepG2、SMMC-7721、QGY-7703）と正常肝細胞HL-7702のmiR-326発現。e miR-326ミミックがHepG2細胞内miR-326発現に及ぼす効果。f miR-326インヒビターがSMMC-7721細胞内miR-326発現に及ぼす効果。g miR-326ミミック トランスフェクション済みM1マクロファージ由来エクソソームがHepG2細胞内miR-326発現に及ぼす効果。h miR-326インヒビター トランスフェクション済みM1マクロファージ由来エクソソームがSMMC-7721細胞内miR-326発現に及ぼす効果。パネルc：*P＜0.05 vs M0マクロファージ；パネルd：*P＜0.05 vs HL-7702細胞；パネルe：*P＜0.05 vs NCミミック群；パネルf：*P＜0.05 vs NCインヒビター群；パネルg：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCミミック群；パネルh：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCインヒビター群。測定データは平均±標準偏差（N=3）、多群比較は一元配置分散分析

続いて、miR-326ミミック/インヒビターをマクロファージにトランスフェクションし、トランスフェクション前後のエクソソーム中miR-326発現を確認。M0マクロファージ由来エクソソームと比較し、M1マクロファージ由来エクソソームでmiR-326発現が上昇。miR-326ミミック処理M1マクロファージ由来エクソソームでさらに上昇、miR-326インヒビター処理で低下（図2c）。

次に、HCC細胞株のmiR-326発現を測定。BEL-7404、HepG2、SMMC-7721、QGY-7703細胞でHL-7702細胞と比較しmiR-326発現が低下、其中HepG2が最も低く、SMMC-7721が最も高かった（図2d）。

続いて、miR-326ミミックとインヒビターをそれぞれHepG2とSMMC-7721にトランスフェクションし、miR-326発現への影響を検証。miR-326ミミックでHepG2内miR-326上昇、miR-326インヒビターでSMMC-7721内miR-326低下（図2e、f）。

次に、miR-326ミミックおよびインヒビター トランスフェクション済みM1マクロファージ由来エクソソームを、それぞれHepG2とSMMC-7721と共培養。共培養でHCC細胞内miR-326上昇、miR-326ミミック トランスフェクション済みエクソソームでさらに上昇、miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソームで低下（図2g、h）。M1マクロファージ由来エクソソームがmiR-326をHCC細胞に輸送し、細胞内miR-326発現に影響することが示唆された。

M1マクロファージ由来エクソソームmiR-326がHCC細胞の増殖とコロニー形成能を抑制

エクソソームmiR-326のHCC細胞増殖への影響を調べるため、MTT法とコロニー形成アッセイを実施。HepG2細胞では、miR-326回復が細胞増殖とコロニー形成能を阻害（図3a、e、f）。M1マクロファージ由来エクソソームがHepG2増殖とコロニー形成を阻害。miR-326ミミック トランスフェクション済みエクソソームでさらに阻害（図3c、i、j）。

M1マクロファージエクソソームmiR-326がHCC細胞増殖とコロニー形成を抑制。a miR-326ミミック トランスフェクションがHepG2増殖に及ぼす効果（MTT）。b miR-326インヒビター トランスフェクションがSMMC-7721増殖に及ぼす効果。c miR-326ミミック トランスフェクション済みエクソソーム共培養がHepG2増殖に及ぼす効果。d miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソーム共培養がSMMC-7721増殖に及ぼす効果。e miR-326ミミック トランスフェクションがHepG2コロニー形成能に及ぼす効果。f HepG2コロニー数。g miR-326インヒビター トランスフェクションがSMMC-7721コロニー形成能に及ぼす効果。h SMMC-7721コロニー数。i miR-326ミミック トランスフェクション済みエクソソーム共培養がHepG2コロニー形成能に及ぼす効果。j エクソソーム処理HepG2コロニー数。k miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソーム共培養がSMMC-7721コロニー形成能に及ぼす効果。l エクソソーム処理SMMC-7721コロニー数。パネルa、f：*P＜0.05 vs NCミミック群；パネルb、h：*P＜0.05 vs NCインヒビター群；パネルc、j：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCミミック群；パネルd、l：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCインヒビター群。測定データは平均±標準偏差（N=3）、多群比較は一元配置分散分析

SMMC-7721細胞では、miR-326ノックダウンが細胞増殖とコロニー形成能を増強（図3b、g、h）。M1マクロファージ由来エクソソーム処理で増殖とコロニー形成能低下。miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソームでさらに増強（図3d、k、l）。M1マクロファージ由来エクソソームのmiR-326がHCC細胞増殖を阻害することが示唆される。

M1マクロファージ由来エクソソームmiR-326がHCC細胞の遊走と浸潤を抑制

エクソソームmiR-326のHCC細胞浸潤と遊走への影響を検証。HepG2細胞では、miR-326回復が浸潤と遊走を抑制（図4a〜c）。M1マクロファージ由来エクソソームがHepG2浸潤と遊走を阻害。miR-326ミミック トランスフェクション済みエクソソーム共培養でさらに阻害（図4g〜i）。

M1マクロファージエクソソームmiR-326がHCC細胞遊走と浸潤を抑制。a miR-326ミミック トランスフェクションがHepG2浸潤に及ぼす効果（トランスウェル）。b 遊走への効果。c 浸潤・遊走細胞数。d miR-326インヒビター トランスフェクションがSMMC-7721浸潤に及ぼす効果。e 遊走への効果。f 浸潤・遊走細胞数。g miR-326ミミック トランスフェクション済みエクソソーム共培養がHepG2浸潤に及ぼす効果。h 遊走への効果。i 共培養HepG2浸潤・遊走細胞数。j miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソーム共培養がSMMC-7721浸潤に及ぼす効果。k 遊走への効果。l 共培養SMMC-7721浸潤・遊走細胞数。パネルc：*P＜0.05 vs NCミミック群；パネルf：*P＜0.05 vs NCインヒビター群；パネルi：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCミミック群；パネルl：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCインヒビター群。測定データは平均±標準偏差（N=3）、多群比較は一元配置分散分析

miR-326ノックダウンでSMMC-7721浸潤と遊走が増強（図4d〜f）。M1マクロファージ由来エクソソーム処理で浸潤と遊走低下。しかし、miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソーム共培養で浸潤と遊走が増強（図4j〜l）。M1マクロファージ由来エクソソームmiR-326がHCC細胞浸潤と遊走を阻害することが示唆される。

M1マクロファージ由来エクソソームmiR-326がHCC細胞アポトーシスを促進

エクソソームmiR-326のHCC細胞周期とアポトーシスへの影響を、PI単染色とAnnexin V-FITC/PI二重染色で検証。miR-326過剰発現でHepG2細胞のG0/G1期停止細胞増加、S期とG2/M期停止細胞減少、アポトーシス増加（図5a〜d）。M1マクロファージ由来エクソソーム共培養で同様の効果、miR-326ミミック トランスフェクション済みエクソソーム共培養でさらに増強（図5i〜l）。

M1マクロファージエクソソームmiR-326がHCC細胞アポトーシスを促進。a,b miR-326ミミック トランスフェクションがHepG2細胞周期に及ぼす効果；c,d アポトーシスへの効果。e,f miR-326インヒビター トランスフェクションがSMMC-7721細胞周期に及ぼす効果；g,h アポトーシスへの効果。i,j miR-326ミミック トランスフェクション済みエクソソーム共培養がHepG2細胞周期に及ぼす効果；k,l アポトーシスへの効果。m,n miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソーム共培養がSMMC-7721細胞周期に及ぼす効果；o,p アポトーシスへの効果。パネルb、d：*P＜0.05 vs NCミミック群；パネルf、h：*P＜0.05 vs NCインヒビター群；パネルj、l：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCミミック群；パネルn、p：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCインヒビター群。測定データは平均±標準偏差（N=3）、多群比較は一元配置分散分析

SMMC-7721細胞では、miR-326ダウンレギュレーションでG0/G1期停止細胞減少、S期とG2/M期停止細胞増加、アポトーシス減少（図5e〜h）。非トランスフェクションM1マクロファージ由来エクソソームでG0/G1期停止増加、S期とG2/M期停止減少、アポトーシス増加。miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソームでG0/G1期停止減少、S期とG2/M期停止増加、アポトーシス減少（図5m〜p）。要約すると、M1マクロファージエクソソーム由来miR-326がHCCで細胞周期をG0/G1期で停止させアポトーシスを誘導する。

M1マクロファージ由来エクソソームmiR-326がHCC細胞のCD206とNF-κB発現を低下

M1マクロファージエクソソーム由来miR-326のHCC細胞生物学的進展メカニズムを探索。NF-κBは炎症とがんの鍵となるリンク。多くの制御蛋白質とmiRNAsが過剰活性化NF-κBシグナルを抑制しがんを抑制する[16]。この有益な効果にはM2マクロファージからM1マクロファイルへの分極も含まれる可能性がある。HepG2とSMMC-7721細胞のCD206とNF-κB発現をRT-qPCRで測定。miR-326回復でHepG2のCD206とNF-κB発現低下、miR-326ノックダウンでSMMC-7721のCD206とNF-κB発現上昇（図6a、b）。さらに、M1マクロファージエクソソーム共培養でHepG2のCD206とNF-κB発現有意低下、miR-326過剰発現エクソソーム共培養でさらに低下。非トランスフェクションM1マクロファージ由来エクソソーム処理でSMMC-7721のCD206とNF-κB発現低下。miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソーム共培養でSMMC-7721のCD206とNF-κB発現上昇（図6c、d）。M1マクロファージエクソソーム由来miR-326がNF-κBを阻害することでHCC細胞で腫瘍抑制作用を果たすと結論付けられた。

M1マクロファージエクソソームmiR-326がHCC細胞のCD206とNF-κB発現を低下。a miR-326ミミック トランスフェクションがHepG2のCD206、NF-κB発現に及ぼす効果。b miR-326インヒビター トランスフェクションがSMMC-7721のCD206、NF-κB発現に及ぼす効果。c miR-326ミミック トランスフェクション済みエクソソーム共培養がHepG2のCD206、NF-κB発現に及ぼす効果。d miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソーム共培養がSMMC-7721のCD206、NF-κB発現に及ぼす効果。パネルa：*P＜0.05 vs NCミミック群；パネルb：*P＜0.05 vs NCインヒビター群；パネルc：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCミミック群；パネルd：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCインヒビター群。測定データは平均±標準偏差（N=3）、多群比較は一元配置分散分析

M1マクロファージエクソソーム由来miR-326がインビボでHCC腫瘍増殖を抑制

最後に、腫瘍異種移植でインビボ結果を検証。miR-326過剰発現でHepG2移植マウスの腫瘍体積と重量減少（図7a〜c）。HepG2細胞をエクソソーム共培養したマウスでは、M1マクロファージエクソソーム処理で腫瘍体積と重量有意減少、miR-326過剰発現エクソソームでさらに減少（図7g〜i）。

M1マクロファージエクソソームmiR-326がインビボでHCC腫瘍体積と重量を減少。a〜c miR-326ミミック トランスフェクションがHepG2異種移植ヌードマウスの腫瘍体積と腫瘍に及ぼす効果。d〜f miR-326インヒビター トランスフェクションがSMMC-7721異種移植マウスの腫瘍体積と腫瘍に及ぼす効果。g〜i miR-326ミミック トランスフェクション済みエクソソーム共培養がHepG2異種移植マウスの腫瘍体積と腫瘍に及ぼす効果。j〜l miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソーム共培養がSMMC-7721異種移植マウスの腫瘍体積と腫瘍に及ぼす効果。パネルb、c：*P＜0.05 vs NCミミック群；パネルe、f：*P＜0.05 vs NCインヒビター群；パネルh、i：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCミミック群；パネルk、l：*P＜0.05 vs コントロール群、#P＜0.05 vs Exo-NCインヒビター群。測定データは平均±標準偏差（n=5）、多群比較は一元配置分散分析

SMMC-7721細胞では、miR-326抑制で腫瘍体積と重量増加（図7d〜f）。非トランスフェクションM1マクロファージ由来エクソソームでSMMC-7721腫瘍増殖抑制。miR-326インヒビター トランスフェクション済みエクソソーム共培養細胞移植で腫瘍体積と重量増加（図7j〜l）。要約すると、M1マクロファージエクソソーム由来miR-326がインビボでHCC腫瘍増殖を抑制する。

考察

HCCは高罹患率・死亡率、早期診断・治療困難、予後不良、5年生存率低いがんである[17]。最近、低発現lncRNA cox-2がM1マクロファージのHCC細胞増殖抑制、浸潤抑制、血管新生抑制、遊走抑制、アポトーシス促進能力を低下させることが報告された[18]。Huらは、miR-326がHCC組織と細胞株で明らかに低下し、ダウンレギュレートされたmiR-326がHCC患者のTNMステージ、リンパ節転移、分化と関連することを議論した[14]。HCC細胞由来エクソソームがHCC細胞増殖、浸潤、転移、薬剤耐性発達に適した環境を形成することが一般的に考えられている[19]。本研究は、エクソソームmiR-326がHCC細胞の浸潤と遊走を制御するメカニズムを探索するために設計された。

本結果は、miR-326発現がHCC細胞で低下するがエクソソームで上昇することを示した。最近の研究で、miR-326発現がHCC組織で低下することが指摘されている[20]。別の研究では、miR-326発現がHCC細胞株と組織で著しく低下し、そのダウンレギュレーションがHCCで不良予後を予測することが示された[13]。miR-326が腫瘍抑制役割を果たしHCC細胞で大きく抑制されることが報告されている[21]。これらのエビデンスは本所見と一致する。ある研究では、対照と比較し、再発寛解型多発性硬化症患者でTconv由来エクソソーム中miR-326発現が上昇することが報告されている[11]。

本データから、高発現エクソソームmiR-326がインビトロでHCC細胞増殖、コロニー形成、遊走、浸潤を抑制しアポトーシスを促進し、インビボでHCC腫瘍体積と重量を減少させることが明らかになった。以前から、miR-326過剰発現でHCC細胞増殖抑制、遊走と浸潤能著明減弱が示唆されていた[21]。上方制御miR-326が発育抑制と浸潤抑制、アポトーシス促進をインビトロで誘導することが報告されている[14]。また、先行研究でmiR-326過剰発現がインビボで腫瘍増殖抑制を検証[13]。異所性発現miR-326が非小細胞肺がん細胞株で細胞増殖著明減弱、遊走と浸潤抑制を示す[22]。さらに、miR-326がMMP-9などの線維化促進遺伝子を減少させ、がん細胞増殖における抑制機能を示唆[23]。また、miR-326がBcl-2蛋白発現抑制、Bax発現上昇によりアポトーシスに影響[24]。本所見と同様に、いくつかのmiRNAsがエクソソームと相互作用しHCC発症に関与することが示されている。高発現エクソソームmiR-638が発癌への潜在的影響を伴うHCC細胞増殖抑制を示す[25]。別の研究でも、HCC細胞由来エクソソームmiR-451aがアポトーシス、管形成、遊走、透過性など内皮機能を破綻させ腫瘍血管新生抑制を証明[26]。先行研究では、miR-744エクソソーム過剰発現処理でHCC細胞増殖が劇的に抑制されることが一般的に確認されている[27]。

結論

簡潔に結論すると、本研究はM1マクロファージ由来エクソソームmiR-326がHCC細胞の増殖、遊走、浸潤を抑制しアポトーシスを促進するエビデンスを提供し、HCCに対する新規標的治療の新たな知見を与える。サンプルサイズの限界と既知研究の限界により、miR-326の正確なメカニズムは完全には解明されておらず、さらなる大規模研究で基盤メカニズムを解明する必要がある。

略語

HCC:

肝細胞がん

miRNAs:

マイクロRNA

FBS:

胎仔牛血清

M/CSF:

マクロファージコロニー刺激因子

PBS:

リン酸緩衝生理食塩水

DMEM:

ダルベッコ変法イーグル培地

PPAR:

ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体

TEM:

透過型電子顕微鏡

NTA:

ナノ粒子トラッキング解析

NC:

ネガティブコントロール

RT-qPCR:

逆転写定量PCR

BCA:

ビシンコニン酸

BSA:

ウシ血清アルブミン

Exo:

エクソソーム

ANOVA:

一元配置分散分析